誌名 新農業展開ゲノムプロジェクト 巻/号

新農業展開ゲノムプロジェクト: GMO領域(プロジェクト研究 成果シリーズ510)

誌名

誌名 新農業展開ゲノムプロジェクト 巻/号

巻/号 510号

掲載ページ

掲載ページ p. 1-256 発行年月

発行年月 2014年3月

農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センター

Tsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council Secretariat

新農業展開ゲノムプロジェクト

‑GMO 領域−

Genomics for Agricultural Innovation 

新農業展開ゲノムプロジェクト

‑GMO 領域−

Genomics f o r  A g r i c u l t u r a l  I n n o v a t i o n  

2  0  1  4 年 3 月

序 文

研究成果シリーズは、農林水産省農林水産技術会議が研究機関に委託して推進した研究の成果を、総合的 かつ体系的にとりまとめ、研究機関及び行政機関等に報告することにより、今後の研究及び行政の効率的な 推進に資することを目的として刊行するものである。

この第510集「新農業展開ゲノムプロジェクト 遺伝子組換え技術を活用した有用作物及び遺伝子導入技 術の開発（GMO領域）−」は、農林水産省農林水産技術会議の委託プロジ、エクト研究として、 2008年度か ら2012年度までの5年間にわたり、独立行政法人農業生物資源研究所、国立大学法人東京大学及び独立行 政法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産草地研究所を中心に実施した研究成果をとりまとめたものであ る。

農業上重要な遺伝子の解明、画期的作物の開発等のためのゲノム研究基盤の確立を図ることを目的として、

農林水産省は1998年に国際コンソーシアムを立ち上げてイネの全ゲノム塩基配列の解読に着手し、 2004年 に完全解読を達成した。その後も、病虫害抵抗性、収量性、環境ストレス耐性等に関する遺伝子約100個を 単離し機能を解明して特許化を行うなど、我が固はイネゲノム情報を活用した研究分野において世界をリー

ドしてきた。

このような状況の中、本研究では、単離されたイネの遺伝子情報や遺伝子組換え技術を活用し、複合病 虫害抵抗性や高バイオマス蓄積能を付与した画期的なイネの開発、血圧やコレステロール調整機能を有する 高付加価値イネの開発、カドミウム等の有害物質の吸収機能を向上させた環境修復に資するイネの開発等を 実施した。

本研究の成果は、遺伝子組換え作物の作出、特性把握、生物多様性への影響評価等、実用化する際に必要 な知見を提供できると期待されることから、農作物の品種改良や遺伝子組換え作物の開発等を行っている研 究機関の関係者が今後の研究計画を、農作物のリスク評価やリスク管理に係る行政機関の関係者の方々等が 今後の施策を考える上で有用であると考えている。

最後に、本研究を担当し、推進された方々の労に対し、深く感謝の意を表する。

2014年3月

農林水産省農林水産技術会議事務局長 雨 宮 宏 司

第l編 バ イ オ マ ス ・ 飼 料 作 物 の 開 発 研究の要約

第l章 病 害 抵 抗 性 飼 料 イ ネ の 開 発

目 次

1 WRKY45の過剰発現による細菌病・糸状菌病に対する複合抵抗性飼料イネの開発

(GMAOOOl)  ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 8  2 チオニンおよびmALS遺伝子導入による細菌病・除草剤抵抗性の

高バイオマスイネの開発（GMA0002) ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 11  3 ウイルス病抵抗性飼料イネの開発 (GMA0003)  ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 15  4 微生物由来のα−1,3−グルカナーゼを利用した糸状菌病抵抗性イネの開発（GMAOOll）・・....18 

第2章 環 境 ス ト レ ス 耐 性 飼 料 作 物 の 開 発

1 バイオマス・飼料作物への利用を目指した PRlO過剰発現による環境

ストレス耐性作物の開発 (GMA0008)  ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 22  2 高度耐冷性組換えイネの開発（GMA0009) ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 34  第3享 光合成効率の向上したイネの開発

1 ラン藻由来遺伝子の導入による光合成効率の向上したイネ系統の開発（GMA0004) ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 43  2 紅藻由来チトクロームの導入による光合成効率の向上したイネ系統の開発（GMA0005)・ ・ ・ ・ ・ 47 

第4章 高 機 能 性 飼 料 イ ネ の 開 発

1 環境負荷低減を目指した必須アミノ酸高含有飼料イネの開発（GMAOOlO) ...  51  第5享 バイオエタノール生産性向上を目指した作物の開発

1 イネリグニン合成パスウェイの改変 (GMA0006）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 56  2 イネ細胞壁多糖類の改変（GMA0007)・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 59  第2編 環 境 耐 性 ・ 修 復 作 物 の 開 発

研究の要約 ...••••....••••....••••....••••...••••....••••....••••... 62  第l章 環 境 耐 性 ・ 修 復 作 物 の 開 発

1 カドミウム高吸収イネの開発 (GMBOOOl)  ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 67  2 カボチャの形質転換系の確立と有用遺伝子導入による POPs分解植物の開発

(GMB0002)  ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 74  3 微生物由来POPs分解遺伝子の探索 (GMB0003)  ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 79  4  POPsやその候補化合物を分解する微生物酵素・遺伝子の探索と解析（GMB0004）・・・・・・・・・ 88 5 環境修復作物を育種する有機塩素系農薬分解システムの構築（GMB0005) ... ・ 94  6  P450による PCB、ドリン、ヘプタクロルの分解（GMB0006) ... ・ 97  7  POPsの植物における局在性の解明に関する研究（GMB0007）・・・・・・・・・・...103 

第3編 物 質 生 産 ・ 機 能 性 作 物 の 開 発

研究の要約 ...••....••••....••••....••••...••••....••••....••••....••... 110  第l章 ジーンターゲッテイングによる有用形質導入システムの開発 ••••....••... 124  第2章 液体培養系を用いた高頻度相同組換え系の開発と利用 ••....••••....••... 130 

第3章 新規遺伝子発現抑制制御技術の開発 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 135  第4章 イネ種子でのサイトカイン類の発現とその利用 ....••••....••••....••... 147 

第5章 GABA強化米の開発 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 157  第6章 アレルゲン低減化米の開発 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 167 

第7章 血圧調整米の開発 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 173  第8章 ダイズ7Sグロプリン等機能性成分含有米の開発 ..••••....••••....••... 180  第9章 機能性成分の体内の効率的デリパリーシステムの構築と生体反応の解明

1 機能性成分の体内の効率的デリパリーシステムの構築と生体反応の解明①・・・・・・・・・・・・・・・・ 189 2 機能性成分の体内の効率的デリバリーシステムの構築と生体反応の解明②...195  第4編 イネ以外の作物の遺伝子導入技術の開発

研究の要約 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 222  第l章 効率的で安定したコムギ形質転換技術の開発（GMZ1001) ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 228  第2章 我が国育成優良白殖系統を用いたトウモロコシ形質転換系の開発（GMZ1002) ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 235  第3章 ソルガム属植物の遺伝子導入技術の開発（GMZ1003) ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 244  第4章 効率的で安定したダイズ形質転換技術の開発（GMZ1004) ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 251 

第 1 編

I 

研究年次・予算区分

研究年次： 2008年度〜2012年度

予算区分：農林水産省農林水産技術会議新農業 展開ゲノムプロジェクト

II  主任研究者

主査：（独）農業生物資源研究所 理 事 長 石 毛 光 雄 副主査：（独）農業生物資源研究所

理事

佐々木卓治（2008〜2010年度）

贋近洋彦（2011〜2012年度）

プロジェクトリーダー：（独）農業生物資源研究所 基盤研究領域長

贋近洋彦（2008〜2009年度）

（独）農業生物資源研究所 遺伝子組換え研究センター 耐病性作物研究開発ユニット長 高辻博志（2010〜2012年度）

m 

研究担当機関

独立行政法人農業生物資源研究所

（委託先）独立行政法人農業・食品産業技術総合 研究機構作物研究所

（委託先）独立行政法人農業・食品産業技術総合 研究機構中央農業総合研究センター

（委託先）独立行政法人農業・食品産業技術総合 研究機構北海道農業研究センター

（委託先）独立行政法人国際農林水産業研究セン ター

（委託先）独立行政法人森林総合研究所

（委託先）公立大学法人首都大学東京

（委託先）国立大学法人京都大学

（委託先）国立大学法人筑波大学

'JV  研究目的

近年、我が固の主導で、行ってきたイネゲノム解読 の終了や遺伝子単離・機能解明手法の確立により、

GMO開発に必要な有用遺伝子の単離・機能解明が

研 究 の 要 約

可能となった。その代表例として病害抵抗性に関与 する転写因子WRKY45の単離があげられ、従来の 交雑育種では困難な複合病害抵抗性作物の開発も可 能となってきている。本課題では、遺伝子組換え技 術を用いて、複合病害抵抗性やストレス耐性、光合 成能向上や必須アミノ酸の高含有化など、様々な優 良形質を付与した飼料イネを開発するとともに、植 物由来のバイオマスとしてエネルギ一生産に適した イネを作出する技術を開発することを目的とした。

v 

研究方法

無農薬粗放栽培が可能な複合病害抵抗性飼料イネ の開発を重要課題のーっとして設定し、細菌病、糸 状菌病のみならずウイルス病に対しての抵抗性を付 与した飼料イネの開発を行う。開発に際しては、イ ネ由来の選抜マーカー遺伝子の利用（同時に除草剤 耐性となる）、一般品種との交雑を回避するために 極晩生性や開花性の導入等も行った。また、栽培適 地の拡大を可能にする低温ストレス耐性や乾燥・塩 害ストレス耐性に関わる遺伝子を用い、これらの形 質を付与した飼料イネ系統の開発も進めた。さらに イネの飼料としての利用価値を高めるために、アミ ノ酸合成および代謝系の遺伝子の改変等により、必 須アミノ酸の高含有化を目指した。光合成能力の向 上は、イネをバイオマス・飼料として利用する上で 重要な要因であり、これまで、トウモロコシのC4 光合成遺伝子のイネへの導入による C4化の試みが 行われてきたが、期待通りの結果は得られておらず、

光合成能力の向上に利用可能な遺伝子は、高等植物 からは得られていない。本課題では、シロイヌナズ ナ等で有効性の示された藻類由来の遺伝子をイネに 導入し、光合成能力の向上の検証を行った。バイオ マス・飼料として利用する上で重要なもう一つの要 因であるセルロースの消化効率の向上には、他の細 胞壁成分であるリグニンや多糖類の量、質の改変が 必要である。本課題では、リグニンや多糖類の合成 に関与する遺伝子を解析し、それらの遺伝子を抑制 または過剰発現した組換え体を作製してセルロース 糖化効率の向上を図った。

研究計画表（研究室別年次計画）

研究課題 研究年度 担当研究機関・研究室

08  09  10  11  12  機関 研 究 室 1 バイオマス・飼料作物の開発

(1) 病害抵抗性飼料イネの開発

1) WRKY45の過剰発現による細菌病・ ^{司 ，}  農業生物資源研究 耐病性作物研究開

糸状菌病に対する複合抵抗性飼料 所 発ユニット

イネの開発（GMAOOOl)

2）チオニンおよび、mALS遺伝子

‑

ー・ 農研機構・作物研究 稲研究領域

導入による細菌病・除草剤抵抗 所

性の高バイオマスイネの開発 (GMA0002) 

3）ウイルス病抵抗性飼料イネの開発 ^司

‑

農研機構・中央農業 病害虫研究領域

(GMA0003)  総合研究センター

4）微生物由来のα−l,3−グルカナーゼを ^司

‑

^{農業生物資源研究 耐病性作物研究開}

利用した糸状菌病抵抗性イネの開 所 発ユニット

発（GMAOOll)

(2)  環境ストレス耐性飼料作物の開発

1）バイオマス・飼料作物への利用 ^{司‑ ~} 首都大学東京 植物ホルモン機構

を目指したPRlO過剰発現によ 研究室

る環境ストレス耐性作物の開発 (GMA0008) 

2）高度耐冷性組換えイネの開発 ^司‑ 』‑．

農研機構北海道研 寒地作物研究領域

(GMA0009)  究センター

(3)  光合成効率の向上したイネの開発

1）ラン藻由来遺伝子の導入による光 ^『

‑

農研機構・作物研究 稲研究領域

合成効率の向上したイネ系統の開 所

発（GMA0004)

2）紅藻由来チトクロームの導入によ

‑

^．・ _{国際農林水産業研 生物資源利用領域}

る光合成効率の向上したイネ系統 究センター の開発（GMA0005)

(4)  高機能性飼料イネの開発

1）環境負荷低減を目指した必須ア

‑

・ー農研機構・作物研究 稲研究領域

ミノ酸高含有飼料イネの開発 所

(GMAOOlO) 

(5)  バイオエタノール生産性向上を目 指した作物の開発

1）イネリグニン合成パスウェイの改 ^{司 ，}  京都大学 森林代謝機能化学

変（GMA0006) 分野

2）イネ細胞壁多糖類の改変

‑

^』 _{筑波大学 植物環境適応学研}

(GMA0007)  究室

注）文中の図、表に付した番号は、上記研究課題番号とその中の一連番号を組合せて表示しである。

（例： l (1) 1）の課題のl番目の図の場合は、図 111‑1と表示）

羽 研 究 結 果

1 病害抵抗性飼料イネの開発

活性の強さが適度なプロモーターおよび感染応答 性のプロモーターを用いてWRKY45を発現させる

ことにより、いもち病および白葉枯病の両者に強い 抵抗性を有しながら、抵抗性反応によるイネの生育 や収量の低下を最小に留めた飼料イネを作出した。

また、 WRKY45導入イネの生育と収量に悪影響を 及ぼす環境因子（低温、高塩濃度）を特定した。

エンバクチオニン遺伝子を導入することにより、

籾枯細菌病に抵抗性を付与するとともに、極晩性、

開花性導入により高バイオマスになった飼料イネ系 統を選抜した。

RNA干渉によるウイルス抵抗性イネの開発にお いて、テヌイウイルス属のウイルスに対してはヌク レオキャプシドもしくは細胞間移行タンパク質を コードする遺伝子、レオウイルス科のウイルスにお いては外殻キャプシドもしくはパイロプラズマを コードする遺伝子を標的とする RNA干渉により強 いウイルス抵抗性が誘導されることを示し、これを 飼料イネに応用した。

α−1,3−グルカナーゼ遺伝子導入により、いもち病、

紋枯病、ごま葉枯病に抵抗性のイネ系統を作出した。

2 

環境ストレス耐性飼料作物の開発

RSOsPRlO過剰発現イネは、ポット栽培におい て乾燥耐性とバイオマス増加が確認されたが、隔離 ほ場での評価では顕著な効果が認められなかった。

RSOsPRlOは、エチレンを介した根の生育促進、根 張りの向上を介してストレス耐性強化に働く可能性 が示された。

低温誘導性プロモーターおよび荷特異的プロモー ターを開発して飼料イネでのストレス耐性遺伝子の 発現に応用し、低温伸長性と穂ばらみ期耐冷性の同 時改良が可能であることを実証した。

3 

光合成効率の向上したイネの開発

イネ「日本晴」にラン藻由来FBPISBPase遺伝子 を導入することで、 FBPase活性及び光合成活性が 上昇したカルピンサイクル強化系統が得られた。こ れらの導入系統の緑葉では、原品種に比べ光合成代 謝産物の増加が有意に見られ、植物体の基部におい てはデンプン含量のみの上昇が認められた。また、

初期生育の旺盛さや分げつ数の増加が顕著に見られ た。

シロイヌナズナまたはイネ由来プラストシアニン 葉緑体移行シグナルペプチドおよび紅藻由来チトク

ローム遺伝子を保持するコンストラクトをイネに導 入した形質転換系統の光合成効率は、非形質転換体 と同等程度であり、生長量は小さくなる傾向にあっ たことから、紅藻由来チトクローム遺伝子はイネに おいては生長量向上に効果がないと結論された。

4 高機能性飼料イネの開発

イネ種子の目玉特異的オレオシンプロモーターを 用いて、改変DHDPSの発現およびRSIS法による LKR/SDHの発現抑制を組み合わせることにより、

種子における遊離リジン含有量が約95倍増加する 系統を作出し、トリプトファン並みの高含有化に成 功した。また、飼料イネ品種「クサホナミ」を用い てウイスカ直接導入法により、選抜マーカーフリー

となった遊離リジン高含有系統を作出した。

5 

バイオエタノール生産性向上を目指した作物 の開発

リグニン合成系酵素をコードする合計27遺伝子 の発現を制御した網羅的な形質転換系統を作製して 解析を行った結果、最大で酵素糖化性が50%上昇 した株を得るとともにイネのリグニン合成経路を確 立した。

イネ細胞壁のアラピノキシランの側鎖であるアラ ピノースやフェルラ酸を改変することで、セルロー ス含量やセルラーゼ糖化効率の向上が認められた。

また、アラピノキシランおよびベクチンの改変によ り、いもち病害抵抗性と倒伏状態から回復（重力屈 性能）の向ょが示唆された。アラビノキシランおよ びガラクタンを改変したイネでは、倒伏からの回復

（重力屈性能）の向上の可能性が示唆された。

四 今 後 の 課 題

1 病害抵抗性飼料イネの開発

WRKY45による複合抵抗性飼料イネの育種中間 母本を確立するには隔離ほ場栽培によって最良の系 統を選抜する必要がある。また、 WRKY45タンパ ク質の改変やWRKY45制御因子の利用により、環 境因子の影響をさらに排して病害抵抗性をさらに高

められる可能性がある。チオニン導入イネは、安定 した稔実を示す飼料イネのピラミデイング系統の育 成が課題である。ウイルス抵抗性イネに関しては、

確立した手法が他のウイルスにも有効かどうかを検 証するとともに、確立したウイルス抵抗性飼料イネ に関しては、後代への安定性と隔離ほ場栽培試験が 必要である。 α−l,3−グルカナーゼ遺伝子はイネ以外 の作物に応用できる可能性がある。

2 

環境ストレス耐性飼料作物の開発

RSOsPRlO過剰発現イネに関しては、実用性を想 定した自然天候下での生育栽培試験を継続すること が必要である。耐冷性イネ作出に関しては、隔離圃 場試験での有効性確認が必要である。

3 

光合成効率の向上したイネの開発

紅藻由来チトクローム遺伝子はイネでは成長促進 効果が見られなかったが、タバコ等の双子葉植物で はどうかについて検討が必要である。

4 

高機能性飼料イネの開発

アミノ酸高含有化の研究では、高含有化により形 態異常や種子稔実率の低下などの異常が出始める閲 値を把握する必要があり、そのためには隔離圃場で の栽培実験が必須である。

5 

バイオエタノール生産性向上を目指した作物 の開発

バイオエタノール生産性向上を目指した作物の開 発の研究に関しては、セルロース糖化効率の向上に 関して開発した手法が実用レベルのものか否かを検 討する必要がある。

四 研 究 発 表 原著論文

1)  H.  Inoue, N.  Hayashi, A. Matsushita, L.  Xinqiong, A. Nakayama, S.  Sugano, C. 

  J .

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2)  Y. Ueno, R. Yoshida, M. Kishi‑Kaboshi, A.  Matsushita, C. 

J .  

Jiang, S.  Goto, A. Takahashi, 

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4)  H.  Takefumi, S.  Mural^王ami,M. Mukai, T.  Yamada，日.Hirochika, M. Ike,  K. Tokuyasu,  S.  Suzuki, M. Sakamoto, T. Umezawa. Rapid  analysis of transgenic rice  straw using near‑ infrared spectroscopy. Plant Biotechnology. 29 

(4)  '359‑366  (2012). 

5)  ].  Jiang, M. Shimono, S.  Sugano, M. Kojima,  X. Liu, H. Inoue, H. Sakakibara, H. Takatsuji.  Cytokinins act synergistically with salicylic acid  to  activate defense gene expression in  rice.  Mol  Plant Microbe Interact. 26  (3)  : 287‑289 (2013).  6)  T.  Shimizu, T.  Ogamino, A. Hiraguri,  E. 

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7)  T. Yamamoto, A. Nakamura, H. Iwai. T. Ishii. 

J

.  

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8)  M. Shimono, H. Koga, A. Akagi, N. Hayashi,  S.  Goto, M. Sawada, T. Kurihara, A. Matsushita,  S.  Sugano, C. 

J .  

Jiang, H. Kaku, H. Inoue, H.  Takatsuji. Rice WRKY 45 plays important roles  in  fungal and bacterial disease resistance. Mol  Plant Pathol 13  (1)  , 83‑94 (2012). 

9)  K.  Yazawa, C.‑J.  Jiang,  M. Kojima,  H.  Sakakibara, H.  Takatsuji. Reduction of abscisic  acid levels or inhibition of abscisic acid signaling  in  rice  during the early phase of Magnaporthe 

grisea infection decreases its susceptibility to the  fungus. Physiol Mol Plant Pathol. 78, 1‑7  (2012).  10)  K.  Takeuchi, A.  Gyohda, M. Tominaga, 

M. Kawakatsu, A. Hatakeyama, N.  Ishii,  K.  Shimaya, T. Nishimura, M. Riemann, P.  Nick, M. 

Hashimoto  T. Komano A. Endo  T.  Okamoto  Y.  Jikumaru, Y.  Kamiya, T.  Terakawa, T.  Koshiba. RSOsPRlO expression in  response  to  environmental stresses  is  regulated  antagonistically by jasmonate/ ethylene and  salicylic acid signaling pathways in  rice roots.  Plant Cell Physi

。

^{152  (9)  ' 1686‑1696 (2011).} 

11)  T. Konishi, T. Aohara, T. Igasaki, N. Hayashi,  Y.  Miyazaki, A. Takahashi，日.Hirochika, H.  Iwai, S.  Satoh, T. Ishii.  Down‑regulation of UDP‑

arabinopyranose mutase reduces the proportion  of arabinofuranose present in  rice  cell  walls.  Phytochemistry. 72  (16)  , 1962‑1968 (2011).  12) Y. Arai‑Sanoh, M. Ida, R. Zhao, S.  Y oshinaga, 

T. Takai, T. Ishimaru, H. Maeda, K. Nishitani, Y.  Terashima, M. Gau, N. Kato, M. Matsuoka, M. 

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K.  Ozawa. Enhanced chilling  tolerance  at  the  booting stage  in  rice  by transgenic  overexpression of the ascorbate peroxidase gene,  OsAPXa. Plant Cell Rep 30  (3)  , 399‑406 (2011).  14) 

J .  

Jiang, M. Shimono, S.  Sugano, M. Kojima,  K. Y azawa, R. Yoshida，日.Inoue, N. Hayashi, H.  Sakakibara, H. Takatsuji. Abscisic Acid Interacts  Antagonistically with Salicylic  Acid Signaling  Pathway in Rice‑Magnaporthe grisea Interaction.  Mol Plant Microbe Interact 23  (6)  , 791‑798 

(2010). 

15)  T.  Konishi,  M. Ohnishi‑Kameyama, K. 

Funane, Y. Miyazaki, T. Konishi, T.  Ishii.  An  arginyl residue in  rice  UDP‑arabinopyranose  mutase is  required for  catalytic activity and  autoglycosylation. Carbohydr Res 345  (6)  , 787・

791 (2010). 

16)  T. Konishi, Y. Miyazaki, S. Yamakawa, H. Iwai,  S.  Satoh, T. Ishii.  Purification and biochemical  characterization of  recombinant rice  UDP‑

arabinopyranose mutase generated in  insect  cells. Biosci Biotechnol Biochem 74  (1)  , 191‑194 

(2010). 

17) Y. Taniguchi, M. Kawata, I.  Ando, T. Shimizu,  M. Ohshima. Selecting genetic transformants  of indica and indica‑derived rice cultivars using  bispyribac sodium and a mutated ALS gene.  Plant Cell Rep 29  (11)  , 1287‑1295 (2010).  18)  M. Kishi‑Kaboshi, K.  Okada, L. Kurimoto, 

S.  Murakami, T.  Umezawa, N. Shibuya, H.  Yamane, A. Miyao，日.Takatsuji, A. Takahashi,  H.日irochika.A rice fungal MAMP‑responsive  MAPK cascade regulates metabolic flow to  antimicrobial metabolite synthesis. Plant J 63 (4),  599‑612 (2010). 

19)  N. Hayashi, H.  Inoue, T. Kato, T. Funao, M. 

Shirota, T. Shimizu, H.  Kanamori, H. Yamane,  Y.  Hayano‑Saito, T. Matsumoto, M. Yano, H.  Takatsuji. Durable panicle blast‑resistance gene  Pbl encodes an atypical CC‑NBS‑LRR protein  and was generated by acquiring a promoter  through local genome duplication. Plant J 64 (3) ,  498‑510 (2010). 

20)  S.  Sugano, C.  J.  Jiang,  S.  Miyazawa, C.  Masumoto, K. Y azawa, N. Hayashi, M. Shimono,  A. Nakayama, M. Miyao, H. Takatsuji. Role of  OsNPRl in rice defense program as revealed by  genome‑wide expression analysis. Plant Mol Biol  74  (6)  '549‑562 (2010). 

21)  H.  Kato, G Xie, Y. Sato, R Imai. Isolation of  anther‑specific gene promoters suitable for  transgene expression in  rice.  Plant Mol. Biol.  Rep. 28  (3)  , 381‑387 (2010). 

22)  G.  Xie,  H. Kato, K. Sasaki, R. Imai. A cold‑ induced thioredoxin h of  rice,  OsTrx23,  negatively regulates kinase activities of OsMPK3  and OsMPK6 in  vitro.  FEBS Lett 583  (17)  ,  2734‑2738 (2009) . 

23) 

J .  

Jiang, M. Shimono, S.  Maeda, H. Inoue, M. 

Mori, M. Hasegawa, S.  Sugano, H. Takatsuji. 

Suppression of the rice  fatty‑acid desaturase  gene OsSSI2 enhances resistance to  blast and  leaf blight diseases in  rice.  Mol Plant Microbe  Interact 22  (7)  , 820‑829 (2009). 

24)  T. Shimizu, M. Yoshii, T. Wei, H. Hirochika, T.  Omura. Silencing by RNAi of the gene for Pnsl2,  a viroplasm matrix protein of Rice dwarf virus,  results in  strong resistance of transgenic rice  plants to the virus. Plant Biotechnol J 7 (1)  , 24‑ 32 (2009). 

25)  Y. W. Feng, S.  Komatsu, T.  Furukawa, T.  Koshiba, Y. Kohno. Proteome analysis of proteins  responsive to ambient and elevated ozone in rice  seedlings. Agric Ecosyst Environ 125  0‑4)  ,  255‑265 (2008). 

総 説

26）梅津俊明 再生可能バイオマス資源の生産と利 用 生 存 圏 研 究 825‑32 (2013). 

27）岩井宏暁，古川純，石井忠，佐藤忍成長制御 装置として働く細胞壁遺伝6653‑58  (2012).  28）横山隆亮，西谷和彦細胞壁の進化遺伝 6628‑

33 (2012). 

29）西谷和彦植物細胞壁は今なぜ注目されている の か 遺 伝6624‑27 (2012). 

30） 清 水 巧 ， 笹 谷 孝 英 ， 大 村 敏 博 植 物 ウ イ ル ス 病の防除技術開発最前線 イネ萎縮ウイルス RNA干渉法によるイネ萎縮病抵抗性イネの開発 植物防疫64(1)  19‑21  (2010). 

31)  T. Konishi, T. Ishii,  The Origin and Functions  of Arabinofuranosyl Residues in Plant Cell Walls  Trend in  Glycoscience and Glycotechnology 24 

(135)  13・23(2012). 

32)  M. Seo, T. Koshiba Transport of ABA from  the site  of biosynthesis to  the site  of action J  Plant Res 124  (4)  501‑507 (2011). 

33)  Hiroshi Takatsuji,  Chang‑Jie Jiang,  Shoji  Sugano Salicylic Acid Signaling Pathway in Rice  and the Potential Applications of Its  Regulators  JARQ 44  (3)  217・223(2010). 

34）高辻博志イネの誘導抵抗性の分子機構ーサリ チル酸シグナル伝達経路の解明とその利用に向け て一日本農薬学会誌34 (4)  330・334(2009). 

35)  T.  Umezazwa The Cinnamate/Monolignol  Pathway, Phytochemistry Reviews 1568‑7767 

(2009). 

36）梅津俊明リグニンの代謝制御による木質パイ オマスの改良第二世代バイオ燃料の開発と応用 展開 103‑111(2009). 

37） 高 辻 博 志 誘 導 抵 抗 性 に 関 わ る 転 写 因 子 WRKY45の 発 見 と そ の 利 用 ブ レ イ ン テ ク ノ ニュース 1251‑7  (2008). 

38）高辻博志イネの誘導抵抗性に関わる転写因子 WRKY45の発見とその利用植物防疫 62 (7)  29‑ 32 (2008). 

39）高辻博志，霜野真幸，菅野正治，美昌三i三，中山明，

林長生イネの誘導抵抗性に関わる分子機構の解 明とその利用植物感染生理談話会論文集 441‑10 

(2008). 

その他の出版物

40)  T. Nishimura, T. Koshiba  Auxin biosynthesis  and polar auxin transport during tropisms in  maize coleoptiles.  Signaling and Communication  in Polar Auxin Transport. (2012). 

41） 梅 津 俊 明 第5章−1.リグニン量と構造の制御 エコバイオリファイナリー植田充美，田丸浩編），

pp. 65‑73，シーエムシー出版，東京 (2010).  42）小柴共− 6.1.2植物体内の物質移動と植物ホル

モン生物の事典 179‑181(2010). 

43）小柴共ー，神谷勇治（編）新しい植物ホルモン の科学（第2版） (2010). 

44） 高 辻 博 志 モ デ ル 植 物 を 用 い た 機 構 解 析 ー イ ネ微生物と植物の相互作用 病害と生物防除 213‑219 (2009). 

45） 高 辻 博 志 イ ネ の 遺 伝 子WRKY45を用いた複 合 病 害 抵 抗 性 イ ネ 作 出 に 向 け て 米 麦 改419‑25 

(2009). 

46）小柴共ー（第4章）植物ホルモンによる制御 ベーシックマスター植物生理学81‑112(2009).  47）高辻博志イネの誘導抵抗性に主要な役割を果

たす転写因子WRKY45化学と生物 465 300‑301  (2008). 

48）高辻博志複数の病害に対する極めて強い抵抗 性を与えるイネの遺伝子WRKY45の発見とその 利 用 農 林 水 産 技 術 研 究 ジ ャ ー ナ ル 31 (3)  8・10

(2008). 

49） 高 辻 博 志 誘 導 抵 抗 性 に 関 わ る 転 写 因 子 WRKY45の発見とその利用 STAFFnewsletter  19  (5)  7 (2008). 

50） 小 柴 共 ー 第4章 植 物 ホ ル モ ン に よ る 制 御 ベーシックマスター植物生理学（2009).

区特許取得・申請

1）「ストレス応答性遺伝子が導入された形質転換 植物」 特願2006‑018661 W02007 /086282小柴 共ー，寺川輝彦，長谷川久和，小松節子，岡本龍 史，古川聡子，島谷健太郎

2）「RNA干渉によるテヌイウイルス属のウイルス に対して抵抗性植物を得るためのウイルス遺伝 子」特願2009引 9750 笹谷孝英，大村敏博，平 栗章弘，清水巧，長岡栄子

3）「農業形質を最適化した複合病害抵抗性単子葉 植物」特願2011‑052531 高辻博志・後藤新悟 4）「病害ストレス及び病害抵抗性誘導剤に対する

応答性を示す核酸構築物」特願2011‑097346 萎 昌 三 区 ， 高 辻 博 志 ， 藤 岡 智 則 ， 角 康 一 郎 ， 清 水 力

5）「広範な病害抵抗性を付与するイネ遺伝子」特 願2008‑217603 森昌樹，林長生，菅野正治，高 辻博志，松井南，小田賢司，広近洋彦

6）「糖類の製造方法」特願 2012‑019086 梅津俊明，

坂本正弘，服部武文，鈴木史朗，村上真也，小柴 太一

7）「転写因子遺伝子の導入による植物の病害抵抗 性の改良」特願2007‑517912 高辻博志，霜野真幸，

菅野正治，菱昌三

R

，加来久敏

8）「感染応答性プロモーターを用いて最適化し た複合病害抵抗性イネ」米 13/748334，カナダ 2803324  高辻博志，後藤新悟

x 

研究担当者

独立行政法人農業生物資源研究所

高辻博志＊、土岐精一、雑賀啓明、菅野正治、

美 昌 点 、 山 崎 宗 郎 、 南 栄 ー ペ 西 村 麻 里 江 、 西津洋子

独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構作物 研究所

川田元滋、田中淳一、谷口洋三郎、竹内善信、安 東 郁 男 、 大 島 正 弘 ぺ 小 松 晃 ぺ 長 谷 川 久 和 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構中央 農業総合研究センター

笹谷孝英＊、青木秀之、大村敏博、矢頭治、斎 藤浩三

独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構北海 道農業研究センター

佐 藤 裕 ぺ 今 井 亮 三 、 下 坂 悦 生

独立行政法人国際農林水産業研究センター 末永一博＊、石崎琢磨、奥忠武

公立大学法人首都大学東京

小柴共ーペ寺川輝彦、岡本龍史 国立大学法人京都大学

梅津俊明ぺ坂本正弘、服部武文、鈴木史朗 独立行政法人森林総合研究所

石井忠＊

国立大学法人筑波大学

佐藤忍ぺ岩井宏暁、古川純、西谷和彦、横山隆 亮

（＊執筆者）

XI 

取りまとめ責任者あとがき

5年間の研究推進と本研究成果集の執筆にご協力 を頂いた課題担当者の方々に深くお礼申し上げま す。

（推進リーダー：高辻博志）

第 1 編バイオマス・飼料作物の開発 第 1 章病害抵抗性飼料イネの開発

1 WRKY45の 過 剰 発 現 に よ る 細 菌 病 ・ 糸 状 菌 病 に 対 す る 複 合 抵 抗 性 飼 料 イ ネ の 開 発

(GMA0001)  ア 研 究 目 的

イネの転写因子 WRKY45は、植物活性化剤の作 用に中心的な役割を果たしており、イネで高発現さ せることにより、いもち病および白葉枯病に強い抵 抗性が賦与される（複合抵抗性）

0 ‑ 4

）。また、プ ライミング効果により遺伝子導入による生育への影 響が比較的小さいが、環境因子の影響で誘導される 抵抗性反応により生育遅延が増幅される。本課題で は、WRKY45を利用した耐病性イネの実用化のため、

コンストラクトの改良によってイネの生育・収量と 複合抵抗性とが両立するよう WRKY45の発現を最 適化し、飼料用イネに導入して無農薬粗放栽培が可 能な複合抵抗性飼料用イネを作出することを目的と

した。

イ 研 究 方 法

（ア） WRKY45の発現最適化に適する新規プロ モーターを単離するため、親和性いもち病菌（race 007）を接種した後のイネの葉（4葉期）における 遺伝子発現を、マイクロアレイを用いて経時的に 解析した。その結果から、 WRKY45の発現最適化 に適すると考えられる遺伝子32種の開始コドン上 流2kbのDNA配列をクローニングし、 WRKY45 cDNAの上流に接続したコンストラクトを作製し てイネ（日本晴）に導入した。

（イ）感染誘導性プロモーターを用いる場合は、

タンデムターミネーター（T35S T NOS)  (5）および翻 訳エンハンサー（ADH5'UTR)  (6）を用いた。

（ウ）作製した WRKY45発現コンストラクトを導 入した形質転換イネについて、 realtime PCRを用 いてDNA欠損のない導入遺伝子を lコピーのみ含 む系統を選ぴ、 real‑timeRT‑PCRで導入 WRKY45 の発現レベルを解析した。

（エ）作製した WRKY45発現系統のいもち病抵抗 性検定は、 Magnaportheoryzae親 和 性 系 統007お よび003を噴霧接種し、病斑数およびいもち病菌

の28Sリボソーム DNAを定量することにより行っ た。白葉枯病抵抗性検定は、 XanthomonasOη•zae

pv. 01ア•zae 親和性系統 T7174. T7147. 7133を勇葉 接種することにより行った。ごま葉枯病検定は、

Cochliobolus miyabeanus Hl 1‑43‑1菌を噴霧接種して 行った。

（オ）作製した新規 WRKY45発現イネの農業形質 の評価は、外部環境に応じて温度および湿度が変化 する外部環境追随型温室ならびに韓国およびコロン ピアの隔離ほ場にて、 T2以降のホモ系統を用いて 行った。

（カ） WRKY45発現系統の低温感受性を調査する には、低温（8℃）に設定した植物インキュベーター で形質転換イネおよび日本晴を7日間栽培し、通常 温度の温室にて 1週間栽培したあと、生存率および 遺伝子発現を調査した。

（キ） WRKY45発現系統の高塩濃度感受性を調査 するには、 250m M  NaClを7日間濯流した後、水 を7日間濯流し、イネの生存率および遺伝子発現を 調査した。

（ク）形質転換が比較的困難な飼料イネ たちす がた について、完熟種子を用いたアグロバクテリ

ウム迅速形質転換法を確立するため、ハイグロマイ シン選抜を利用した条件検討を行った。

（ケ）飼料イネ たちすがた に新規WRKY45発 現カセットを導入するには、アセト乳酸合成酵素

(ALS）を選抜マーカーとするベクターを用いた。

ウ 研 究 結 果

（ア） WRKY45過剰発現イネ（PZmubi系統）は、

いもち病および白葉枯病以外に、ごま葉枯病に対し て強い抵抗性を示した。一方、担子菌類による紋枯 病、ウイルスによる縞葉枯病およびイネ萎縮病には 抵抗性が認められなかった。

（イ） WRKY45過剰発現イネ（PZmubi系統）は 低温および高塩濃度に対する感受性が高くなり、そ れらの処理後の生存率低下が認められた。また、

WRKY45過剰発現に依存したPR遺伝子等の防御遺 伝子の発現上昇が、低温および高塩濃度による生存

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図111‑1 低温がWRKY45過剰発現イネの生育 ・生存と遺伝子発現に及ぼす影響 A 隔離ほ場栽培において、最低気温が低い韓国ではコロンビアと較べてより強い

生育抑制が見られた。

B.常温またはgocで7日処理した後、温室で7日栽培した後のイネ。

C.低温処理前後での防御遺伝子（PRJa, PRJ b, PR2,  CPS4）および低温ストレス 関連遺伝子（DREBJA,DREBJB）の発現。

いもち病抵抗性

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白葉枯病

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収量特性

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図111‑2 p Osubi7系統の病害抵抗性および収量特性 A.しもち病抵抗性。

B.白葉枯病抵抗性。

C粒 数／株。

率の低下と関連していることがわかった（図 111‑1。）

（ウ）様々な発現レベルを示す 22種の恒常的発現 遺伝子の上流配列 （2kb）をプロモーターとして用 いた WRKY45発 現コンストラクトを導入した形質 転換イネのうち、OsUbi7プロモーターを用いた系 統 （POsubi7系統）が、複合病害抵抗性と生育 ・収 量のバランスにおいて最良であり、かなり強いいも ち病および白葉枯病抵抗性を示すとともに海外の隔 離ほ場栽培において良好な生育と収量を示した（図 111‑2)  (7）。また、低温や高塩濃度による防御応答 遺伝子の誘導にともなう生育阻害が、POsubi7系 統ではほぼ回避されていることがわかった（図 111‑

1)

。

（エ）感染応答性プロモーターを用いた WRKY45 発 現 系 統は、いずれの系統も十分な複合抵抗性を 示 さ な か っ た 。 そ こ で 、 感 染 誘 導 後 に 発 現 す る WRKY45タンパク質のレベルを補強するため、タ ンデム・ターミネーターおよびイネのアルコールデ ヒドロゲナーゼ由来の翻訳エンハンサーを感染応答 性プロモーターと組み合わせたところ、 2つの感染 応答性プロモーター（PGSTお よ びPPRlb）を用 いた系統に強いいもち病および白葉枯病抵抗性が認 められた。また、海外の隔離ほ場等での栽培の結果、

生育 ・収量に対する悪影響も小さく、系統によっ

ては対照の日本晴とほぼ同等であることがわかっ た（8）。病害抵抗性の強さに関しては、恒常性プロ モーターを用いた場合より強いという傾向が認めら れた。

（ オ ） 日 本 晴 に お い て 良 好 な 形 質 を 付 与 し た POsUbi7, PEFlα ，POsUbil, PGST, PPRlbの各プ ロモーターを用いた WRKY45発現コンストラクト を導入した飼料イネ たちすがた を作製し、 lコ ピーのホモ系統を各30‑40系統得た。抵抗性検定の 結果、いもち病および白葉枯病抵抗性が認められ、

たちすがた の遺伝的背景でも複合抵抗性形質が 発現することを確認した。 PPRlbを用いた系統以 外では、対照の非形質転換 たちすがた とともに 農業環境技術研究所の隔離ほ場にて栽培し、生育お

よび収量を評価した。

工 考 察

（ア）恒常性プロモーターおよび感染誘導性プロ モーターを用い、複合性を保った上で生育・収量が 顕著に改善し、非形質転換イネに近い収量性を示す 系統を作製する技術が開発できた。恒常性プロモー ターと感染誘導性プロモーターの比較において、収 量性が同等である場合には、感染誘導性プロモー ター（翻訳エンハンサーを併用）を用いた場合の方 が、いもち病および白葉枯病に対してより強い複合 抵抗性が得られた。しかしながら、恒常性プロモー ターの方がより広範囲の病害に有効である可能性も 残されているので、用途による使い分けが必要であ

ろ っ 。

（イ）恒常的発現系統としては、日本晴の遺伝背 景においてはPOsUbi7によるコンストラクトが最 良の形質を示したが、 たちすがた の遺伝背景に おいては、複合病害抵抗性形質が日本晴の遺伝背景 の場合より若干弱めであった。品種育成の際にはこ のことに留意し、作製した WRKY45発現コンスト ラクトのうち、それぞれの品種に適したものを使用 することが必要である。

（ウ） WRKY45の過剰発現により、低温や高塩濃 度に対するイネの感受性が高まっていることがわ かった。プロモーターの最適化によって問題はほぼ 解消しているように見えるが、留意が必要である。

オ 今 後 の 課 題

（ア）改良した WRKY45発現 たちすがた は、

数年にわたって隔離ほ場栽培で農業形質と病害抵抗 性の評価を行い、総合的に判断して複合病害抵抗性 飼料イネの育成のための中間母本となる系統を選抜 する必要がある。

（イ） WRKY45のプロテアソーム分解制御や環 境因子による WRKY45による抵抗性反応の誘導な どの分子メカニズム等の解析結果に基づいて、さら に複合病害抵抗性を強化し、生育・収量への悪影響 を低減できる可能性がある。

力 要 約

（ア）適度な強度のプロモーターおよび感染応答 性プロモーターおよび翻訳エンハンサ一等の組合わ せによって WRKY45を発現させることにより、生育・

収量への悪影響が低減した複合病害抵抗性イネを作 出する技術を開発した。

（イ）上記技術を飼料イネに応用して作製した系 統を固定化し、園内の隔離ほ場において栽培試験を

開始した。

キ 引 用 文 献

1)  Shimono M, et al.  (2007) . Rice WRKY 45 plays  a crucial role in  benzothiadiazole‑inducible blast  resistance. Plant Cell.19  (6)  : 2064‑2076. 

2)  Shimono M, et al.  (2012). Rice WRKY45 plays  important roles in  fungal and bacterial disease  resistance. Mol Plant Pathol.13 (1)  : 83‑94.  3)  Takatsuji H, Jiang C‑J, & Sugano S (2010). 

Salicylic acid signaling pathway in  rice and the  potential applications of its  regulators. J ARQ.44 

(3)  : 217・223.

4）特許4997376 高辻博志，菅野正治，霜野真幸，

菱昌ボ，加来久敏 「転写因子遺伝子の導入によ る植物の病害抵抗性の改良」

5)  Luo Z & Chen Z (2007).  Improperly  terminated, unpolyadenylated mRNA of sense  transgenes is  targeted by RDR6^・mediatedRNA  silencing in Arabidopsis. Plant Cell 19  (3)  : 943・

958. 

6)  Sugio T, Satoh J,  Matsuura H, Shinmyo A, 

& Kato K (2008). The 5'‑untranslated region 

of the Oryza sativa alcohol  dehydrogenase  gene functions as  a translational enhancer in  monocotyledonous plant cells. 

I 

Biosci Bioeng.105 

(3)  : 300‑302. 

7）特願PCT/JP2012/55192 高 辻 博 志 後 藤 新 悟

「農業形質を最適化した複合病害抵抗性単子葉植 物」

8）特願米 131748334，特願カナダ2803324 高辻 博志後藤新悟「感染応答性プロモーターを用い

て最適化した複合病害抵抗性イネ」

研究担当者（高辻博志ヘ土岐精一、雑賀啓明、

菅野正治、妻昌示、山崎宗郎）

2  チオニンおよび mALS遺伝子導入による細 菌病・除草剤抵抗性の高バイオマスイネの開発

(GMA0002)  ア 研 究 目 的

本課題では、既存の飼料用イネ品種よりもさらに 高バイオマスで低コスト栽培適性のある品種を育成 するため、強梓で高バイオマスの品種「たちすがた」

を反復親とし、極晩生を支配する QTLをDNAマー カー選抜で導入し、バイオマスの向上を図る。これ に遺伝子組換え技術でエンバクチオニン遺伝子を導 入することにより、飼料稲の生産の多い暖地で問題 となる籾枯細菌病に抵抗性を付与する。加えて変異 型アセト乳酸合成酵素遺伝子（mALS）を導入する ことにより、除草剤抵抗性を付与し、直播栽培での 除草作業を軽減し、省力的な生産システムを可能に する。さらにGM品種の花粉飛散による一般品種 との自然交雑を生じさせないようにするため、上 記極晩生化遺伝子座に加え開花性遺伝子座を DNA マーカーで同時に導入し、極晩生で閉花性のGM イネを開発する。

イ 研 究 方 法

（ア）北陸研究センター、クミアイ化学（株）

か ら の 分 譲 、 購 入 に よ り 入 手 し たpTAl及 び pSTARA R‑4により「たちすがた」にエンバクチ オニン遺伝子と変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子を 超迅速形質転換法（農業生物資源研究所）により導 入した。遺伝子導入条件の検討にあたり、基本培地 はN6Dを使用し、選抜用薬剤であるピスピリパッ

クナトリウム塩（BS）濃度を0〜10μ Mの範囲 で変化させ、最適な選抜条件を検討し、 0.25μ M  で耐性カルスを選抜した。また、エンバクチオニン 遺伝子 （Asthil)DNA配列を基に一次抗体を設計・

調製した。導入遺伝子の遺伝的安定性は選抜した組 換えイネ系統の後代世代でのサザン分析およびエン バクチオニンに対するウエスタン分析で確認した。

（イ）細菌病抵抗性検定は原品種「たちすがた」

を比較対照区とし、組換え系統を供試して、中央農 研・病害虫同定法研究チームより分譲されたイネも み枯細菌病菌（MAFF301682）およびイネ百立細 菌病菌（MAFF301723）により行った。イネもみ 枯細菌病菌感染実験では発芽時に菌液に減圧浸j責後 風乾した感染籾をグロースチャンパー内で発芽さ せ、 7日後に葉部における発病程度を評価した。

（ウ） ALS酵素活性は、 KARI (ketol‑acid reduc‑ toisomerase）阻害剤の CPCA (1,1‑cyclopropanedi‑ carboxylic acid）処理によるアセト乳酸蓄積後、酸 および熱処理によりアセト乳酸をアセトインに変換 し赤色呈色の有無を検討することにより評価した。

除草剤抵抗性検定は、原品種「たちすがた」を比較 対照区とし、ヘクタールあたりの散布量に換算でき

るよう、組換え系統を 90cm四方のスペースに比較 対照区とともにランダムに設置し、薬剤噴霧器でビ スピリパック乳剤の希釈液を噴霧した。その後植物 体を隔離温室で生育させ、およそ30日後に生育程 度を評価した。

（エ）たちすがた／NonaBokraのF2、および「開 花性系統（els) //Nona Bokra （極晩成型等）／た ちすがた」にたちすがたを 2度戻し交雑し、 F2世 代の一部の24個体の小集団を用いて極晩性につい てのQTL解ネ斤を行った。

（オ）極晩性系統を効率よく世代をまわすため に、 BBS (Biotoron Breeding System）から分けつ 除去と伍救出を省き省力化した世代促進技術sBBS

(simplified BBS）を試行し、極晩性系統の世代促進 への適用を図った。

（カ）「開花性系統（els) //Nona Bokra （極晩成 型等）／たちすがた」にたちすがたを 2度戻し交 雑に由来する後代から、 DNAマーカー選抜と表現 型により、開花性遺伝子spw‑clslを有しNona Bokra （極晩成）型Hdlアリルが固定され、稔実に 問題がない系統選抜した。その際、組換え体の管理

が容易になるべく、葉鞘の着色形質にも注目し、選 抜を進めた。

（キ）「開花性系統（els)//Nona Bokra （極晩成 型等） ／たちすがた」にたちすがたを2度戻し交雑 に由来する後代集団中の開花性遺伝子spw clsl  を有し NonaBokra （極晩成）型 Hdlアリルが固 定され、稔実に問題がない個体と「チオニンおよ びmALS遺伝子導入の組換え体個体」とを交雑し、

その後代集団から DNAマーカーと表現型により選 抜してピラミデイング系統を選抜した。

ウ 研 究 結 果

（ア）「タチアオパ」及び「たちすがた」の培養及 び再分化条件の検討

本研究で供試した「タチアオバ」及び「たちすがた」

の植物体での知見では、「タチアオパ」はBS感受 性であり、「たちすがた」は中程度にBS抵抗性で ある。しかし、両品種のカルスでのBS感受性を調 査したところ、植物体とは全く異なり、共に BS感 受性で「日本晴」並のBS濃度で耐性カルスを選抜 可能であることが示された。そこで、 2点変異型 mALS遺伝子（mALS[W548L/S627IJ）を選抜マー カー遺伝子としてpSTARAR‑4ベクターにより「た ちすがた」組換え体（TO）を作出した。「タチアオパ」

ではカルス増殖速度が遅く、遺伝子導入効率が極め て低いため、実使用場面での適用価値を考慮し、こ れ以上の検討はせず、対象を 「たちすがた」に一本 化する事とした。

「たちすがた」組換え系統から、 導入遺伝子のコ

ピー数がlないし2である系統を選抜した。これら の系統ではサザン分析による導入遺伝子のパターン が世代を重ねても変わらず、導入遺伝子の存在状態 の安定性が示された。また導入遺伝子の発現レベル についても、維持されていることを確認した。期間 を通じてサイレンシングが起こった系統は認められ なかった。

（イ）発現蛋白質の確認

作出した「たちすがた」組換え体（TO）の成葉 を供試し、合成ペプチドを基に作成したエンバクチ オニン抗体を一次抗体としてウエスタン分析を行っ た。その結果、組換え体で特異的なシグナルが確認 できた（図 112‑1)。このシグナルの推定分子量は約 6KDa弱であり、組換えイネに導入したエンバクチ オニンの蛋白質推定分子量と一致した。一方シグナ ル強度は、組換え体によって異なり（図 112‑1）、エ ンバクチオニン蛋白質の蓄積量が組換えイネ系統に よって異なることが強く示唆された。また、作出し た組換え体の成葉を供試し、 BS存在下でのアセト イン呈色反応により、導入mALS遺伝子の発現と、

BS存在下でのALS活性の発現を確認した。非組換 え体では、 BS存在下でのALS活性は認められな かった。これより、 mALS [W548L/S627IJを導入 した組換え体は、 0.25μMBSによる ALS酵素活性 阻害を受けないことが示され、導入遺伝子の活性が 確認された（図 112‑2）。

（ウ）組換え系統における除草剤抵抗性の検討 組換え系統は幼苗期（実生）で明確な BS抵抗性 を示した（図 112‑3）。また、 T3世代の個体で、 BS

巨豆 E

一三笠」ー丞隼乙ー一三笠L ＿＿＿！笠乙＿＿..！盆Lー丞整L̲̲J§盆Lー↓

で三：「一戸て~~－＇1一一一ーー ・

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図112・1 組換え体 （T2世代）のウエスタンブロットの例

0

は各系統の親 （Tl世代）の個体を、矢印はチオニンの位置を示す

非組換え体（たちすがた） 持σ

E、弘 BS+ ‑7  8 

BS  BS+  BS  BS+  l 

赤色 ＂色 亦 色 ＂企 赤色

ALS呈色庄応（T1) BS+: 0.25州 出 処 理

図112・2 組換え体でのmALS遺伝子の発現解析