博 士 （ 医 学 ） 三 関 哲 矢
学 位 論 文 題 名
DNPim ― 1 は SCID マウ スにおける 膵癌細胞のin vivo 増殖を抑制する
学位論文内容の要旨
【目的と背景】
低酸素条件下ではHypoxia inducible factor‑l(以下HIF‑1)の発現が亢進し、下流にある さまざまな適応応答遺伝子の発現を介して低酸素環境に適応している。そこで、低酸素下 で発現が亢進してアポトーシス抵抗性となる遺伝子を二次元電気泳動によって網羅的に探 索した。
当初マウス自血病ウイルスのproviral insertionによって活性化するproto‑oncogeneと して同定 されて いたPim‑lが低酸 素下で発 現亢進することが見出された。Pim￣1はserme threonine kinaseの一種で、抗アポトーシス作用を持つことが報告されていた。従って低 酸素下で 固形癌 に強発現したPim‑lが低酸素ストレスから細胞を保護する可能性が予想さ れ た 。 予 想通 り 実 際癌 細 胞 が低 酸 素 下で 抗 癌 剤耐 性 を 獲 得し 、dominant negative Pim‑l(DNPim‑l)導入株 では低 酸素下で 獲得した抗癌剤耐性が消失することが最近Cancer Resに報 告され た。この 報告はPim‑lがア ポトーシス抑制のみならず固形癌の自然耐性に 関与して いる可 能性を示 唆する ものであ った。またPim‑lは、DNPim‑l導入株の造腫瘍性 が失われることから固形癌のin vivoの腫瘍増殖にも必須な因子である可能性が示唆されて いる。そ こで、 申請者はDNPim‑lを 用いた治 療法と して、11個 のアル ギニンを融合させ たDNPim‑lによる遺伝子治療の可能性について検討した。
【材料と方法】
1．低 酸素下 で処理し た腫瘍細 胞株か らPim‑lを検出した。2．DNPim‑l発現vectorを作成 し、DNPim‑l細 胞 株 を樹 立 し た 。DNPim‑l導入 株 をSCID mouseに 移植し 、腫瘍増 殖を 検討した。3． tet‑on systemにDNPim‑lを組み込み、Hela細胞に導入し、テトラサイクリ ンの有無1こ よる腫瘍 増殖を検 討した 。4． llR‑DNPim‑1+P3X FLAG CMV14を作成し、293 細胞 に 導 入し、DNPim‑lの発 現を確 認した。 また、lOnMのりコン ビナン トllR‑DNPim‑l を含 む 培 地でHelaを 処 理し 、 細 胞 内よ りDNPim‑lを 検 出し た 。5．膵 癌細胞 株をSCID mouseの 背 部 皮下 に 移 植し た 膵 癌 モデ ル を 作成 し 、llR‑DNPim‑1+P3x FLAG CMV14を 大腿筋内に投与し、腫瘍増殖を検討した。6．腫瘍組織の増殖及ぴアポトーシスを免疫組織学 的に検討した。
【結果 】
1． PCI‑43、PCI‑10、HCT‑ 116すべて において 、低酸 素下でPiml蛋白の発 現が亢進 し た 。2. DNPim‑l細 胞株 （3ク ロー ン ）とVector control株をSCID mouseの 皮下に 移植 し た と ころ 、DNPim‑l株 移 植群3群 の腫 瘍 が 完 全に 消 失 した 。3．Tet‑on DNPim‑l導 入株をSCID mouseの背部 皮下に 移植し、 移植5日後よ り14日連続 でドキシサイクリンを SCID mouseに投 与した。 ドキシ サイクリ ンを投 与したDNPim‑l細胞 株のみ明らかな腫瘍 体 積の 縮 小を認め た。4． llR‑DNPim‑1+P3X FLAG CMV14を293細胞に発 現させる と、
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細 胞 溶解 産 物 と培 養 上 清の い ず れか ら もllR‑DNPim‑l‑FLAG蛋白が検 出された 。5．リ コ ン ビナ ン トllR‑DNPim‑l‑FLAG発現 蛋 白は 、主に細 胞質内 に存在し た。6．腫瘍 に対 する 効果を検 討した ところ、(A) negative control群では腫瘍は増殖し続けた。他の3群 ((B)DNPim‑1 500Hg群 、(C)DNPimー11000ロg群、(D)positive control群） の腫瘍は い ずれ もほぼ完 全に退 縮した。B‑D群は いずれ もA群に対して有意差をもって腫瘍体積の減 少 を 認め た 。7．Anti‑FLAG免 疫染 色 で はDNPim‑l群、negative control群両群共 に大 腿筋に投与されたvectorにより生成されたペプチドが腫瘍細胞内に移行していた。増殖細 胞フラクションを示す抗MIB‑1抗体陽性細胞は、negatjve control群、DNPim‑l群、positive
control群のいず れも陽性で、各群に有意差を認めなかった。アポトーシス細胞を示す抗
single strand DNA (ssDNA)抗体陽性細胞は非常に少なく、各群に有意差を認めなかった。
【考察】
Pim‑lの 機能をknock downしたDNPim‑l stable transfectantは全く造腫瘍性を失って おり、in vivoの膵癌細胞の生存、増殖にPim‑lの機能が必須である可能性を示唆していた。
Tet‑on systemを用いて腫瘍が生着してからPim‑lの機能を消去したところ、腫瘍が有意差 をもっ て縮小し ており 、腫瘍組 織が大きくなった状態でも生存や増殖に関してPim‑lの機 能が必 須である こと、 また、持 続的にPim‑lの作用を阻害することで抗腫瘍効果が得られ る可能性が考えられた。
次にPim‑.lの機能を持続的に阻害する治療法として、11個のアルギニンとの融合蛋白が 細 胞 内 に 入 る こ と を 利 用 し たllR‑DNPim‑l蛋 白 を 発 現 す るllR‑DNPim‑l/P3X FLAG CMV14発現 ベ ク ター の 大 腿筋 への筋 肉内投 与を行っ た。発 現ベクタ ーにはPim‑lが分 泌 さ れ る よ う にTPO signal peptideを 組 み 込 ん で 作 成 し た 。llR‑DNPim‑l/P3XFLAG CMV14発 現ベクタ ーによ って筋肉 細胞内で産生された蛋白は細胞外に分泌され、血流に乗 って全 身に分布し、腫瘍組織にも到達していると予想していたが、実際に免疫染色によっ て確認 された。発現された蛋白は全身にくまなく分布すると予想されるが、癌組織のみが 低酸素 下にある ため、Pim‑l蛋白 は癌組織を中心に発現していると予想され、癌組織を中 心にPim‑lの 機 能が 抑 制 され る と 考え ら れ る。 こ のllR‑DNPim‑l/P3X FLAG CMV14の 筋肉内 投与によ り得ら れた抗腫 瘍効果の 機序に ついてMIB‑1、ssDNAを用いた免疫染色に て検討 したが、 両者共 に3群 間で全く 差が出 なかった 。この 事実はDNPim‑l導入株が、低 酸素低 グルコー ス下で アポトー シスしや すくな るという 以前の結果とは矛盾していた。
Pim‑lはAkt/mTORの 系を 介 し て、BCL familyの ー員 で あ るBadのり ン 酸 化を 引 き起 こし、anti‑apoptoticに働くということが報告されており、本実験でも明らかに腫瘍細胞の 縮小を 認めたことから、腫瘍の縮小がアポトーシスによる細胞死によってもたらされると 考え た 。 し かし 、 本 研究 で 示 した と お り、llR‑DNPim‑1+P3X FLAG CMV14で得られ た 抗腫瘍 効果は、アポトーシスによるものであることを確認できなかった。アポトーシスで はない と考える ならば 、細胞死 に至る別の経路を考慮に入れる必要があり、DNPim‑lの抗 腫瘍効 果については更なる検討が必要と思われる。抗腫瘍効果のメカニズムは不明である が 、 遠 隔 部 位 に 投 与 し たnaked DNAで 腫 瘍 縮小 効 果 が 得ら れ た こと お よ びHelaで の DNPim‑l導入によ る腫瘍 退縮とを 考慮す ると、llR‑DNPim．1発現ベ クター による遺 伝子 治療法が膵癌のみならずあらゆる固形癌の有用な治療のーっとなりうることが示唆された。
【結語】
llR‑DNPim‑l発 現ベクタ ーの筋 肉内投与 で抗腫 瘍効果を 示した ことから ，llR‑DNPim‑l を利用し た遺伝 子治療の 可能性 が示唆さ れた．
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
DNPim ― 1 は SCID マウス における 膵癌細胞のin vivo 増殖を抑制する
低酸素条件下ではHypoxia induciblefactor．1mIF．1）の発現が亢進し、下流に あ るさ まざ まな 適応 応答 遺伝 子の 発現を 介し て低 酸素 環境 に適 応し ている。以 前 申請 者ら の研 究グ ルー プで は低 酸素条 件下 で各 種癌 細胞 の抗 癌剤 抵抗性が亢 進 す る こ と や 、 マ ウ ス自 血病 ウイ ルス のDNA挿入 によ って 活性 化す る癌 遺伝子 で あるPim‐1が 低酸 素下 で発 現亢 進する こと を見 出し た。Pim‐1は 抗アポトー シ ス作 用を 持っ こと が知 られ てお り、低 酸素 下で 固形 癌に 強発 現し たPim‐1が 低 酸素 スト レスから細胞を保護する可能性が予想された。以上の仮説に基づき、
今 回 申 請 者 はPim‐1の 機 能 解 析お よ びDNPim‐1を 用 い た 治 療 法 と し て 、n個 の ア ル ギ ニ ン を 融 合 さ せ たDNPim￣1に よ る 遺 伝子 治 療の 可能 性に つい て検討 し た 。DNPim‐1はPim‐1の1‐81aaを欠 失さ せて 作成 した 。ま ず、 低酸 素で処 理 し た 腫 瘍 細 胞 で のPim．1発 現 を 確 認 し た 。 次に 、DNPim‐1がPim．1の作用 を 阻 害 す る こ と をSocs蛋 白 の り ン 酸 化 で 確 か め た 上 で 、DNPim‐1導 入 株 と tet‐0n．DNPim‐1導入株を作成し、iIlviv0の腫瘍増殖について検討を行った。
SCIDマ ウ ス にDNPim．1導 入 株 を 移 植 し た と こ ろ 、 造 腫 瘍 性を 失 っ た 。 ま た tet‐0nsystemにDNPim．1を 組 み 込 ん で 導 入 株 を 作 成 し てSCIDマ ウ ス に 移 植 し 、DOXを 用 い てDNPim‐1を 発 現 さ せ る と 腫 瘍 増 殖 が 抑 制 され た 。 さ ら に 、 細 胞 内 蛋 白 を 強 制 的 に 分 泌 し 、 細 胞 内 移 行 を 高め る ため にTPOsignalpep伍de と n個 の ア ル ギ ニ ン をN末 端 に 付 加 し た ベ ク タ ー くtet‐0n11RDNPim．1 vector）を 作成し、そのベクターによる蛋白が強制的に分泌し、細胞内ヘ移行す る こ と を 確 か め た 。 次 にS（ 】IDマ ウ ス の 背 部 皮 下 に 膵 癌 細胞 株 を 移 植 し 、 11R．DNPim‐1発 現ベ クタ ーを 筋肉 内投 与したところ、腫瘍増殖は著明に抑制さ れ た 。 次 に 腫 瘍 組 織 を 抗MIB．1抗 体 及 び 抗ssDNA抗 体 を 用 いて 病 理 組 織 学 的 に 細胞 増殖 とア ポト ーシ スに つい て検討 した。11R‐DNPim．1群では細胞増殖も ア ポ ト ー シ ス もM0ckに 比 べ て 有 意 差 を 認 め な かっ た 。こ れら の結 果よ り、当 初 抗ア ポト ーシ スに 働くPim．1を 阻害す るこ とで 腫瘍 細胞 のア ポト ーシスを促 進 し、 抗腫 瘍効 果が 出現 する と考 えられ たが 、ア ポト ーシ スと は異 なる機序で 抗 腫 瘍 効 果 が 出 現 し て い る 可 能 性 が あ る 。Hela細 胞 へ導 入し たDNPim．1によ
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って腫瘍増殖抑制を得ていることからあらゆる固形癌に対する有カな治療法と なりうることが示唆された。
口頭発表に際し、副査の田中教授よりDNPim ー1 を筋肉内に投与した時の腫瘍 内 、お よび 血中の DNPim‑l の濃 度に っい ての検 討、llR‑DNPim‑l 蛋白の腫瘍 内投与についての検討の有無、DNPim‑l の生体への毒性により抗腫瘍効果が得 ら れた 可能 性、またPim‑l にpoint muta 伍 0n を入れることで Pim ．1 の機能阻 害を起こすかどうかについての質問があった。これに対して申請者は、腫瘍内 お よぴ 血中 の蛋白 中に WestemB10t 法で DNPim ． 1 を検知できなかったこと、
nR ‐DNPi 班‐1 蛋白を細胞内ヘ導入した際に顆粒状になっていて、実際にPim ‐1 の 機 能 阻 害 を 起 こ し て い る か ど う か は 正 確 に 知 り 得 な か っ た こ と 、 nR ‐DNPim ‐1 蛋白の腫瘍内投与は検討していないこと、サクリファイス時のマ ウスが皆元気であったこと、poilltmuta 伍0n を入れたベクターにっいては今後 の検討とすることを回答した。次いで副査の秋田教授よりPim ‐1 の別の作用の 有無、腫瘍縮小のメカニズム、および今後の研究の発展および臨床応用につい て の質 問が あった 。こ れに 対して 申請 者は Pim ． 1 が当初CdC25A やp21waf と いった遺伝子を制御していることから ceucycle に関わる働きがあると報告され ていること、今回は提示しなかったが血管内皮に特異的なCD ‐31 抗体での免疫 染色では DNPim ．1 群で有意に陽性細胞が減少していたことから、血管新生を阻 害することによるネクローシスで抗腫瘍効果を得ていることも考えられること、
ま た、 Pim ．1 を阻 害す るsm 皿 chemicalcompound の検索中であり、分子標的 治療も考慮に入れていることを回答した。さらに、主査の浅香教授より低酸素 で PiI11 ・ 1 が亢進することを見出した実験法、Pin1 ‐ 1knoCkoutmouse での表 現形の有無、他の癌種に対する検討にっき質問があった。これに対して申請者 は低酸素下で培養した細胞から抽出した蛋白を二次元電気泳動で見出したこと、
Pim ‐ 1knockout で は ま った く 表 現 形 に差 がな いこ と、 Pimfamny を すべ て knoCkout して初めて若干マウスの体格が減少したこと、舌癌に対する検討で気 体できうる結果を得ていることを回答した。
本研究はヒト癌細胞株に対するDNPim ・1 発現ベクターを用いた遺伝子治療 の効果を初めて明らかにしたことで高く評価され、この研究を足がかりとして 今後の癌治療への臨床応用が期待された。
審査員一同はこれらの結果を高く評価し、大学院課程における研鑽や単位取 得なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するも のと判定した。
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