博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院 理工学研究科

博 士 論 文 概 要

論 文 題 目

生体内超常磁性粒子の非破壊的検出法の確立

Development and Application of Nondestructive Analytical Methods for Evaluating Bio-superparamagnetic Particles

申 請 者

坂田 真信 Masanobu Sakata

生命理工学専攻 生体制御研究

2009 年 12 月

- 1 - １ ． 序 章

オ オ ミ ジ ン コ（D a p h n i a m a g n a）は 通 常 の 環 境 下 で は 単 為 生 殖 を 行 う 。し か し 環 境 悪 化 に よ り 雄 が 現 れ る と 、 両 性 生 殖 に 切 り 替 わ り 休 眠 卵 を 形 成 す る 。 こ の 休 眠 卵 は 数 十 年 以 上 も 生 存 能 力 が 保 持 さ れ て い た り 、 乾 燥 や 凍 結 に 耐 え る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 し か し 一 方 で こ の 休 眠 卵 の 具 体 的 な 物 理 化 学 的 性 質 に つ い て の 報 告 は ほ と ん ど 無 か っ た 。 そ こ で こ の 休 眠 卵 の も つ 性 質 を 明 ら か に す る た め 、 並 木 研 究 室 の 川 崎 た ま み 氏 （2 0 0 5 年 3 月 理 学 博 士 号 取 得 ） は 物 理 化 学 的 手 法 を 用 い て 、 休 眠 卵 内 に 強 磁 性 物 質 マ グ ネ タ イ ト（F e₃O₄）の 微 粒 子 が 含 ま れ て い る こ と 、結 晶 性 リ ン 酸 カ ル シ ウ ム が 含 ま れ て い る こ と を 確 認 し た 。 結 晶 性 リ ン 酸 カ ル シ ウ ム に つ い て は 、 そ の 後 X 線 回 折 に よ り ブ ル シ ャ イ ト （C a H P O₄・2 H₂O） で あ る こ と が 示 さ れ た が 、 強 磁 性 物 質 の 微 粒 子 に つ い て は 超 常 磁 性 と い う 特 殊 な 性 質 を 示 し 、 か つ 休 眠 卵 は 多 細 胞 生 物 体 で あ る 為 、 従 来 行 わ れ て き た 生 体 磁 石 に 対 す る ア プ ロ ー チ 法 で は 解 析 が 厳 し い こ と が 考 え ら れ た 。 そ こ で 本 研 究 の 目 的 は 、 従 来 行 わ れ て き た よ う な 電 子 顕 微 鏡 像 や 元 素 分 析 に よ る F e の 検 出 を 目 指 す 手 法 で は な く 、物 理 化 学 的 手 法 で マ グ ネ タ イ ト 微 粒 子 の 存 在 を 明 ら か に し 、 他 の 多 細 胞 生 物 体 に も 有 用 で あ る よ う な 新 し い 測 定 系 を 確 立 す る こ と と し た 。

２ ． １ ． オ オ ミ ジ ン コ 飼 育 系 の 確 立 と 従 来 法 に よ る 分 析 及 び 新 し い 測 定 系

オ オ ミ ジ ン コ の 休 眠 卵 を 継 続 的 に 入 手 す る 為 、O E C D の 基 準 に 従 い 飼 育 系 を 確 立 し た 。 そ し て ま ず は 休 眠 卵 を 産 生 す る 飼 育 条 件 を 求 め た 。 そ の 結 果 、 過 密 度 状 態 で 休 眠 卵 を 産 生 す る こ と が わ か っ た 。 こ の 休 眠 卵 に 対 し 従 来 法 に 基 づ き 、 ① 電 子 線 マ イ ク ロ プ ロ ー ブ ア ナ ラ イ ザ ー （E P M A） に よ る S E M 像 解 析 及 び 元 素 分 析 、

② 走 査 型 X 線 顕 微 鏡 （X S A M） に よ る 透 過 X 線 像 解 析 及 び 元 素 分 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、F e は 検 出 さ れ な か っ た 。 そ こ で 新 た に 生 体 サ ン プ ル に 対 し て 材 料 化 学 分 野 で 用 い ら れ る 手 法 を 応 用 す る こ と を 考 え た 。① 超 伝 導 量 子 干 渉 磁 束 系（S Q U I D） を 用 い 、 飽 和 磁 化 の 測 定 に よ る 磁 気 的 性 質 の 解 明 、 F C / Z F C（ f i e l d - c o o l i n g / z e r o - f i e l d - c o o l i n g ） 測 定 に よ る 磁 性 物 質 の 存 在 状 態 の 解 明 、 ② 電 子 ス ピ ン 共 鳴 装

置（E S R）を 用 い 、強 磁 性 共 鳴（F M R）の 検 出 に よ る 磁 性 物 質 粒 子 間 距 離 の 概 算 、

③ 試 料 水 平 型 強 力 X 線 解 析 装 置 （R i n t - T T RⅢ ） を 用 い 、X 線 小 角 散 乱 法 （S A X S） に よ る 磁 性 物 質 粒 径 解 析 と い う 手 法 を 組 み 合 わ せ る こ と で 微 粒 子 の 磁 性 物 質 を 明 ら か に す る こ と を 考 え た 。

２ ． ２ ． 超 伝 導 量 子 干 渉 磁 束 系 （S Q U I D） に よ る 解 析

① 川 崎 氏 は 3 0 0 K に お い て 飽 和 磁 化 の 測 定 を 行 い 超 常 磁 性 現 象 を 観 測 し て い る が 、5 K に お け る 飽 和 磁 化 の 測 定 を 行 っ た 結 果 、常 磁 性 飽 和 を 示 し た 。こ れ は 常 磁 性 イ オ ン の 割 合 が 多 く 強 磁 性 体 の 微 粒 子 が 少 な か っ た こ と を 示 す 。 川 崎 氏 の 飼 育 系 と こ こ で 立 ち 上 げ た 飼 育 系 で は エ サ の 状 態 が 異 な る だ け な の で 、 エ サ に よ っ て F e の 取 り 込 み 方 に 違 い が 出 る 可 能 性 が 示 さ れ た 。 ②F C / Z F C 測 定 を 行 っ た 結 果 、 両 者 の 挙 動 が 一 致 し た こ と か ら 、 休 眠 卵 中 の 磁 性 イ オ ン は 、 常 磁 性 イ オ ン a n d / o r

超 常 磁 性 粒 子 と し て 存 在 す る こ と が 分 か っ た 。 ま た キ ュ リ ー ワ イ ス 則 に 従 う 結 果 が 得 ら れ た こ と か ら 、 磁 性 イ オ ン の 大 部 分 は 超 常 磁 性 粒 子 と し て 存 在 し 、 強 磁 性 と し て の 性 質 を 持 つ マ グ ネ タ イ ト は ほ と ん ど な い こ と が 分 か り 、 さ ら に は F e^{3 +}イ オ ン 数 が 1 . 3 × 1 0^{1 6}で あ る と い う 計 算 結 果 が 得 ら れ た 。 ま た M o s k o w i t z t e s t を 行 っ た こ と に よ り 、 休 眠 卵 中 の 全 磁 性 イ オ ン の 中 で 大 き な 強 磁 性 粒 子 と し て 存 在 す る も の は 0 . 0 3％ し か な い こ と も 確 認 さ れ た が 、 一 方 で は Ve r w e y t r a n s i t i o n が 検 出 さ れ な か っ た の で 、 休 眠 卵 中 の 微 粒 子 マ グ ネ タ イ ト は 濃 度 が 低 く 結 晶 性 が 低 い こ と が 示 唆 さ れ た 。

２ ． ３ ． 電 子 ス ピ ン 共 鳴 装 置 （E S R） に よ る 解 析

マ グ ネ タ イ ト が 微 粒 子 で あ る と き 、E S R で は 特 徴 的 な 強 磁 性 共 鳴 （F M R） と い う ス ペ ク ト ル が 検 出 さ れ る 。 そ こ で 5 K～3 1 5 K ま で 温 度 変 化 さ せ て そ れ ぞ れ の 温 度 で 吸 収 ス ペ ク ト ル を 観 測 し た 結 果 、 強 磁 性 共 鳴 が 検 出 さ れ た 。 ま た こ こ で 検 出 さ れ た ピ ー ク 幅 か ら 粒 子 間 距 離 が 計 算 で き る こ と が 報 告 さ れ て い る の で 、 吸 収 ス ペ ク ト ル の ピ ー ク 分 離 を オ リ ジ ン ソ フ ト を 用 い て 行 い 、 算 出 さ れ た ピ ー ク 幅 か ら フ ィ ッ ト 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、 粒 子 間 距 離 が 約 1 5 n m と 概 算 さ れ た 。

２ ． ４ ． 試 料 水 平 型 強 力 X 線 解 析 装 置 （R i n t - T T RⅢ ） に よ る 解 析

X 線 小 角 散 乱 法 （S A X S） は 、 サ ン プ ル 中 の 目 的 粒 子 が 分 か っ て い る 場 合 、 粒 子 の 分 布 と 平 均 サ イ ズ を 測 定 す る 事 が で き る 。休 眠 卵 に 対 し X 線 小 角 散 乱 法 を 行 っ た と こ ろ 、約 1 3 n mの マ グ ネ タ イ ト と 考 え ら れ る 微 粒 子 が 存 在 す る 事 が 分 か っ た 。 粒 子 間 距 離 が 約 1 5 n m と 概 算 さ れ 粒 子 径 が 約 1 3 n m と 解 析 さ れ た が 、強 磁 性 微 粒 子 の 濃 度 が 低 い こ と が 考 え ら れ る の で 、 休 眠 卵 内 の マ グ ネ タ イ ト 微 粒 子 の 分 布 状 態 は 幾 つ か の 微 粒 子 が 接 近 し て 存 在 し て い て 、 そ れ ら が そ れ ぞ れ 遠 く 離 れ て い る と い う 状 態 で あ る と い う こ と が 示 唆 さ れ た 。

３ ． ク ロ レ ラ （C h l o re l l a v u rg a r i s C h i k u g o） の 物 性 解 析

測 定 に 用 い る サ ン プ ル の 飼 育 系 を 確 立 す る こ と は 、 継 続 的 な サ ン プ ル の 入 手 の み な ら ず 、 野 生 株 に お け る コ ン タ ミ を 考 え な く て 良 い 事 や 飼 育 環 境 が コ ン ト ロ ー ル で き る と こ ろ に 意 義 が あ る 。 オ オ ミ ジ ン コ 休 眠 卵 に 含 ま れ る 微 粒 子 マ グ ネ タ イ ト は エ サ 由 来 で あ る こ と が 考 え ら れ る の で 、 オ オ ミ ジ ン コ の エ サ と し て 使 用 し て い る ク ロ レ ラ に つ い て も 同 様 の 解 析 を 行 い 、 マ グ ネ タ イ ト の 成 因 を 追 究 す る こ と に し た 。 ①S Q U I D に よ る 磁 化 測 定 に よ り 反 磁 性 が 得 ら れ 、 こ こ か ら ク ロ レ ラ に は マ グ ネ タ イ ト な ど の 強 磁 性 物 質 は 含 ま れ て い な い こ と が 分 か っ た 。 ②E S R 測 定 よ り F M R は 検 出 で き な か っ た 。 こ れ は S Q U I D の 結 果 に 矛 盾 し な い も の と な っ た 。 一 方 で は プ ラ ズ マ 発 光 分 光 分 析 （I C P） よ り F e を 多 く 含 む こ と も 確 か め ら れ た の で 、オ オ ミ ジ ン コ 休 眠 卵 内 の マ グ ネ タ イ ト 微 粒 子 は 、ク ロ レ ラ 由 来 の F e を 取 り 込 み 生 体 内 で 生 合 成 （b i o m i n e r a l i z a t i o n） し た も の で あ る と 考 え ら れ た 。

４ ． 他 の 多 細 胞 生 物 体 へ の 応 用

生 体 内 超 常 磁 性 粒 子 の 検 出 に は S Q U I D、E S R、R i n t - T T RⅢ を 組 み 合 わ せ た 測 定 系

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が 有 効 で あ る こ と が 分 か っ た の で 、 他 の 多 細 胞 生 物 体 サ ン プ ル に 応 用 で き る か 確 か め る こ と に し た 。 並 木 研 究 室 で は 野 生 の ヒ ト ス ジ シ マ カ （A e d e s a l b o p i c t u s S k u s e）に 対 し て ①X 線 透 過 写 真 で ボ ウ フ ラ 腹 部 に 質 量 数 の 大 き な 元 素 を 含 む 粒 子 を 確 認 し 、 ②X 線 分 析 顕 微 鏡 （X G T） に よ り ボ ウ フ ラ 腹 部 に F e を 確 認 し 、 ③ ネ オ ジ ウ ム 磁 石 に ボ ウ フ ラ が 吸 い 付 く こ と の 観 察 が 行 わ れ て い る の で 、 ヒ ト ス ジ シ マ カ の 継 代 飼 育 を 行 い マ グ ネ タ イ ト と 考 え ら れ る 粒 子 の 成 因 を 探 る こ と と し た 。 ま た ア ル テ ミ ア は オ オ ミ ジ ン コ と 同 様 、 休 眠 シ ス ト を 形 成 す る こ と が 知 ら れ て い る の で 、 こ ち ら で も 解 析 を 行 う こ と と し た 。

４ ． １ ． １ ． ヒ ト ス ジ シ マ カ 飼 育 系 の 確 立

ヒ ト ス ジ シ マ カ の 飼 育 系 を 確 立 し た 。 ボ ウ フ ラ の エ サ に は オ リ エ ン タ ル 工 業 の 昆 虫 用 試 料 を 与 え 、 成 体 に は ス ク ロ ー ス 溶 液 を 与 え た 。 ヘ ア レ ス マ ウ ス の 継 代 飼 育 系 も 確 立 し 、 産 卵 の 際 に 必 要 と な る 吸 血 を 行 わ せ た 。

４ ． １ ． ２ ． ヒ ト ス ジ シ マ カ と エ サ の ボ ウ フ ラ 用 飼 料 の 解 析

ヒ ト ス ジ シ マ カ の 解 析 の 結 果 、 ①S Q U I D に よ る 強 磁 性 飽 和 の 検 出 、 ②X 線 透 過 写 真 で 腹 部 に 質 量 数 の 大 き な 元 素 を 含 む 粒 子 の 確 認 、③X 線 分 析 顕 微 鏡 に よ る F e の 検 出 な ど か ら ヒ ト ス ジ シ マ カ に は 大 き い マ グ ネ タ イ ト 粒 子 が 存 在 す る こ と が 示 さ れ た 。 一 方 ボ ウ フ ラ 用 飼 料 で は 、 ①S Q U I D に よ る 超 常 磁 性 現 象 の 検 出 、 ②X 線 分 析 顕 微 鏡 に よ る F e の 検 出 、 ③X 線 小 角 散 乱 法 に よ り 飼 料 中 に 約 9 n m 程 度 の 粒 子 を 確 認 し た こ と な ど か ら 、 ヒ ト ス ジ シ マ カ で は エ サ の 中 に 含 ま れ て い る マ グ ネ タ イ ト を 取 り 込 み 体 内 に 蓄 積 す る 機 構 を 持 っ て い る 事 が 分 か っ た 。 ま た b i o m i n e r a l i z a t i o n し て い る 可 能 性 も 考 え ら れ た 。

４ ． ２ ． ア ル テ ミ ア 休 眠 シ ス ト と 乾 燥 酵 母 の 解 析

A r t e m i a f r a n c i s c a na と A r t e m i a s p .と い う 2 種 類 の ア ル テ ミ ア と エ サ と し て 用 い て い る 乾 燥 酵 母 に つ い て 解 析 し た と こ ろ 、A r t e m i a f r a n c i s c a n a は マ グ ネ タ イ ト を 持 っ て お ら ず 、A r t e m i a s p .は マ グ ネ タ イ ト 微 粒 子 を 持 っ て い る 事 が 分 か っ た 。 ま た 、 乾 燥 酵 母 か ら は 微 粒 子 の マ グ ネ タ イ ト と 強 磁 性 体 と し て の マ グ ネ タ イ ト の 両 者 の 混 合 が 示 さ れ た 。 こ の こ と か ら 同 じ ア ル テ ミ ア で も マ グ ネ タ イ ト を 休 眠 シ ス ト に 持 つ も の と 持 た な い も の が 存 在 す る 事 が 分 か っ た 。

５ ． ま と め と 今 後 の 展 開

こ こ で 確 立 し た 生 体 内 超 常 磁 性 粒 子 の 非 破 壊 的 検 出 法 は オ オ ミ ジ ン コ 休 眠 卵 以 外 で も 有 効 で あ る こ と が 分 か っ た 。 飼 育 系 の サ ン プ ル を 用 い る こ と に よ っ て 、 生 体 内 超 常 磁 性 粒 子 の 由 来 を 検 討 す る 事 が で き る こ と も 分 か っ た 。 こ の 検 出 法 で は サ ン プ ル を 非 破 壊 的 に 扱 う 事 が で き る の で 、 こ れ ま で 焦 点 が 当 て ら れ な か っ た 多 細 胞 生 物 体 内 の 超 常 磁 性 粒 子 の 研 究 に 大 い に 貢 献 で き る も の と 考 え て い る 。 多 細 胞 生 物 体 内 の 超 常 磁 性 粒 子 の 研 究 は ほ と ん ど 行 わ れ て い な い 為 、 今 後 は 行 動 学 的 観 点 か ら 、 生 体 内 超 常 磁 性 粒 子 を 何 の た め に 保 持 し て い る の か を 明 ら か に す る 研 究 を 進 め た い と 考 え て い る 。

Ｎｏ.1

早稲田大学 博士 （理学） 学位申請 研究業績書

氏 名 坂田 真信 印

（２００９年 １１月 現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

論文

○

○

講演

１．Estimation for diameter of superparamagnetic particles in Daphnia resting eggs Masanobu Sakata, Tamami Kawasaki, Toshimichi Shibue, and Hideo Namiki (投稿準備中)

２．Magnetic characterization of Daphnia resting eggs

Masanobu Sakata, Tamami Kawasaki, Toshimichi Shibue, Atsushi Takada, Hideyuki Yoshimura, and Hideo Namiki

Biochemical and Biophysical Research Communications 351(2006)566-570

３．Crystalline calcium phosphate and magnetic mineral content of Daphnia resting eggs Tamami Kawasaki, Hideyuki Yoshimura, Toshimichi Shibue, Yuko Ikeuchi,

Masanobu Sakata, Keisuke Igarashi, Hidekazu Takada, Kazuhito Hoshino, Kay Kohn, and Hideo Namiki

Zoological Science 21(2004)63-67

４．Elemental characterization of Daphnia resting eggs by X-ray analytical microscopy Tamami Kawasaki, Masanobu Sakata, and Hideo Namiki

Zoological Science 21(2004)1019-1023

１．「Estimation of the diameter of the superparamagnetic particles contained in Daphnia resting eggs」

第45回日本生物物理学会（2007.12 横浜）

Masanobu Sakata, Tamami Kawasaki, Toshimichi Shibue, Hideyuki Yoshimura, and Hideo Namiki

２．「ミジンコ（Daphnia magna）耐久卵内の超常磁性物質の粒子径」

第78回日本動物学会（2007.9 弘前）

坂田真信、川崎たまみ、渋江俊道、吉村英恭、並木秀男 ３．「Projection X-ray microscopy of Daphnia with eggs」

Fifth East Asian Biophysics Symposium & Forty-Fourth Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan (2006.11 Okinawa)

Susumu Tsuruta, Tamami Kawasaki, Masanobu Sakata, Hideo Namiki, and Hideyuki Yoshimura

４．「Magnetic characterization of Daphnia resting eggs」

Fifth East Asian Biophysics Symposium & Forty-Fourth Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan (2006. 11 Okinawa)

Masanobu Sakata, Tamami Kawasaki, Toshimichi Shibue, Susumu Tsuruta, Hideyuki Yoshimura, and Hideo Namiki

Ｎｏ.2

早稲田大学 博士 （理学） 学位申請 研究業績書

５．「ミジンコ（Daphnia magna）耐久卵の物性解析（その２）」 第77回日本動物学会 (2006.9 松江)

坂田真信、川崎たまみ、渋江俊道、吉村英恭、並木秀男

６．「ミジンコ(Daphnia magna)耐久卵の磁化及びFMR測定」

第76回日本動物学会 (2005.10 つくば)

川崎たまみ、坂田真信、渋江俊道、吉村英恭、並木秀男

７．「投影型Ｘ線顕微鏡を用いた元素解析」

第43回日本生物物理学会 (2005. 11 札幌)

鶴田進、坂田真信、川崎たまみ、並木秀男、吉村英恭

８．「Magnetic tests and ferromagnetic resonance on Daphnia resting eggs」

第43回日本生物物理学会(2005. 11 札幌)

坂田真信、川崎たまみ、渋江俊道、鶴田進、吉村英恭、並木秀男

９．「ミジンコ（Daphnia magna）耐久卵のESR測定」

第42回日本生物物理学会(2004. 12 京都)

坂田真信、川崎たまみ、渋江俊道、高田篤、吉村英恭、並木秀男

10．「ミジンコ（Daphnia magna）耐久卵のESR分光法による測定」

第75回日本動物学会 (2004. 9 神戸)

坂田真信、川崎たまみ、渋江俊道、高田篤、吉村英恭、並木秀男

11．「投影型X線顕微鏡を使っての元素分析」

第41回日本生物物理学会(2003. 9 新潟)

五十嵐啓輔、坂田真信、川崎たまみ、並木秀男、吉村英恭

12．「投影型Ｘ線顕微鏡による生体内の微粒子の元素分析」

第7回X線結像光学シンポジウム (2003. 11 仙台)

五十嵐啓輔、吉村英恭、坂田真信、川崎たまみ、並木秀男

13．「投影型Ｘ線顕微鏡によるマイクロCTと元素分析」

第59回日本顕微鏡学会学術講演会 (2003. 6 札幌)

吉村英恭、堀亜由美、五十嵐啓輔、坂田真信、川崎たまみ、並木秀男

14．「ミジンコ耐久卵の物性解析」

第74回日本動物学会 (2003. 9 函館) 川崎たまみ、坂田真信、並木秀男

15．「ミジンコ表皮におけるミネラリゼーションの基礎的検討」

第74回日本動物学会 (2003. 9 函館)

坂田真信、川崎たまみ、米持賢治、並木秀男