膵癌細胞における

博 士 （ 医 学 ） 夏 井 坂 光 輝

学 位 論 文 題 名

膵癌細胞における

AMP‑activated protein kinase (ArvIPK)  iJ 学位論文内容の要旨

【背景】腫瘍が生体内で増殖しその腫瘍径が大きくなると，腫瘍への血液供給が腫瘍の需 要 に 追い っ か なく な る ．結 果 と して 腫 瘍 の一 部 は 低 酸素 ・ 低 栄養 環 境 に曝 される．

Hypoxia‑inducible factor‑l (HIF‑I)を介した癌細胞の低酸素適応応答に関しては多くの研 究がなされており，低酸素環境が腫瘍の増殖，進展，悪性化と深く関わっていることが明 らとなった．一方，低酸素適応応答のみならず低栄養適応応答も生体内の腫瘍においては 必須であると考えられるが，癌細胞の低栄養適応応答に関する検討は少ない．また，現在 まで にHIF‑1に より制 御される遺伝子は50種類以上報告されているが，低酸素・低栄養環 境にある生体内の腫瘍においてこれらの全ての遺伝子が重要であるかは明らかにされてい なぃ．

【 方 法 と 結 果 】 膵 癌 細胞3株(MiaPaCa2，BxPC3，PCI43)を 正 常 酸 素・ 正 常 グル コ ー ス， 正常酸素 ・低グ ルコース，低酸素・正常グルコース，低酸素・低グルコースの4条件 の下 で培養し 遺伝子 発現の変化をreal‑time PCRを用いて詳細に検討すると，低酸素・低 グルコースで発現亢進するものはアドレノメジュリン，VEGF，Glutl，Glut3，hexokinase2 の5遺伝子 のみで あった． これらの遺伝子の発現はグルコース濃度下げることで濃度依存 的に 発現が亢 進した ．また，低酸素による遺伝子誘導は培養開始6時間後に既に認められ たのに対し，低グルコースに対する反応は培養開始12時間以降に認められた．低グルコー スがHIF‑1の蛋 白量に 与える影響をウェスタンブロットにより確認したが，低酸素・低グ ル コ ー ス 下 で はHIF‑1の 蛋 白 量 は む し ろ 減 少 し て い た． ま た ，HIF‑1の 転 写 活性 を hypoxia‑response elementを含むレポーターベクターを用いてルシフェラーゼアッセイに より 検討した が，低 グルコースにすることでHIF‑1の転写活性は低下した．それゆえ，低 グルコースに対する膵癌細胞の反応にはHIF‑1以外の因子が関与しているものと考えられ，

本 研 究で はAMP‑activated protein kinase (AMPK)に 着目し た．AMPKの 阻害剤で ある CompoundCで膵癌 細胞を処 理する と膵癌細 胞の低酸 素・低 グルコー スに対 する反応が有 意 に 抑 制 さ れ た ．AMPKのcatalytic subunitであ るAMPKaに 対す るsiRNAを作 製 し 阻 害実 験を行っ たが，CompoundCを 用いた実 験と同様 に膵癌 細胞の低 酸素・ 低グルコ←ス に 対 する 遺 伝 子誘 導 が有意に 抑制さ れた，VEGFのプロモ ーター領 域をク ローニン グし VEGFの転写状態をルシフェラーゼアッセイにより検討すると，低酸素・低グルコース下で のルシフェラーゼ活性が最大であり，低酸素・低グルコースによる膵癌細胞の遺伝子誘導 にはAMPKを介し た何らか の転写レ ベルで の関与が 示唆された．生体内の腫瘍においても

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AMPKが 実 際 に 活 性 化 さ れて いる かをSCIDマウ スの 皮下 に膵 癌 細胞 株(MiaPaCa2)を移 植し，リン酸化AMPKaの免疫染色により確認した．低酸素領域のマーカーであるピモニダ ゾールも同時に使用したが，ピモニダゾールは壊死組織周囲や血管から離れた場所におい て強 く発 現し てお り腫 瘍へ の血 液供 給 の少 ない 領域 を正確に反映していた．リン酸化 AMPKaも低酸素・低 栄養環境にあると考えられるピモニダゾール発現領域にほば一致して 強く発現していた．

【考察】生体内の腫瘍環境は低酸素のみならず低栄養環境にもあり，低酸素・低栄養環境 下で発現亢進してくる遺伝子が腫瘍の生存，増殖にとって重要な遺伝子であると考えられ る，今回の研究では一部の低酸素誘導遺伝子のみが低酸素・低グルコース環境で発現亢進 することを初めて見出した．こうした低酸素・低グルコース環境下で発現亢進してくる遺 伝子産物は腫瘍の生存，増殖にとってより重要で必須な働きをしていると考えられる，今 回の検討では既知の低酸素誘導遺伝子の中で低酸素・低グルコースにより発現亢進するも のは アド レノ メジ ュリ ン，VEGF，Glutl，Glut3，hexokinase2の5遺伝子であった．血 管新 生因 子(VEGF， アド レノ メジ ュリ ン） ，糖 輸送 体（Glutl，Glut3） ，解 糖系酵素 (hexokinase2）であるこれらの遺 伝子が低酸素・低グルコースにより亢進することは低 酸 素 ・ 低 栄 養 環 境 下 に あ る 癌 細 胞 に と っ て 非 常 に 合 理 的 で あ る ．   低酸素・低グルコース環境が遺伝子発現を亢進させるメカニズムは現時点では明らかと なっていなぃ，今回の検討で示したように低酸素・低グルコースによる遺伝子誘導はHIF‑1 を介さない経路によっても制御されている可能性が高く，本研究ではその制御因子の候補 と し てAMPKに 着 目 し た ，AMPKはAMP/ATP比 に よ り 活 性 化 さ れ る 酵 素 で あ り ， 細 胞 内のエネルギーセンサーとして働 いている．今回の検討ではAMPKは低酸素・低グルコー ス下 でそ の活 性が 最大 であ り， 阻害 剤 やsiRNAを用 いてAMPKの活 性 を阻 害す ることで 低酸素・低グルコース下における 遺伝子誘導が抑制された，これらの結果はAMPKを介し た経路が癌細胞の低酸素・低グルコースによる 遺伝子誘導機構においてHIF‑1経路と同様 に重 要な 役割 を担 って いる 可能 性を 示 して いる ．ま た，AMPKを阻害することでVEGFの みならず低酸素・低グルコース誘 導遺伝子であるアドレノメジュリン，Glutl，Glut3， hexokinase2の低酸 素・低グルコースによる遺伝子発現亢進も阻害された．本研究はAMPK を含む経路を介した低酸素・低グルコース適応応答には多くの重要な遺伝子が含まれてい ることを示唆している．一方でAMPKの下流には何らかの転写に関わる因子の存在が推測 されるが，その同定には至ってい なぃ．AMPKを介した低酸素・低グルコース適応応答機 構に関しては今後更なる検討が必要であると考 えられる．

  本 研究 では 血vitroの 実験に加 えて，実際の生体内の腫瘍においてもAMPKが活性化さ れていることを動物実験により確 認した．また，AMPKが欠失した腫瘍細胞を用いてAMPK が生体内の腫瘍増殖に必要であることも報告されている．これらは生体内の腫瘍において もAMPKが 重 要 な 役 割 を 担っ てい るこ とを 示唆 して おり ，癌 治 療の 標的 とし てのAMPK の可 能性 も考 えら れる ．し かし ，逆 に 腫瘍 抑制 因子 であるLKB1がAMPKを活性化するこ とや ，同 じく 腫瘍 抑制 因子 であ るTSC2がAMPKに より 活性化されることが報告されてお り ，AMPKを 癌 治 療 の 標 的 と す る こ と に は 更 な る 検 討 が 必 要 と 思 わ れ る ．

【結語】今回の検討によりAMPKが 低酸素・低栄養誘導遺伝子の制御因子である可能性が 示唆された，低酸素・低栄養誘導遺伝子の制御機構は癌治療の標的となる可能性もあり，

今後更なるメカニズムの解析が待たれる．

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学位論文審査の要旨

     学位論文題名 膵癌細胞における

AMP‑activated protein kinase (AMPK) (i) IJ

   本研究では生体内の腫瘍が低酸素・低栄養環境にあることに着目し、低酸素・

低栄 養環 境が 癌細 胞に 与え る影響 に関 して 主に 膵癌細胞株を用いて検討した。

癌 細 胞 株 を 低 酸 素 ・ 低 グ ル コ ー ス 環 境 下 で 培 養 す る と Hypoxia inducible factor‑l (HIF‑I) により制御される遺伝子 （低酸素誘導遺伝子）の一部のみが更 に発 現亢 進し 、こ れら の遺 伝子が 生体 内の 腫瘍 において重要である可能性が示 唆さ れた 。低 酸素 によ る遺 伝子誘 導と 低グ ルコ ースによる遺伝子誘導は経時的 変化 が異 なり 、ま た、 低グ ルコ ース 環境 下で はHIF‑1 の 蛋白 発現 量及 び転 写活 性が むし ろ低 下す るこ とか ら低 酸素 ・低 グル コー スに よる遺 伝子 誘導 はHIF‑1 以外 の因 子も 関与 して いる と考 えら れた 。本 研究 では AMP‑activated protein kinase (AMPK) を 含む 経路 が癌細 胞の 低酸 素・ 低グ ルコ ース によ る遺 伝子 発現 を 制 御 し て い る こ と を 見 出 し た 。 AMPK を 阻 害 剤 や siRNA に よ り 阻 害 す る と 癌細 胞の 低酸 素・ 低グ ルコ ースに よる 遺伝 子誘 導が有意に抑制された。更に生 体 内 の 腫 瘍 に お い て も AMPK が 活 性 化さ れ て い る こ と が 免 疫 染 色 に よ り 確 認 され 、低 酸素 ・低 栄養 適応 応答が 生体 内の 腫瘍 においても重要であることが示 唆された。

   口 頭発 表に 際し 、副 査の 畠山教 授よ り低 酸素 ・低グルコースにより誘導され る 遺 伝 子 で 膵 癌に 特 異 的 な 遺 伝 子は あっ たか 、AMPK の りン 酸化 酵素 は同 定さ れて いる かに 関し て質 問が あった 。こ れに 対し 申請者は今回の検討では膵癌に 特異 的な 遺伝 子は 無か った が低グ ルコ ース に対 する遺伝子発現亢進は膵癌細胞 株 で 著 し か っ た こ と 、 ま た 、 AMPK の り ン 酸 化 酵 素 と し て LKB1 が 近 年 報 告 さ れ た が 、 LKB1 は 腫 瘍 抑 制 因 子 で あり LKB1 の み で は 低 酸 素 ・ 低 栄 養 適 応 応 答は 説明 がっ かず 今後 の検 討課題 であ ると 回答 した。次いで副査の守内教授よ り 生 体 内 の 腫 瘍 で は ア ミ ノ 酸 も 低 下し て い る が ア ミ ノ 酸 の 低 下 も AMPK の 活 性 に 影 響 を 与 える か 、 AMPKal と oc2 の 機 能 の違 い に 関 し て 質 問 があ った 。こ れ に 対 し て 申 請 者 は ア ミ ノ 酸 の 低 下が AMPK を 活 性 化 す る こ と は 既 に 報 告 さ れて いる が、 生体 内の 腫瘍 で血液 供給 が低 下す るとアミノ酸よりもまずグルコ

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ースが低下すること、また、低酸素環境では嫌気性代謝が主となルグルコース の重要性 が高くなる ことから本 研究では低 グルコース環境を用いたこと、

AMPKocl と a2 の 違いに関しては細胞内の局在が異なる点、酵素活性の違い等 が既に報 告されてい るが低酸素 ・低栄養適 応応答におけるAMPKal とa2 の機 能の違いに関しては今後の検討課題であると回答した。守内教授からは AMPK がDNA microarray では同定できなかったことに関して網羅的な遺伝子解析の 限界であろうと御意見も頂いた。主査の浅香教授から生体内の腫瘍において低 栄養環境が低酸素環境と同程度に重要であるのか、AMPK を標的とした治療が 臨床応用できる可能性も含めて今後の膵癌治療の展望に関する質問があった。

これに対し申請者は生体内の腫瘍で血液供給が低下すると低酸素環境のみなら ず必然的に低栄養環境にもなり、グルコース濃度に関しては実際の生体内の腫 瘍で低下していることが報告されていること、しかし HIF‑1 を中心とした低酸 素適応応答に比べると低栄養適応応答に関しては未知な点が多くその重要性に 関しては今後更なる解析が必要であると回答した。AMPK を癌治療の標的にで き る か に 関 し て は AMPK が 腫 瘍 増 殖に 必 須 であ る との 報 告が あ る一 方 で AMPK の活 性化剤 である AICAR に抗腫瘍効 果があると の報告もあ り、癌細胞 における AMPK の機能に関しては現時点では controversial である点、また、

AMPK はユビキ タスな酵素 で正常細胞 においても 細胞のエネルギーセンサー として重 要な役割を 担っている ことから副 作用の面で AMPK を直接の標的と することは困難であろうと回答した。．また、低酸素・低栄養による遺伝子発現 亢進は正常細胞株である 293 細胞では認められず、低酸素・低栄養適応応答が 癌細胞に特異的で癌治療の標的となる可能性はあるが、癌細胞にはその他の多 くのストレス経路も関与しており単一の経路を標的とした治療には限界もある であろうと回答した。

   本研究は生体内の腫瘍において低酸素適応応答と同様に低栄養適応応答が重 要で あ り 、 HIF‑1 経路 とともにAMPK を含 む経路が低 酸素・低栄 養適応応答 を制御していることを明らかとした。本研究を足掛かりとして癌細胞の低酸 素・低栄 養適応応答 の解析が進 み癌治療ヘ 応用されることが期待される。

   審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得

単位なども併せ、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有す

るものと判定した。