骨 肉 腫 由来 培 養 細

金沢大学 十全 医学 会 雑誌 第8 5 巻 欝2 ^｡ 3 号 1 3 5 ^‑1 53 (1 9 7 6)

ヒ ト骨 肉 腫 由来 培 養細胞 ^{の マ} ウ ス並び に ラ ッ ト^へ の異 種 移 植 ^に関^する実験 的研 究

金沢大 学 医 学 部 整 形 外 科学 講座 ( 主任^: 高 瀬 武 平教 授₎

竹 林

生き た ま ま^の細 胞を光顧 ^{レ ベ ル}で動 的^に捉えよう と いう発 想^のも と^に始ま^った組 織 培 養の歴史は , 1 8 8 5年

Ch ick e mbryo の神 経 板を組塙 培 養し た Ro u x32)

を創 始 者^とレ^{, 1 9 0 6年には Ha r ris o n12) が神 経 線}

推の培養を試み, その後 Ca r r e1^{5 )} がはじ めて と 卜悪

性 腫 瘍細 胞 ( 紡 錘 形 細胞 肉腫) ^の組 織 培 養を 試 み. つ

づい て Gey^川) が と 卜線 絶 軟 骨 肉腫 の長 期 絶 代 培 養 を行^い･ 更^に

▲ ^Gey

一り は子 宮 頸 部痛^{か ら HeLa} 細胞 株を樹 立して以来^, 組 織 培 養^によ る腫瘍細 胞^の研 究 は

め ざ ま し く躍進し た^.

骨 腰痛 細 胞^の組 織 培 養に関 して, 阿部²⁾, 太 田^… が 骨 巨細 胞 腫^の組 織 培 養^に成 功し たの につづき, 1 96 4年 高歯ら³⁷⁾ は骨 肉 腫患 者^の切 断肢よ り骨 肉腫 細 胞 ^の培 養. 線 化に成功し. これ を O S T 細 胞と命 名し た.

こ の O S T 細 胞^に関して形態 学 的 観 察^{29)3 丁)4 3)}. 増殖サ イ ク ル^柑), Ⅹ線²⁵⁾及び各種 薬 剤に対す る影 響^ほ)27)36) な ど につ い て数々 の研 究が な さ れ, 更^に O S T 細 胞を R^ab b it a nti^‑M o u s e^‑T hym u s Se r u m で処 理 し^{た マ}

ウ ス に異 種 移 植し^マ ウ スを腫瘍^{死 さ せ ることに}成功 し た^{20 )〜}23 )28)38)39)

他 方^,1 9 7 4年^に金沢大 学 医学 部整 形 外 科学 教 室に於

て . 新たに骨 肉 腫患 者^より骨 肉 腫細 胞^の継 代培養に成 功し^{, こ}れ を O S T Ⅱ細 胞と呼称し^. 現在掴代^に継 代 培養さ れて いる^. 著 者は^{こ の}継 代培養 初期^の O S T II 細 胞につ い て 拍: ひ抽化 で の細 胞^の性 状及び形態 学 的観 察を行う と と もに O S T Ⅱ細胞 を^{マ ウスに}異 種 移 植を試み た^. 更^に O S T 細 胞と O S T Ⅱ細 胞を Rab^. b it a nti^‑Rat^･T hym u s Se r u m で処理 し たラ^.ソ ト に

異 種 移植を行う と と もに生 後2 4時間 以内^の新生 児^ラ ッ

ト に両細 胞を静注 し, 肺に移 植を成 立さ せ‑ これ ら 2 種類^の骨 肉腫 細胞に つい てそ^の移植 性t 頬_{骨 形 成}能^. 悪 性 度な ど を比較 検 討し^て若干^の知 見 を得たの で報告 す る.

Exp^{e r}im e ntal stud ie s on t he he te r olo go u s

hu m a n o steog^{e n}ic s a r c o m a c e11s into mic e m e nt of Ort hopa edic Su r g e r y (D ir e cto r :

Ka n a z a w a u niv e r sity^.

俊 ^一 郎

1 3 5

Ⅰ^. 実 験 材 料

1 ^. 骨 肉 腫由 来 培養 細 胞 1) O S T 細 胞

1 96 3年1 0月2 8 日に金沢大 学 医学 部 整 形 外 科学教 室^に 於^て1 5才 女 子^の左 大腿^骨骨 幹 郎^に発 生し た 骨肉腫 を ( 写 真1 , 2), 左 下肢 切 断 後, これ を 摘出. 分 離し て組 織 培 養を行^い. 総 代 培 養 後19 6 4年6 月に株化細胞 と な り^, Oste oge nic Sa r c o ma Taka s e str ain

(O S T 細 胞) と命 名し た もの で ､1 9 7 5年_{1 1 月 現}在5 4 9 代^で長 期絶 代 培養 中であ る.

2 ) O S T Ⅱ細 胞

1 0才 女 児^の左大 腿 骨 下 端部^に発 生し た骨 肉腫 を ( 写 真3 , 4 ), 1 97 4年1 2月2 3 日金沢大 学医学 部 整形外 科 学 教 室で切断 後, 摘 出, 分離し直ちに初 代 培 養を行

い, その後^l 継 代 培 養に成功し, 1 9 7 5年1 1月現在4 4代

で継 代培 養 続 行 中^で, これ を O S T Ⅱ 細胞と呼 称し た^.

2 . 移 植 動 物

上 記^の細 胞の異種移 植に ラッ トと^マ ウ ス を使用 し た^. 即ち^, 大 腿 骨 部移 植には生 後2 4時間 以 内 ^の新 生 児. 生後^{1 過,} 生 後2過^の W ista r 系 姓^ラ ッ トを ^. 静 注 移植には生 後2 4時 間以内の W ista r 系地所 生児 ラッ トを各^々使用 し た. ま た O S T Ⅱ細胞 を 生 後 2 過

d d N堆^{マ ウ ス の}大 腿骨 部^に移植し た^.

Ⅱ. O S T 細 胞及 び O S T Ⅱ細胞の/〃 ∨/rr o での

実 験

O S T 細 胞^に関しては 既^に報 告さ れて いる^{の で1 3 ユー5)Z 2)}

25) 祁)3 ‖ 舶 3)

主 と して O S T Ⅲ細 胞^の実験 ^{に つ} き 記載す る^.

実 験 方 法 1 ^. O S T Ⅲ細 胞^の初 代 培養

tr a n spla nt a tio n of tw o k inds of cultured

a nd r ats.S h un ^‑ich ir o Takeba y a sh i,De p art^･ Pr of^･ B uhei Takase) S^ch ool of _M ed icine.

1 3 6 竹

O S T ‡細胞^の初代 培 養^には高 瀬ら³⁶⁾ の方 法^に従い.

採取し た 腫瘍 組織を生理的 食塩 水で数回 洗浄し た後,

無 菌 的に鋏で細 切し, ガ^ー ゼ で濾過 し た^. ま た 細切 後 0.2 5 % ^try psin を加えて1 5分 間 pipet t ing して try psiniz atio n さ せ た後^, 燐 酸 緩 衝 食塩 水^{で tr}y p^‑ sin 作用を阻 止し, ガ^ー ゼ で濾 過 し た, そ れ ぞ れに Ha nks 液を加えて細胞 浮 遊 液と し^. 1 ^.0 0 0r.p^.m .5 分 間 遠心 ^にか け た^. 沈溝細 胞を T C M ediu m 1 9 9 に牛 胎児 血 清2 0 % 含 有^の培 養 液^に1 0⁵個^/ ml と なるよ うに入 れ た後^. 角型大培 養 瓶^{に こ の}細 胞 浮 遊液 1 0^{n ll} を注 入, 3 7⁰C で静 置, 毎日観 察し た^.

2 ^. O S T 細 胞及 び O S T Ⅲ細 胞^の形態学 的 観 察 O S T 細 胞は5 4 5代 目, O S T Ⅱ細 胞は 2 代 目^, 4 代 目^, 4 0代 目^のも^のを使用 し た^. 短冊 を 入 れ た^/ト培 養 瓶

に培 養 液1 ml づっ 5 ×1 0⁵個^の細 胞を 注 入 し^, 培 養 後 経 時 的^に取り出し. G ie m s a 染 色及 び H^･E 染 色を 行^い観 察し た^.

3 ^. O S T 細 胞及 び O S T Ⅱ細 胞^の細 胞 数 変 化 O S T 細 胞は5 4 5代 臥 O S T Ⅱ細 胞は4 0代 目^の もの を使用 し た^. 両 細 胞を E D T A で剥 離 後, 充 分 p i p^‑ et ting し単 個^の細 胞と し た^のち^. 培 養液 1 ^mlに つ き 細 胞 数1 0⁵個と な る よ う^に調 整し. 細 胞 培 養液 を 正確

に1 ml づっ小 培 養 瓶^に分注し培 養し た^, 経 時 的^に5 本^の小 培 養瓶を取り出し E D T A で剥 離. pipet ting の後, 血 球 計 算 板を用い て細 胞 数を計測 し^{た .} 各

林

時毎^の5 本^の培 養 瓶 中, 細胞 数^の最大^のものと 最^/ト^の も^のを捨て , 中 間^の3 本^の培 養 瓶 申, 細 胞 数^の平均 値 を と^った^.

4 . O S T Ⅱ細 胞^{のコ ロ ニ ー}形 成能

O S T Ⅱ細 胞3代 目^のものを使_{用 し た} . E D T A と 0.2 % try psin 等 量 液で4分 間 try psin 作用の後^. 充 分 pipet ting して単 離 細 胞と し た^. 5 0個^の O S T

Ⅱ細 胞を ^{シャ ー レ に}植えこみ, C O2^･in c ubato r で培 養し. 2 過 後^{に コ ロ ニ ー} 形 成^の数を観 察^{し た.}

5 ^. O S T Ⅱ細 胞の染 色 体 構 成^の観 察

O S T I 細 胞3代 目^のも^のを使用 し, 空 気 乾 燥 法^{2 5)} 施行 後^. 染 色 体 染 色を行^い, 分裂 細胞^の染色 体数 を算 定し た^.

6 . オ^ー ト ラ ジオ グラ フ ィ ^一 によ る O S T ‡細 胞の Cy tok in etic s の検討

O S T Ⅱ細 胞8代 目^の細 胞に^つ き継 代 培 葺4 8時間後

に ³H^‑T hymi d in e (³H^‑T d R と略す) を 用い て C u m ulativ e label ing m ethod^, Single puls e^‑mit‑

o sis ch a s e m ethod によ り本細 胞の Cy tOkin etic s

を検 討し た^.

1) Cu m ulativ e l^abeling m ethod セは^{, 3}H ^･T d R を 0^.1LL C/mlの濃 度^で持続 的^に培 養 液^に添加し,

添加4 8時 間 後まで3 時 間 毎^に標 本を取り出し た^. 2) S ingle puls e^‑mito sis cha s e m ethod で は上 記と同濃 度で ³日^‑T d R を3 0分 間だ け作用 さ^{せ t}

表1 0 T S Ⅱ細 胞^の継代 培 養^の経過

代 ^{継 代まで の} 所 要日数

通 算

所 要日数 継 代年 月日 備 考

初 代

2 代

3 代

4 代

5 代

6 代

7 代

8 代

9 代

1 0 代

> ^{1 9}､^日

> ^{1 4}

四

> ⁶

> ⁵

> ⁴

> ⁷

> ⁷

> ⁶

1 9 日 3 3

4 4 5 0 5 5 5 9 6 6 7 3 7 9

1 9 74^.1 2^.2 3 1 9 7 5^. 1^.1 1 1^.2 5

2. 5 2.11^･ 2.1 6 2^.20 2^.27 3^. 6 3^.1 2

1.2 7 ^{コ ロ ニ ー} 培 養 1^.2 8 走 査 電 顕

電 顕

1.3 1 初 代細 胞 を 窒 素 冷 凍 2. 3 染 色体 染 色

2^.20 4 代, 5 代を

マウス に異 種 移 植

ヒト骨 肉膵 由 来培 養細 胞の^マウ^ス並びに ラット^ヘ の異 種移 植

そ^の後5 1時 間目ま で 3時 間 毎に標 本を取り出し た.

以上^の如く ³H^･T d R で ラ^ベ ルし た模 本を Ha nks

液 で数 秒 間洗 浄 後^t 乾燥^{. メ}タ^{ノ ー ル}固定を施し,

d ip ping 法によ るオ ^ー ト ラ ジ オグラフ ィ ^一 棟 付³⁾ を 行^っ た. 以 上の方 法で得た模 本を G ie m s a 染 色 を 施し観察し た が^, な お検 鏡に際しては, 1 個^の細胞核 上に5個以上の感 光 粒 子を有す る ものを 1abeled

C ell と し た^.

実 験 結 果

1 ^, O S T Ⅱ細 胞^の初 代及 び縫 代^培養^の経過 初 代 培 養を行^った O S T Ⅱ細 胞は2 4時 間目に は ガ ラ ス面に紡錘 形^の細 胞と な り定着し始め, 2 日 目には 細 胞 突 起を^のば して拡が り, 浮上細 胞と定 着 細胞 が 明 確 に別れ た 3 日目及 び更に7 日目^に培 養液^の交換 を行^っ た^. 7 日目よ り細胞は増殖 傾 向を示し, 2 週 後で は細 胞は 旺盛に増 殖し たの で (写真5 )^{, 1 9} 日目^に 2 代 目 の総 代 培 養を行^っ た^. 2代 培 養1 4 日目^には 3 代目^の継 代 培 養が 可能と な りt 3代 目継 代 培 養7 日 冒^で ag g^･ r egatio n 形 成を み た. 4代目に至^って は継_{代 培 養 4}

‑5 日目でガラ ス面^いっ ぱい に細胞 が増 殖し た. そ の

5

点

7

･ 3

∧

ソー

ー

′ 1‑ n

U

篭

じ

嘗 琶

冨

血

刈

12 2486 48 3 4 5 6 7 ( 加) ^Day^{$ a}触P C畑u 柑

図1 0 S T 細 胞及 び O S T II 細 胞^の増 殖 曲 線

Chr o m o $ O m ￠N u m鵬^P

図2 0 S T II 細 胞^の染 色 体 構 成

1 3 7

後^の縫代 培 養^で本 細 胞は安定し た増 殖を示し (表1 ) 現 在に至^っ て いる.

2 ^. O S T 細 胞_{と O S T 軋}細 胞^の形 態学 的観 察 各継 代 培 養 後1 2時 間^で両 細 胞と も球 状^の細胞 形態で

定 着し始め^, 2 4時 間で紡錘形を 呈 し^, 4 8時 間^{で は}紡錘 形が更^に明 瞭と な り^. 原 形 質^の両端^に長^い突 起を 認^め る ものも出 現し た( 写 真6)^. 4 日目よ り 星状ま たは

多角 形に細胞は融 合し あ^って上皮 細 胞 様形態を 示 して 旺盛^に増 殖し た(写真7)^. 7 日目以後^で は^. 両 細 胞 は重な り あ^って ag gr egatio n を 形成し^, 個 ^{々 の}細 胞^の判別 が 困難と な^っ た^.

3 . O Sナ細 胞及 び O S T I 細胞^の細 胞 数 変化 両 細胞 系と も細 胞 数は培 養 後1 2時 間^{で 一} 旦 減少を 示 し, 以後 増 加し4 8時 間では培 養 開 始時とほ ゞ同数^にな り. 以後 更^に増 加を示し た^. 4 日目で両 細胞の細胞 数 は最高と な り. 以後減 少し た( 図 1).

4 ^. O S T ‡細 胞の コ ロ ニ ー 形成 能

5 0個^の植え込みで平 均4 6^.4 % の ^{コ ロ ニ ー} を 形成し た ( 写 真8)^. ま た 5個^{の シ}ャ ^ー レ の総 数1 1 6 個 の ^{コ ロ}

ニ ^ー は全てほ^ゞ円形を 呈 し^, 各^{コ ロ ニ ー の}細 胞は上皮 細 胞 様であ り (写真9) ^. 所^々散 在 性^に多 核巨細 胞^の

出現 を み た.

5 . O S T Ⅱ細 胞^の染色 体 構 成

O S T Ⅱ細 胞3 代 目^{につい て}検討し た結果 , 染色体 数^の頻度 分 布は図2の如_くであっ た. 即 ち O S T Ⅲ細 胞は染 色 体 数2 8個^〜3 0 6個と広 範な染 色 体数 変異 を 呈

し, 染 色 体 数^{モー ド}は7 1個であ^っ た ( 写真1 0 ) .

6 ^. O S T Ⅱ細 胞^の Cy tok in etic s

l ) C^{u m u}lativ e labeling m ethod で は各標 本

につ き細胞 数1.0 0 0個を数え . こ の中の Iabeled

8 0 3 9 15 別 2了 38 39 ( 佃 図3 0 S T II 細 胞

in ui hb c u m ulativ e Iabeling ^{rn et}hod