急性リンパ性白血病細胞における酸性ホスファターゼの電顕細胞科学的研究

(1)

原著

〔書淫蔑。9第臨3劉骨〕

急性リソバ性白血病細胞における

酸性ホスファターゼの電顕細胞化学的研究

東京女子医科大学第一内科学教室（主任：滝沢敬夫教授，アカホシマサコ

赤星雅

指導：溝口秀昭教授）（受付昭和63年3月9日）

Ultracytochemical Studies of Acid Phosphatase in Acute Lymphoblastic Leukemia Cells

Masako AKAHOSHI

Division of Hematology， Department of Medicine I（Director：Prof． Takao TAKIZAWA and Leader：Prof． Hideaki MIZOGUCHI）Tokyo Women’s Medical College

The ultrastructural localization of acid phosphatase has been studied in tumor cells from four patients with adult T−cell leukemia， one patient with T−cell chronic lymphocytic leukemia（T−CLL）， four patients with T・cell acute lymphoblastic leukemia（T−ALL）， six patients with common ALL， one patient with pre−B ALL and eight patients with unclassified ALL． Tumor bells from all cases of T−cell malignancies showed cluster of dense bodies（CDB）or scattered dense bodies（SDB）， and reactivity in Golgi apparatus was also present． Leukemic cells showing differentiation toward B cells， that is， B4−positive unclassified ALL cells and common ALL antigen−positive common ALL cells， had neither CDB nor reactivity in Golgi apparatus． Of unclassified ALL， CDB was present in cells from three patients． Detailed immunoiogical analysis performed in one of the three patients did not reveal the

lineage of the tumor cells．

緒言

従来，リンパ球はT，B， non−T non・Bに分類され，急性リンパ性白血病（ALL）も表面マーカーからはT−ALL， B−ALL， nQn−T non−B ALLに分類されてきた．しかしながら，モノクローナル抗

体の開発等に伴い正常T，Bリンパ球の成熟，分

化過程が明らかにされ，従来non−T non−B ALL

と分類されてきたALLもその多くはT系， B系

の幼若細胞の腫瘍化であることが明らかになって

きた．すなわち，non−T non−B ALLはB系の pre−BALL， common（pre−pre−B）ALL， T系の pre−T ALLと，これらのいずれにも分類できない

unclassi丘ed ALLに分類されるようになっ

た1）∼3）一方，リンパ球の胞体内に検出される酸性ホスファターゼの分布のパターンが，リンパ球の表面マーカーに対応することは従来から知られてきた4）5）．すなわち，Tリンパ球では光顕レベルで胞体の一部に局在性に陽性であることが特徴的であるが，Bリンパ球では陰性かあるいはびまん性散在性陽性であることが知られている．さらに，リンパ系腫瘍細胞でも，酸性ホスファターゼの分布は正常T，Bリンパ球の各分化段階に対応する分布を示すことが報告されてきた6）7）．ALLにおいてはT−ALLでは局在性に陽性， B−ALLでは陰性かあるいはびまん性に陽性のことが知られてい

る6）∼17）．しかし，non・T non−B ALLでは局在性に

陽性の場合とびまん性散在性陽性の場合が報告さ

れており11）13）16）17），このような分布パターンの差

異がT細胞やB細胞の分化過程に対応して起

(2)

表1 症例の白血病型と

ACPase

Cases Sex Age Type of leukemia Origin of the cells TdT Ia B4 Lysosomes Golgi

①1．T．

M

37

_ATL

_Mature・T _⑭CDB＊㊥

e

②M．Y． F 63

ATL

Mature−T _⑱CDB ㊥ ∈）

③T．T．

M

49

ATL

_Mature−T _⑰CDB ㊦ θ

e

④K．K．

M

63

15 _{Common ALL} _{Pre−Pre，B} _㊥（∋ _㊥ _①

⑭J．U．

M

20 Common ALL Pre，Pre．B ㊦

e

㊦㊥㊥ ⑮Y．K． F 47 Common ALL Pre・Pre−B ①

e

① ㊦（∋

e

_㊦ _㊦ _㊥

⑳M．M． F 30 Unclassi且ed ALL Pre−Pre−Pre BP ㊦ ∈） _㊦ _㊥（D

⑳K．H． F 50 _{Unclassi且ed ALL} Pre−Pre−Pre B∼ ㊦

e

㊤㊥ ⑫Z．T。

M

70 Unclassified ALL Pre−Pre T？ _⑱CDB

e

㊦

o

e

⑬M．S． F 15 _{Unclassi員ed ALL} P

⑰CDB ① ㊦ ○

⑳J．1． F 81 _{Unclassi且ed ALL} P _⑭CDB _㊤ _㊦

＊Cluster of dense bodies

＊＊rcattered dense bodies

こってきているのか否かは明らかではなかった．さらに，T−ALLでも分化段階の異なるT−ALL間

で酸性ホスファターゼの分布に差があるのか否かは明らかにされていない．そこで，我々は今回リンパ性白血病細胞，特にnon−T non−B ALL細胞を中心に電顕細胞化学の手法を用いて検出した酸性ホスファターゼの分布パターンが，Foonら1）が示す基準に従い分類した免疫学的特徴とどのように対応するかを，比較検討したので報告する．材料および方法 1．酸性ボスファターゼの電顕細胞化学電子顕微鏡でペルオキシダーゼ陰性と判定した白血病細胞で，芽球が80％以上の症例を対象とした．末梢血あるいは骨髄液をヘパリン採取し， 2，000回転10分間，遠心分離した後血漿を除去し， 2％パラホルムアルデヒド，2．5％グルタールアルデヒドの混合固定液で0℃30分間の固定を行った．円盤状に固定された白血球層をクリオスタットで40μの切片とし，Gomoriの反応液18）中で 37℃30分一落祝し，さらにオスミウム酸で後固定の後，アルコールで脱水，酸化プロピレンを通して，PolyBed812に包埋した．雄町切片を作成し，電子染色を施行後，日立H−700H透過型電子顕微鏡で観察した． 2．白血病細胞の免疫学的検索

Terminal deoxynucleotidyl transferase （TdT）， cytoplasmicμchain，モノクローナル抗体のanti−B1， anti−B4， Leu−1，0KTシリーズに

よる検索を行った．ヘパリン添加骨髄液あるいは末梢血からFicoll−Conray法にて単核細胞を分離

した．TdTとcytoplasmicμchainの同定には細胞数を5×106／mlに調整し， Cytospin（Shandon，

(3)

酸性ホスファターゼ活性

㊦㊤

o

e

θ ㊦㊥

e

Southern Sewickley， Pa）でスライドグラスに塗

_結果

抹．した．TdTは塗抹標本を4℃メタノール中で30 症例は成人T細胞白血病（ATL）4例， T−CLL

分間固定し，子牛胸腺TdTに対するウサギIgG ．1例， T−ALL 4例， commgn ALL 6例， pre−B 抗体（Bethesda Research Laboratories， Inc．， ALL 1例， unclassi丘ed ALL 8例であった．表1 Gaithersburg， Md）を反応させ，次にFITC標識にはそれぞれの症例の免疫学的検索の結果と電顕

抗ウサギIgG抗体を添加反応させ，蛍光顕微鏡に細胞化学による酸性ホスファターゼの観察結果を

より観察を行った．モノクローナル抗体のanti一まとめてある．

B1， anti−B4， J5（抗common ALL抗原抗体）， 1． AT正およびT・CLL細胞の酸性ボスファ OKM1，0KIal， Leu−1，0KT 3，4，6，8，9，10，ターゼ活性

11を用いた検索は，白血病細胞の濃度を2∼4× ATLは4例経験した．酸性ホスファターゼの

107／mlに調整したのち，50μ1に上記の．モノク局在を示すリン酸鉛の反応産物は，高電子密度の

ローナル抗体を反応させ，次にFITC標識抗マウ沈着として観察された．酸性ホスファターゼ陽性スIgG， A， M抗体（Coulter Immunology，であるライソゾームが細胞質の一部に集合して認

Hialeah， Fl）を添加してフローサイトメーターでめられている．この構造はcluster of dense 観察した．30％以上陽性の場合に陽性とみなした． bodies（CDB）とよぼれており， T細胞に特徴的

(4)

では集塊状局在性陽性の断見と対応する．また酸性ホスファターゼはゴルジ装置にも活性が認められた．写真1は症例4の電顕像である．この症例はE−rosette陰性， OKT11はうすく反応が認められ，OKT3，0KT4陽性， OKT8陰性であったが，症例1と同様の所見が認められた．この細胞は培養することによってE−rosette， OKT11がはっきりと陽性を示すようになった．T−CLL（症例5）の電顕像を写真2に示す．この症例はOKT11陽性でありながらOKT3陰性のT−CLLである21＞．酸性ホスファターゼ陽性であるライソゾームが胞体内に散在性に認められた．この構造はscat−

tered dense bodies（SDB）と呼ばれており，渡

辺らがEAC receptor陽性細胞に高率に認められること，E−rosette陽性細胞にも一部認められると報告している19）．我々の経験した末梢性T細胞由

来の腫瘍細胞ではCDBあるいはSDBが認めら

れ，ゴルジ装置にも活性が認められた． 2．T・A旺細胞の酸性ボスファターゼ活性 T−ALLは4例（症例6，7，8，9）経験した．症例6は免疫学的検索からearly thymocyte，症

例7と8はcolnmon thymocyte由来，症例9は

late thymocyte由来であった．写真3は症例6の電顕像である．CDB構造を有しており，ゴルジ装置も酸性ホスファターゼ陽性であった．また， nuclear pocketなど核の異常も観察された．写真 4は症例9の電顕像で，酸性ホスファターゼ陽性のCDBとゴルジ装置を有している．症例7，8も

同様の所見であり，early thymocyte， colnmon thymocyte， Iate thymocyteでは酸性ホスファ

ターゼ活性の局在に差は認められなかった．

3．B細胞系のA旺細胞の酸性ボスファター

ゼ活性

J5陽性のcommon ALL（pre・pre−B ALL）の6

例およびcytoplasmicμchain陽性のpre−B ALL の1例について述べる．

写真5は症例10，common ALLの電顕像であ

るが，酸性ホスファターゼ陽性のライソゾームが 1∼2個存在した．ゴルジ装置には活性は認められなかった．他のcommon ALLの5症例も同様の所見であった．pre−B ALLの症例16の電顕像では，酸性ホスファターゼ陽性のライソゾームは認められず，ゴルジ装置も活性陰性であった．発達した粗面小胞体がB細胞への分化を示唆していた． 4．Unclassi丘ed A■L細胞の酸性ボスファターゼ活性 Unclassi丘ed ALLの症例8例中5例（症例17， 18，19，20，21）でcommon ALLの症例と同様の所見が得られた．症例17の酸性ホスファターゼ活性の電顕像では，酸性ホスファターゼ陽性のライソゾームが1∼2個程度認められた．ゴルジ装置には活性はみられない．写真6は症例19の電顕像であり同様の所見であった．症例20，2！も同様の電顕像であった．これらの症例のうち，症例17 の細胞はTdT， Ia抗原， OKT10は陽性だが， B1， B4， common ALL抗原は陰性であり，その帰属は明らかでない．症例18の細胞はTdTは陽性だ

が，Ia， Leu−1，0KT10，0KT9， common ALL 抗原は陰性であり，やはりその帰属は明らかでない．症例19，20，21はIa抗原とB4抗原だけが陽性

であった．B4はB細胞系のごく初期から発現する表面抗原であり，この3例はB細胞系へ分化して

いると考えられる．酸性ホスファターゼの活性も Ia， B4だけが陽性の群とIa， B4およびcommon

ALL抗原陽性の群とは差がなくこの点からもB

系へ分化していることが推定される． Unclassi丘ed ALLのうちCDBの認められた症例が3例（症例22，23，24）であった．写真7は症例22の電顕像である．CDBを有するがゴルジ装置には活性は認められなかった．この症例はIa， B1， B4， Leu−1陰性であり，T細胞系へもB細胞系へも分化を示唆する所見は認められなかった．しかし，皮膚浸潤，髄膜浸潤があるなど臨床所見はT−ALLに類似していた．またOKT9，10を同時に有していることなどからT細胞系の腫瘍と考えられLeu−1陰性のことからpre−Tよりも前の段階と考えられた．写真8は症例23の電顕像である． CDBを有しゴルジ装置にも活性が認められた．残念ながらB1， B4， Leu−1，0KTシリーズの検索は行っていないがIa陰性であり，酸性ホスファターゼの結果からT細胞系の腫瘍と思われる．症例24

(5)

赤星論文附図1

写真1 E−rosette陰性のATL（症例4）の酸性ホスファ．ターゼの電顕像

写真2 T・CLL（症例5）の酸性ホスファターゼの電顕像酸性ホスファターゼ陽性のSDBとGolgi装置（G）．

(6)

赤星論文附図II

四糊

写真3 Pre−T ALL（症例6）の酸性ホスファターゼの電顕像酸性ホスファターゼ陽性のCDBとGolgi装置（G）．

(7)

赤星論文附図HI

写真5 Common ALL（症例10）の酸性ホスファターゼの電顕像酸性ボスファタ一拝陽性のライソゾーム（矢印）．写真6 Unclassi五ed ALL（症例19）Ia， B4陽性群の酸性ホスファターゼの電顕像酸性ホスファターゼ陽性のライソゾーム（矢印）．一605一

(8)

赤星論文附図IV

写真7 T細胞系への分化が示唆されたunclassi且ed ALL（症例22）の酸性ホスファターゼの電顕像酸性ホスファターゼ陽性のCDB．蒙糊満騨 ∼ 層俺＼ ∼ 、騰覧篶癒．、・粋．建 ∼ひ

驚

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♂、噸集㌧．．

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騰騰

写真8 T細胞系への分化が示唆されたunclassi且ed ALL（症例23）の酸性ホスファターゼの電顕像酸性ボスファターゼ陽性のCDBとGolgi装置（G）．

(9)

も同様に，CDBを有し，ゴルジ装置にも活性が認められT細胞系の腫瘍と思われる．考察

従来から，正常のT細胞とB細胞の酸性ホス

ファターゼ活性の差が光顕および電顕レベルで報

告されてきた．酸性ホスファターゼは，β一

glucuronidaseやα一naphthyl acetate esterase （ANAE）に比べて，発生のごく初期の段階からT 細胞系に認められることから，T細胞マーカーの一つとされている22）．Sφndergaard−Petersen ら23）は光顕レベルで，白血病細胞の酸性ホスファターゼ活性を検索しているが，それには3種類のパターンに分類されている．（1）focal， granular，（2）universal， granular，（3）（1）と（2）のmixed patternである．（1）と（2）は電顕レベルではそれ

ぞれCDBとSDBに対応すると思われる．

末梢性T細胞由来であるATLとT−CLLにつ

いて考察すると，我々の経験したATLは全例

CDBおよびゴルジ装置に酸性ホスファターゼ活性を有していた．Matutesら24＞はATLの2例において酸性ホスファターゼ活性を電顕レベルで観察しているが，いずれの例も一つの細胞に1∼9 個のCDBと思われる反応陽性の顯粒を認めているが，ゴルジ装置の酸性ホスファターゼ活性には言及していない．一方，我々の経験したT−CLLで

はSDBを認め，ゴルジ装置にも酸性ホスファ

ターゼ活性が陽性であった．Matutesら24）はT−

CLLの例でSDBと思われる反応陽性の穎粒を認

め，ゴルジ装置に活性があると述べている．ATL において彼らがゴルジ装置の活性について述べていない理由は明らかでない．我国のATLと西イ

ンド諸島のATLの細胞に質的な差異があるの

か，彼らが単に気付かなかったのかは明らかでない．

我々の経験ではATLの全例にCDB，1例の

T−CLLでSDBを認めたが， CDBあるいはSDB

を有することがT細胞の亜集団と関係があるか否かは症例が少なく明らかではない．Shamoto ら25）はATL 13例を検索しているが，全例CDBが

認められており，ATLにはCDBが特徴的な所見

であると思われる．Amitageら26）はE＋μFcR＋細胞は集塊状局在性，E＋γFcR＋細胞は散在性に酸性ホスファターゼが陽性であると報告しているが，Bernardら27＞はT細胞の亜集団には関係なくすべて局在性に陽性であると異議をとなえており一定した見解は得られていない．T℃LLはさまざまな細胞の集団であり，今後SDBあるいはCDB の有無，ゴルジ装置の酸性ホスファターゼ活性との関係を明らかにしていきたい． T−ALLの3例において全例， CDB構造が認められ，ゴルジ装置にも活性が認められた．これは Catovskyら15）の報告に一致しているが，彼らは T−ALLをさらに各分化段階に分類して観察していない．我々の結果ではearly thymocyte由来， common thymocyte由来とlate thymocyte由来

では酸性ホスファターゼ活性の局在に差を認めなかった．

B−ALLは経験しなかったが， B細胞系由来の common ALL， pre−B ALLまたはunclassified

ALLの中でB4陽性の症例では， CDB構造を有する症例やゴルジ装置に活性を有する症例は認められなかった． pre−B ALLでは酸性ホスファターゼ陽性のライソゾームが認められず，この所見がpre−B ALL の細胞に特異的かどうかは1例のみのため不明である．Unclassified ALLのうち1例において TdTとIa抗原のみ陽性でB1， common ALL抗原，B4は陰性であった． Nadlerら3）はIa， B4陽性

ALL， Ia， B4， common ALL抗原陽性ALL， Ia，

B4， common ALL抗原， B1陽性ALLで免疫グロブリン遺伝子の再構成の検索を行っているが， Ia単独陽性ALLの検索は行っておらず， Ia単独陽性ALL細胞の1ineageは不明としている．我々の検索した酸性ホスファターゼ活性の結果からこの細胞起源はB細胞系であることが示唆される．しかし，この症例は．TdT陽性，ペルオキシダーゼの電顕細胞化学は陰性であるが，myeloid antigen の検索を行っていないのでmyeloid系の可能性も否定でき．ない．また血小板ペルオキシダーゼ，抗血小板抗体の検索も行っておらず，巨核球系も否定できない．今後このような症例の細胞起源を決定するためにはそれらを総合して決定する必要一607一

(10)

があると思われる．

現在1ymphoid stem cellからpro−T cellさらにearly thymocyteへの分化の過程は詳細には明らかにされていない．酸性ホスファターゼが β一glucuronidaseやANAEに比べ発生のごく初期の段階から認められることから23），免疫学的にはunclassi且ed ALLとされる症例のなかにCDB を有する症例が3例あったことは，これらの症例ではT細胞へ分化していた可能性が考えられる．しかし，残念ながらこのうち症例21でしか詳しい免疫学的検索が行われなかった．本例はB1， B4， Leu−1はいずれも陰性で， B細胞系， T細胞系への分化を示すマーカーは有していなかったが，Ia抗原陰性である点とOKT9，0KT10の両方が陽性である点と，臨床的に皮膚浸潤，髄膜浸潤が認められた点からT細胞系由来の細胞である可能性が示唆された．したがって，酸性ホスファターゼの活性が，免疫学的に認識できるT細胞の最も幼若な細胞，すなわち，pre−T細胞よりもさらに幼若な細胞を認識している可能性が考えられた．このような症例が，T細胞への分化段階の細胞に由来するか否かは，遺伝子レベルでの解析28）29）や，より詳細な免疫学的解析30＞が必要と考えられる．総括

ATL 4例， T−CLL 1例， T−ALL 4例， common ALL 6例， pre−B ALL 1例， unclassi丘ed ALL 8

例で電顕細胞化学の手法を用いて検出した酸性ホスファターゼ活性を検討した．T細胞のマーカー

をもつものは9例全例，CDBあるいはSDBが認

められた．またゴルジ装置にも活性が認められた。 Unclassified ALLのうちB4が陽性の場合，あるいはcommon ALL抗原， B1などが陽性の場合，すなわち，B細胞系へ分化している症例ではCDB は認められず，またゴルジ装置も活性が陰性であった．Unclassi丘ed ALLと分類された症例の中

で3例でCDBを認めた．その中の1例でさらに

詳しい免疫学的検索がなされたが，細胞起源は不明であった．稿を終えるにあたり，御助言を賜りました滝沢敬夫教授に感謝の意を表します．また，直接御指導，御校閲を賜りました溝口秀昭教授，押味和夫助教授に心より感謝申し上げます．文献

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