博 士 （ 医 学 ） 高 木 智 史
学 位 論 文 題 名
膵管癌の上皮内癌部におけるp 53 遺伝子変異の検討
p53 Gene Mutation in Carcinoma in Situ of Pancreatic Adenocarcinomas
学位論文内容の要旨
【背景と目的】
膵 管 癌は ，予 後の 悪い 癌と して 知ら れて いる ，症 状出現時には，手術不能であるこ とが 多 く， たと え手 術が 可能 であ った とし ても その5年生存率は5％未満と報告されて いる，長期生存に寄与する最善 の方法は，早期発見による癌組織の外科的完全切除と考 えられるが，症状が出現する前 に発見することはきわめて困難である．膵管癌の発癌機 序 の 解 明 か ら ， 早 期 発 見 に 役 立 つ 手 が か り が 得 ら れ る 可 能 性 が あ る ． 癌 遺 伝子 であ るK−rasの変 異は ，膵 管癌 にお いて 高頻度に認められることは，以前 よ り 知 ら れ て い る ． 癌 抑 制 遺 伝 子 で あ るp53遺 伝 子の 変異 の頻 度は38.4％か ら76％ としゝう報告まで様々である， これらの幸胎のなかで膵管癌の浸潤癌部については詳細に 報告されているが，浸潤癌にい たる前癌病変については，十分に検討されていない，膵 管癌においても他臓器癌と同様 に多段階的に発癌にいたると考えられており，過形成か ら， 異 型性 を伴 った 過形 成， 上皮 内癌(carcinoma in situ，CIS)を経て浸潤癌にいた ると さ れて いる ．先 にも 述ぺ たよ うにp53遺 伝子 変異 につ いて は浸 潤癌 では 検討され てい る が， 上皮 内癌 部に おけ るp53遺伝 子変 異に つい ては 十分 に検 討さ れて いない．
こ の 研 究 の 目 的 は ， 膵 管 癌 の 上 皮 内 癌 部 のp53遺 伝子 変異 を検 討す るこ とで ある ．
【方 法と 結果 】
対 象 は21症 例 で ， 男 性10症 例 と 女 性11症 例 で あ り ， 平 均 年 令 が66.0歳 く34‑84 歳）であった．外科切 除膵管癌を対象とし，ホルマリン固定，バラフィン包埋 された標 本を 用い て検 討し た，Hematロxylen−eosin (HE)染 色にて，上皮内癌部を認 め，浸潤 癌 部 が 近 接 し て い る 切 片を 選択 した ， これ らの 症例 は，1976年か ら1998年 まで 新潟 大学 医学 部第 一病 理学 教室 にお いて 通常 型(solid type)の膵管癌と診断され た症例か ら 選 ば れ た ．p53に 対 す る モ ノ ク 口 ナ ー ル 抗 体Pab 1801を 用 い てp53免 疫 染 色 を行 っ た 後 ，microdissection法 に よ りDNAを 抽 出 し ，PCR‑SSCP法 を 用 い てQく くm5か らexon8まで のp53遺伝 子変 異を 検索 した ，
上 皮 内 癌 部 でp53蛋 白 の 過 剰 発 現 を 認 め た の は ，21症 例 中7症 例(33.3％ ） で あ り ， 浸 潤 癌 部 でp53蛋 白 の 過 剰 発 現 を 認 め た の は21症 例 中10症 例(47.6％ ） で あっ た ， 上 皮 内 癌 部 で の 陽 性 例 は ， 浸 潤 癌 部 で も す ぺ て 陽 性 を 示 し た ． p53遺 伝 子 異 常 は ，21例 中6例(28.6％ ） に 認 め ら れ た ． こ の う ちp53蛋 白 の 過 剰 発 現 を 認 め た7例 中4例(57.1％ ） にp53遺 伝 子 異 常 を 認 め た ，P53蛋 白 の 過 剰 発
現 を 認 め な か っ た14症 例 中2症 例(14.2％ ） にp53遺 伝 子 異 常 を 認 め た ， 上 皮 内 癌 部 と 浸 潤 癌 部 で 共 にp53蛋 白 の 過 剰 発 現 を 認 め ， 上 皮 内 癌 部 にp53遺伝 子 異 常 を 認 め た 症 例 に おい て ，DNAシ ーク エン スを 行っ た とこ ろ，3力 所の 上皮 内癌 部 の う ち の1力 所 で の み 遺 伝 子 異 常 が 明 ら か と な っ た ．
【考案】
今回 の検 討で ，上 皮内 癌部 にお い て，p53蛋白 発現 と遺 伝子 異 常が 合致 した例が21 例 中16例 に 認 め ら れ た， 蛋 白陽 陸， 遺伝 子異 常を 認め た4例 は， 変異 型p53と なり ， p53蛋 白 を 分 解 に 導 くMDM2の 誘 導 が 行 わ れ な い た め ，p53が 核 内 に 蓄 積 し ， 免 疫 染 色に より 検出 され たも のと 考え ら れた ，p53蛋 白の 過剰 発現 を のみ を認 め，遺伝子 異 常 を 認 め な か っ た3例は ，そ の原 因と して ，野 生型p53蛋 白が 蓄積 した ，免 疫染 色 と 実際 にmicrodissectionを行 った 部位 とは ，切 片上 異な るた め ，正 確に その性状を 反映していなかっ た，遺伝子検索をした他の部位に変異があった，ことな どが考えられ た ．蛋 白の 発現 がな く， 遺伝 子異 常 を認 めた2例 は， 蛋白 構造 を 維持 でき ないフレー ムシフト変異など の変異をきたしているものと考えられた．
p53遺 伝 子 異 常 を 検 索 す る の に ， 免 疫 染 色 法 とmicrodissectionに よ り 抽 出し た DNAを 用 い て ，PCR←SSCP法 に よ り 検 索 し た ． 免 疫 染 色 法 は ， 簡 便 で 迅 速 な 方法 で あ る が ， 抗 体 と し てp53モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体Pab 1801を用 いた 場合 ，蓄 瞶し た蛋 白 が野生型か変異型 かはその判別は不可能である．また，フレームシフト変 異などの変異 を き た し ， 蛋 白 の 構 造の 変 異を きた した 場合 も検 出す るこ とが でき ない ．し かし ． PCR‑SSCP法 の み の 検 索で は ，他 の部 位も 含め た検 討も 必要 とな る場 合が あり ，相 補 的に用いるのが有 用であると考えられた．
DNAシ ー ク ェ ン ス を 施 行 し た 症 例 は ， 上 皮 内 癌 部 で は ，p53免 疫 染 色 に お いて ， ぴ陸I生の過剰発現を示し同等の染包態度を示 していたが，実際に遺伝子変異を検索して み た と こ ろ ，p53遺 伝 子 異 常 を 指 摘 で き た の は ，3力 所 の上 皮内 癌部 のう ちの1力 所 のみであった．同 一瑚重瘍内で染色態度が同じであっても，実際に遺伝子変異を検索して み るとheterogeneityが認 めら れた ．蛋 白蓄 積が 認め られ ても ， 野生 型で 蓄積する場 合と変異型で蓄積 する場合があると考えられた．
今 回 の 検 討 か ら ， あ る 症 例 に お い て は 早 期 の 段 階(CIS)か らp53遺 伝 子 変 異が 一 部 に起 こり ，癌 化に 関与 する 場合 が ある こと が判 明し た．P53遺 伝子 変異 をきたした 膵 管癌 は予 後が 悪い とい う報 告が あ るが ，上 皮内 癌の 段階 でp53遺伝 子変 異をきたし た 場 合 ，ZE,I｜ 生 度 が 高 く ， 容 易 に 浸 潤 癌 に 移 行 す る 可 能 陸 も 考 え ら れ た ．
【結諭】
膵 管 癌 の 上 皮 内 癌 部 に お け るp53遺 伝 子 異常 を検 討し たIp53遺 伝子 変異 が早 期 の 段 階 か ら ， 膵 管 癌 の 癌 化 に 関 与 す る 場 合 が あ る こ と が 示 さ れ た ． p53遺 伝 子 変 異 は ， 免 疫 染 色 法 ，PCR‑SSCP法 の 両 法 を 用 い て 検 索 す る 必 要 が あ る ． 膵 管 癌 の 癌 化 に 際 し ， 上 皮 内 癌 の 一 部 に 早 期 の 段 階(CIS)か らp53遺 伝子 異 常 が関与している場合があり，上皮 内癌間には悪I生度の差異が存在することが明らかにで きる可能性がある，
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
膵管癌の上皮内癌部における p 53 遺伝子変異の検討
p53 Gene Mutation in Carcinoma in Situ of Pancreatic Adenocarcinomas
膵管癌は、悪性腫瘍の中でも予後の悪い癌として知られている。長期生存に寄与す る最善の方法は、早期発見による癌組織の外科的完全切除と考えられるが、症状が出現 する前に発見することはきわめて困難である。膵管癌の発癌機序の解明から、早期発見 に役立つ手がかりが得られる可能I生がある。
膵管癌は、病理組織学的な研究より、過形成から異型性を伴った過形成、上皮内癌 (carcinoma in situ，CIS)、浸潤癌にいたると考えられている。癌抑制遺伝子であるp53 遺伝子の変異については、浸潤癌では詳細に検討されているが、浸潤癌にいたる上皮内 癌については、十分に検討されていない。この研究の目的は、膵管癌の上皮内癌部のp53 遺伝子変異を検討することである。
対象は、男 性10例と女 性11例の外 科切除膵管癌21例であり、平均年令が66.0歳 (34一84歳）であった。ホルマリン固定、バラフイン包埋された標本を用いて検討し た。上皮内 癌部を含む切片を選択し、p53モノク口ナール抗体Pab1801を用いてp53 免疫 染 色 を行 っ た 後、micrO出ssection法 によ り 上皮 内 癌 部のDNAを抽 出 じ 、 PCR￣SSCP法を用い てQくく）n5からQくく 冫n8までのp53遺伝子変異を検索した。
p53免疫染色陽性であったのは、上皮内癌部で21例中7例（33．3％）であり、浸 潤癌部では21例中10例（47．6％）であった。上皮内癌部での陽陸例は、浸潤癌部で もすぺて陽性を示した。
p53遺伝子変異は、21例中6例（28．6％）に認められた。免疫染色陽性であった 7例中4例（57．1％）に、免疫染色陰性であった14例中2例（14．2％）にp53遺伝子 変異を認めた。
蛋白陽性、遺伝子異常を認めた4例は、変異型p53蛋白が蓄積し、免疫染色により 検出されたものと考えられた。蛋白の発現がなく遺伝子異常を認めた2例は、フレー ムシフト変異などの蛋白構造を維持できない変異をきたしたため抗体により認識されな かったと考えられた。p53蛋白の過剰発現のみを認め、遺伝子異常を認めなかった3 例は、その 乖離の原因として、野生型p53蛋白が蓄積したこと、免疫染色と実際に micr0出ssectionを行った部位とは切片上異なるため正確にその性状を反映していな
博 男
之
澄
正 眞
紘
香 川
藤
浅 細
加
授 授
授
教 教
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査 査
査
主 副
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かった こと、遺 伝子検索 をした他の部位に変異があったことなどが推定された。
p53遺伝子 変異は， 免疫染色 法，PCR‑SSCP法の 両法を相補 的に用いて検索する のが有用であった。上皮内癌の一部に早期の段階からp53遺伝子異常が関与している 場合があり、上皮内癌間には悪性度の差異が存在することが明らかにできる可能性があ ると考えられた。
公開発表に際し、副査の細川教授から、症例の頻度と膵管癌の進展の仕方について 質問された。申請者は、膵管癌は通常、膵管上皮から発生すると考えられており、発育 進展に伴い膵管上皮を破壊し浸潤癌にいたる場合が多いと述べた。また新潟大学医学部 第一病理学教室において、1976年から1998年までに通常型膵管癌と診断された症例 は約400例あるが、上皮内癌を含む症例で標本の保存状態が良好で遺伝子解析が可能 であったのは50例前後でありそれほど頻度は高くないと説明した。続いて、副査の加 藤教授から、膵上皮内癌部について他の遺伝子について検索していないかとの質問があ った。申請者は、p16遺伝子の免疫染色を試みたが、評価に値する結果が得られなか ったと述ぺた。最後に、主査の浅香教授から、将来的に膵管癌のp53遺伝子治療が行 われるとしたら、効果はどう推定されるかという質問があった。申請者は、今回の検索 から膵浸潤癌ではp53遺伝子変異をきたしている症例の頻度が約50％程度であるた め箸効は期待できないのではないかと答えた。
本研究では、膵管癌の一部についてはp53遺伝子変異が早期の段階から関与してい ることを明らかにし、今後膵管癌の発癌機序の解明並びに遺伝子治療等の臨床応用に寄 与していく可能I生が期待された。以上より、審査員一同は、この研究を高く評価し、大 学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに 充分な資格を有するものと判定した。
