女性生殖器癌における血管新生とその臨床的意義

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Title

女性生殖器癌における血管新生とその臨床的意義( 内容の要

_{旨(Summary) )}

Author(s)

坂口, 英樹

Report No.(Doctoral

Degree)

博士（医学）甲第437号

Issue Date

2000-03-24

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/14698

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氏名(本籍) 学位の種類学位授与番号学位授与日付学位授与の要件学位論文題目審査委員坂口英樹(岐阜県) 博士(医学) 甲第 437 号平成12 年 3 月 24 日学位規則第4条第1項該当女性生殖器癌における血管新生とその臨床的意義 (主査)教授玉

舎

輝

彦

(副査)教授高見剛教授岡野幸雄論文内容の要旨血管新生とは既存の血管から新たに血管が生じる現象をいう｡そのうち生理的に起こる活動的な血管新生は, 胎生期以外では創傷治癒や子宮内隠卵胞などの一定の時期に限られ,その毛細血管内皮細胞のターンオーバは著しく速い｡一方,それ以外の臓器における血管内皮細胞のターンオーバは一般的に月や年単位でかなり遅いQ ところで,腫瘍における血管内皮細胞のターンオーバは腫瘍径が2mm以上になると著しく速くなり,血管新生が活性化され,腫瘍の増殖進展に働く｡また,腫瘍における新生血管の特徴は周細胞が欠如し･新生血管の基底膜の器質化が充分ではないので,腫瘍細胞が血管内へ侵入しやすく,腫瘍内の微小血管の密度が高ければ高い程,腫瘍細胞は浸潤転移しやすい｡したがって,腫瘍における血管新生の特徴を知ることは重要な臨床的意義がある｡そこで,女性生殖器癌すなわち子宮頚癌,卵巣癌,子宮内膜癌における血管新生因子,すなわちチミジン

フォスフォリラpゼでもあるplatelet-derived

endothelialcellgrowth factor(PD-ECGF)やvascular

endothelialgrowth factor(VEGF)の発現や機能の特徴を検討し･また以前から報告してきたbasic fibr｡blastgrowthfactor(bFGF)の成績も考慮して,癌種による血管新生の特徴を解析したo 研究方法 1)すべての患者から組織の採取およびその組織の研究への利用に対するインフォームドコンセントを得た0 2)子宮頚癌,卵巣癌,子宮内膜癌におけるPD-ECGFおよびVEGFの発現の局在および血管新生との関連を知るために,抗ヒトVEGF抗体,抗ヒトPD-ECGF抗体,(血管内皮細胞に特異的な)抗第Ⅷ因子関連抗原抗体を用いてLSAB法にて免疫染色をおこなった｡毛細血管細胞数(MVC)は光学顕微鏡下に観察し,200倍における 5視野の平均の値とした｡ 3)VEGFのアイソフォームの発現をウエスタンプロット法にて検討した｡子宮頚癌,卵巣癌･子宮内膜癌の組織をHG緩衝液中でホモゲナイズした懸濁液を遠沈し,上清を試料とした｡試料の蛋白濃度はt Bradford法で測定した｡15∼100〟gの蛋白を含む各試料25FLlを試料緩衝液25FLlに加え,7･5%SDS-PAGEにて得られたゲル上のバンドを電気的にニトロセルロース膜に移行させた｡一次抗体として抗ヒトVEGF抗体.二次抗体としてペルオキシダーゼ標識特異抗体を用いた｡特異的バンドは蛍光を発光させオートラディオグラムを行った｡ 4)PD-ECGFおよびVEGFの蛋白発現の検討において子宮頚癌,卵巣癌,子宮内膜癌の組織をHG緩衝液中でホモゲナイズした懸濁液を遠沈し,上清を試料とした｡試料の蛋白濃度はBradford法で測定したo PD-ECGFの発現量は,Nishida,etal.の方法,VEGFの発現量は,HumanVEGF Assay Kit-IBLを用いてELISAにて測定した｡ 5)PD-ECGFおよびVEGFの遺伝子発現の検討において子宮頚癌,卵巣癌,子宮内膜癌の組織より･グアニジンーァシドフェノール法にて総RNAを抽出した｡総RNA3FLgでreversetranscriptionを行い,PCRのテンプレートを得た｡PCRは,総容量100JLlで施行した0なお,目的遺伝子のPCRのためのプライマー(オリゴマー) の塩基配列は,すでに明らかにされた各々のcDNAの塩基配列[PD-ECGFcDNA,VEGFcDNA, glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDA)cDNA]によって設定した0電気泳動で分離されたァガロース内のPCR産物をキャビラリー･トランスファーでImmobilon-S transfermembrane上に移行させ, ビオチン化ブロープとハイプリダイゼーションし,蛍光を発光させ,オートラディオグラムを行った○検出した特異的バンドの強さをデンシトメータで測定した｡ 6)PD-ECGFおよびVEGFの蛋白およびmRNAの発現量はt同一組織の3カ所からそれぞれ3回ずつ測定し･そ

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ー37-の平均と標準偏差を算出した｡各組織型および臨床進行期間の有意差検定はStudent'st-teStによりp<0･05を有意差ありと判定した｡MVCとPD-ECGFおよびVEGFの発現量との相関はSpearman's correlation c｡efficientを剛､て解析した｡生存率はカプランマイヤー法で算出しlog-rank testで有意差を検定した○ 結果 1)子宮頚癌における血管新生因子‥子宮頚癌原発巣におけるPD-ECGFの発現(mRNA,蛋白)は癌組織のM vD(毛細血管密度)を示すMVCと有意に相関した｡また,腺癌よりも扁平上皮癌に優位に発現した｡子宮頚癌(扁平上皮癌)原発巣において低値群(<1ng/mg蛋白)と比べ高値群(>2･5ng/mg蛋白)では術後2年までの予後は有意に悪かった｡さらに,一般にリンパ節転移がある子宮頚癌の予後は不良であるが,子宮頭痛 Ⅱb期のリンパ節転移がある症例で,転移リンパ節でのPD-ECGFの発現量が10ng/mg蛋白以上の症例の術後 2年までの予後は,10ng/mg蛋白未満の症例に比して有意に悪かった｡子宮頚癌原発巣におけるVEGFの発現は癌組織のMVCと相関したが,臨床予後とは相関しなかった｡VEGFのアイソフォームのうち主にVEGFl佑と vEGF.21およびそのmRNAが発現し,蛋白とmRNAの発現量は良く一致していた｡また,扁平上皮癌よりも腺癌に優位に発現するものがあった｡したがって,子宮頚癌の血管新生能を知る上で,PD-ECGFの発現の高低は良いインディケ一夕一になると推察される｡抗癌剤の5,-deoxy-5-fluorouridine(5,-DFUR)はPD-ECGF(チミジンホスフォリラーゼ)により活性型5-fl｡OrOuraCilに変換され,治療効果を発揮すると推察されるので,高PD-ECGFを示す子宮頚癌の発育抑制やそこでの血管新生の抑制には5,-DFURが有用である可能性がある｡ 2)卵巣癌における血管新生因子‥卵巣癌におけるVEGFの発現は組織型による差はないが正常卵巣より高値を示し,低値群(<0.9ng/mg蛋白)と比べ高値群(>1.2ng/mg蛋白)では術後2年までの予後は有意に悪かった｡PD-ECGFとそのmRNAの発現は組織型による差はないが正常卵巣より高値であり,一部の症例で著しく高値で,また進展と関与する札Ⅳ期に高値がみられるが,全体として臨床進行期とは相関しなかった0 したがって,VEGFの高値が予後を悪化していることから卵巣癌の血管新生の抑制にはVEGFの抗体やVEGF 受容休の抗体を含めたVEGFのシグナル伝達路の阻害剤が奏効すると推察される｡ 3)子宮内膜癌における血管新生因子:子宮内膜癌においてはVEGFは,アイソフォームのうちVEGFl伍と VEGF121およびそれらのmRNAが主に発現し,VEGFの発現は正常子宮内膜から分化型子宮内膜腺癌,中∼低分化型子宮内膜癌へと分化度が低下するにしたがい低下傾向にあり,さらに正常子宮内膜から子宮内膜癌Ⅰ執 Ⅲ期,札Ⅳ期へと進行するにしたがい低下傾向を示した｡正常子宮内膜と比べ,分化型内膜腺癌ではPD-E CGF蛋白の発現は増加するが,子宮内膜癌においてPD-ECGFおよびそのmRNAの発現は分化型子宮内膜腺癌より,中∼債分化型子宮内膜腺癌へと低下し,子宮内膜癌Ⅰ期とくらべ,Ⅱ期,Ⅲ,Ⅳ期へと低下した｡また, 筋層浸潤のとき蛋白発現が高くなる場合があった｡一方,bFGFは逆に癌の進行とともに発現がアップレギュレートされ,子宮内膜癌の臨床予後と相関すると報告してきた｡高分化型子宮内膜癌細胞Ishikawa細胞におけるVEGFはアイソフォームのうちVEGF165とVEGF121およびそれらのmRNAが主に発現し,それらの発現はェストラジオールー17βにて一過性に増加し,プロゲステロンはその増加を半分程度抑制した｡月経周期における子宮内膜PDTECGFmRNAの発現変化は血中エストラジオーJV-17βの値の変化と逆パターンに近くなり, PD_ECGFの発現変化は血中プロゲステロン値の変化と類似した｡PD-ECGF蛋白の変化はそのmRNA値の変化の2-3日の遅れであったことから,PD-ECGFの発現は性ステロイドにより調節されていることが推察される｡したがって,bFGFは子宮内膜癌の増殖進展に関わる血管新生能を知る上で良いインディケ一夕一になると推察される｡また高分化型子宮内膜癌は,正常性ステロイド調節機構が一部残っていることが考えられることから,性ステロイド関連抗癌剤が抗癌,抗血管新生に有用であると考えられる｡

論文審査の結果の要旨

申請者坂口英樹は,女性生殖器癌において,血管新生因子は癌種や進展時期に特徴的な発現様式があり,これに対した個別化した抗癌,抗血管新生剤療法が必要であることを明らかにした｡本研究の成果は婦人科領域におけるtumordormancy療法やQOLの改善に少なからず寄与できるものと思われる｡ [主論文公表誌] 女性生殖器癌における血管新生とその臨床的意義平成12年3月発行予定岐阜大医紀48(2)

女性生殖器癌における血管新生とその臨床的意義

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