東北薬科大学 審査学位論文（博士）

東北薬科大学

審査学位論文（博士）

氏名（本籍） ﾅｶﾞｵｶ ｺｳｼ

長岡 高史（岩手県）

学位の種類 博士（薬学）

学位記番号 甲第

138

学位授与の日付 平成

26

3

18

学位授与の要件 学位規則第４条１項該当

学位論文題名 カンナビノイド受容体を介した疼痛制御機構に関する 行動薬理学的検討

論文審査委員

主査 特任教授 櫻 田 忍 副査 教 授 大久保 恭 仁 副査 教 授 石 川 正 明

カンナビノイド受容体を介した疼痛制御機構に 関する行動薬理学的検討

東北薬科大学大学院薬学研究科薬学専攻博士課程後期課程 機能形態学教室

長岡 高史

目次

序論 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・1

第一章 カンナビノイド

1

AM251

ERK

材料及び方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・7 実験結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10

考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 21

第二章 β-カリオフィレン誘発性抗侵害作用における末梢カンナビノイド受容 体とオピオイド受容体の関与 緒言 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23

材料及び方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 25

実験結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 27

考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 37

結論 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 38

謝辞 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 39

引用文献 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 40

1

序論

現在、本邦では大麻取締法により大麻の所持は禁止されているが、その乱用 が若年層にまで及んでいることは大きな問題となっている

¹⁾

^2)-9)

大麻は

1886

¹⁰⁾

Mechoulam

⊿9-tetrahydrocannabinol（⊿9-THC）を単離することに成功し、初めて幻覚 の原因物質であることを示した

¹¹⁾

cannabinol、

cannabidiol

60

有されていることが明らかにされており、これらは総称してカンナビノイドと 呼ばれている

10),12),13)

⊿9-tetrahydrocannabinol(⊿9-THC) cannabinol cannabidiol Fig.1. Structure of cannabinoids.

その後、

1988

Devane

Howlett

¹⁴⁾

次いで、1990年には

Matsuda

cDNA

CB 1

受容体がクローニングされ

¹⁵⁾

1993

Munro

CB 1

cDNA

68％の相同性をもつ CB 2

¹⁶⁾

1

CB 2

受容体はどちらも細胞膜

7

G

そのアミノ酸の相同性は

44%とされている。生体内に受容体が存在することが

2

年に

Devane

anandamide

が発見された

¹⁷⁾

phosphatidylethanolamide（PE）のアミノ

arachidonic acid

N-arachidonoyl PE

phosphodiesterase

anandamide

anandamide

¹⁸⁾

anandamide

Fatty acid amide hydrolase

arachidonic acid

ethanol amine

anandamide

1

CB 2

¹⁹⁾

subfamily V member 1

から

^20),21)

1995

Sugiura

と

Mechoulum

2-arachidonoylglycerol

^22),23)

2-arachidonoylglycerol

anandamide

2-arachidonoylglycerol

2-arachidonoylglycerol

phosphatidylinositolbisphospahte

2

phosphatidylinositol

PI

monoacylglycelol lipase

arachidonic acid

²⁴⁾

anandamide 2-arachidonoylglycerol Fig.2. Structure of cannabinoid receptor ligands.

CB 1

²⁵⁾

^26),27)

1

3

さらに

2001

^28),29)

Ca ^{2 ＋}

CB 1

1

GABA

過剰な抑制がかからないように制御していると考えられている

³⁰⁾

1

1

CB 1

³¹⁾

1

³²⁾

CB 1

2

³³⁾

CB 2

^33)-35)

Ibrahim

CB 2

³⁶⁾

さらに、近年では

CB 2

^37)-40)

10

2

^41),42)

人間にとって痛みは生体に対する警告であると考えられるが、過剰で持続的 な痛みは除去する必要がある。侵害刺激による疼痛は末梢で感知された刺激が 有髄の

A _δ

C

脊髄後角における代表的な疼痛伝達物質として興奮性アミノ酸のグルタミン 酸やサブスタンス

P

^43)-45)

NMDA

NK 1

⁴⁶⁾

NMDA

NR1

2

4

を決定づける

NR2A、 NR2B、 NR2C、 NR2D

2

4

⁴⁷⁾

NMDA

4

Mg ^{2 ＋}

Ca ^{2 ＋}

⁽⁴⁸

Mg ^{2 ＋}

Ca ^{2 ＋}

いて

NMDA

i.t.投与すると投与直後より疼痛関連行動が起こることからも疼

痛の伝達に重要な役割を担っている。

11

P

NK 1

⁴⁹⁾

NK 1

Gq

C

を介した

Ca ^{2 ＋}

P

i.t.投与すると

疼痛伝達を増強する成分の一つにセカンドメッセンジャーである一酸化窒素

（nitric oxide:NO）がある。NOは

L-Arginine

⁵⁰⁾

NOS

nNOS、誘導型の iNOS

eNOS

^{51), 52)}

nNOS

iNOS

NO

NMDA

NOS

NO

NMDA-NO

⁵³⁾

新たな鎮痛薬のターゲットとして注目されているカンナビノイド受容体の活 性化が抗侵害作用を起こす研究はすでに報告されている

^{54), 55)}

CB 1

SR141716A

⁵⁶⁾

1

第一章では選択的な

CB 1

CB 1

5

第１章

カンナビノイド

1

AM251

ERK

1.1.緒言

1990

Matsuda

CB 1

¹⁵⁾

1

CB 1

mitogen-activated

protein kinase （MAP

かとなっている

⁵⁷⁾

MAP

MAP

哺乳類においては、古典的

MAPK

ERK1・ERK2

ERK5

MAPK

MAP

MAP

がリン酸化し、続いて

MAP

MAP

痛みのメカニズムを解明するための指標となっている

⁵⁸⁾

これまでの研究において

CB 1

その一方で

CB 1

SR141716A

⁵⁶⁾

SR141716A

CB 1

CB 1

AM251

6

疼痛関連行動が発現するかどうかをまず検討した。さらにその疼痛制御メカニ ズムを探るため、疼痛関連行動がどのような機構で発現しているのかを行動薬 理学的に検討し、細胞内情報伝達系である

MAP

7

1.2.

1.2.1

全ての実験には体重

22-23g

ddY

22-24℃と 50-60%にそれぞれ維持した。

1.2.2.

マウスの腰椎を指でしっかりと固定し動かないようにした後、無麻酔下で腰 椎の

5

6

1/5

5μL/マウスの割合でゆっくりと投与した ⁵⁹⁾

5μL

i.t.前処理を行った ^{60), 61)}

1.2.3.

i.t.投与の約 1

×12.5 cm）にて訓化した。薬物の

i.t.投与後すぐに、それぞれのマウスを透明

マウスは

AM251

30

AM251

30

5

SBL

CSF

dimethylsulfoxide

CSF

のを

i.t.投与し同様に行動観察を行った。

1.2.4.

AM251, ACEA, JWH-133, 7-Nitroindazole

, 1400W （Tocris） , [Tyr ⁶ ,

D-Phe ⁷ , D-His ⁹ ] Substance P

ifenprodil, CPP, D-APV, capsaicin

CP-99,994

Monoclonal

anti-phospho-p44/42 MAP kinase antibody, anti-p44/42 MAP kinase antibody

8

（Cell Signaling Technolog）を使用した。これらの薬物は滅菌人口脳脊髄液

（CSF（126.6 mM NaCl, 10.0 mM NaHCO

3 , 2.5 mM KCl, 2.0 mM MgCl 2 , 1.3 mM CaCl 2 , 1.0 mM glucose）

Capsaicin

15%DMSO

CSF

AM251

4

i.t.前

DMSO

1.2.5.

i.t.投与から 15

脊髄を取り出した。ウェスタンブロット法に用いるため、さらに腰髄の後角部 分を氷で冷やしたガラスシャーレ上で手早く解体した。

1.2.6.

組織サンプルは

0.1mL

lysis buffer reagent

50mM Tris-HCl pH8.0, 1mM phenylmetylsulfonylfluodide, 1mg/ml aprotin, 1mM sodium vanadate

×g、30 分間で遠心分離した。上澄み部分をサンプルとし、Protein assay

（BIO-RAD, Hercules, CA）を用いて全タンパク量を測定した。

サンプル（30μg protein）に

sodium dodecyl sulfate（SDS）-ポリアクリル

20%glycerol, 0.006% bromophenol blue, 10%

100

3

10

SDS-polyacrylamide gel

（BIO-RAD,Hercules,CA）に電気泳動した。電気泳動後、ゲルを

Hybond-P

（Amersham Biosciences）に転写した。

転写終了後の膜を

5%スキムミルク（和光純薬・大阪・日本）/ T-PBS（0.1%

（v/v）Tween 20を含む

PBS）にて一晩インキュベートした。

T-PBS

1:1000 anti-p-44/42 MAPK antibody）で 2

T-PBS

peroxidase-conjugated antibody

2

ECL-Plus Western blotting detection

system

Amersham Biosciences

Dolrhine-Chemi Image System（Wealtec）により可視化した後、MagicMark

western protein standard（Invirogen）を用いてタンパク質の分子量（kDa）

9

を確認した。

1.2.7.

実験は

1

10

統計学的検定は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）後

Dunnett test、また

Bonferroni test

capsaicin

student’s t-test

険率

5％未満を有意差ありとして判定した。

10

1.3 実験結果

1.3.1 AM251 i.t.投与後の SBL

AM251

i.t.投与し、 SBL

30

SBL

Licking

Scratching

10-15

CSF

0.01fmol

AM251

Fig.3. The time course of AM251-induced scratching, biting and licking response (A), and effect of varying doses of AM251 in mouse (B). Groups of mice were injected i.t. various dose of AM251 (0.000625-0.01 fmol) or CSF. The duration of scratching, biting and licking induced by AM251 (0.000625-0.01 fmol) was determined over a 30 min

0 10 20 30 40 50 60 70

CSF 0.000625 0.0025 0.01

**

* *

AM251 (fmol, i.t.)

(A)

0-5 5-10 10-15 15-20 20-25 25-30 Time after injection (min)

Be h av io ra l re sp o n se (s ec /5 m in )

CSF 0.000625 0.0025 0.01

0 25 50 75 100 125 150

AM251 (fmol, i.t.)

**

**

* (B)

B eh av io ra l r es po ns e (s ec /3 0m in )

11

period starting immediately after injection. Each value represents the mean ± S.E.M. of ten mice in each group.

★★ P<0.01, ^★ P<0.05 when compared with artificial CSF-controls.

12

1.3.2 AM251

SBL

CB 1

CB 2

AM251

CB 1

ACEA

30

SBL

ACEA

CB 2

JWH-133

を

AM251

AM251

SBL

かった。また、

ACEA

JWH-133

CSF

Fig.4. Effect of the CB 1 receptor agonist ACEA (A) and the CB 2 receptor agonist JWH-133 (B) on AM251-induced

CSF CSF 0.683 6.83 68.3 683 683 0

25 50 75 100 125 150

+ACEA (fmol) AM251 (0.01f mol, i.t.)

##

##

#

**

(A)

Be h av io ra l re sp o n se (s ec /3 0m in )

CSF CSF 0.3125 0.625 1.25 2.5 2.5 0

25 50 75 100 125 150

+JWH-133(nmol) AM251(0.01fmol, i.t.)

**

(B)

B e h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

13

scratching, biting and licking response in mice. Each agonist was co-administrated i.t. with AM251 (0.01 fmol) in a

total volume of 5 μL. The duration of scratching, biting and licking induced by AM251 was determined over a 30

min period starting immediately after injection. Each value represents the mean ± S.E.M. of ten mice in each

group. ^★★ P<0.01 when compared with artificial CSF-controls. ^## P<0.01, ^# P<0.05 when compared with AM251

(0.01 fmol) alone.

14

1.3.3. AM251

SBL

NK 1

AM251

NK 1

CP-99,994（125-2000 pmol）および sendide

30

AM251

SBL

CP-99,994

sendide

一次知覚神経終末に含有される神経伝達物質を放出することにより枯渇する

capsaicin

AM251

i.t.投与 4

i.t.投与すると AM251

性

SBL

15%DMSO

1

薬を単独で投与しても

CSF

Fig.5. Effects of CP-99,994 (A), Sendide (B), and capsaicin (C) on AM251-induced scratching, biting and licking response in mice. CP-99,994 or Sendide was co-administrated i.t. with AM251 (0.01 fmol) in a total volume of 5μL.

Capsaicin (15 nmol) was pretreated i.t. 4 days prior to i.t. injection of AM251 (0.01 fmol). The duration of scratching, biting and licking induced by AM251 was determined over a 30 min period starting immediately after injection.

Each value represents the mean ± S.E.M. of ten mice in each group. ^★★ P<0.01 when compared with artificial CSF- or vehicle (15% DMSO) -controls. ^## P<0.01 when compared with AM251 (0.01 fmol) alone.

CSF CSF 125 500 2000 2000 0

25 50 75 100 125 150

+CP-99,994 (pmol) AM251(0.01 fmol, i.t.)

**

##

##

(A)

Be h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

CSF CSF 0.5 1.0 2.0 2.0

0 25 50 75 100 125 150

**

## ##

+Sendide (pmol) AM251 (0.01 fmol, i.t.) (B)

Be h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

Vehicle Vehicle

0 25 50 75 100 125 150

+CSF +AM251

(0.01 fmol, i.t.)

**

##

capsaicin (15nmol)

capsaicin (15nmol)

(C)

B e h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

15

1.3.4. AM251

SBL

NMDA

AM251

NMDA

MK-801

（62.5-16000 pmol）、ポリアミン結合部位の競合的拮抗薬である

Ifenprodil

（2.0-8.0 pmol）、さらに競合的拮抗薬の

CPP

D-APV

（250-1000 pmol）を同時に投与して

30

SBL

MK-801、 Ifenprodil、 CPP

D-APV

NMDA

CSF

Fig.6. Effect of MK-801 (A), Ifenprodil (B), CPP (C), and D-APV (D) on AM251-induced scratching, biting and licking response in mice. Each antagonist was co-administrated i.t. with AM251 (0.01 fmol) in a total volume of 5 μL. The duration of scratching, biting and licking induced by AM251 was determined over a 30 min period starting immediately after injection. Each value represents the mean ± S.E.M. of ten mice in each group. ^★★ P<0.01 when compared with artificial CSF-controls. ^## P<0.01 , ^# P<0.05 when compared with AM251 (0.01 fmol) alone.

CSF CSF 62.5 250 1000 4000 1600016000 0

25 50 75 100 125 150

**

#

## ##

##

+MK-801 (pmol) AM251 (0.01 fmol, i.t.) (A)

Be h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

CSF CSF 2.0 4.0 8.0 8.0 0

25 50 75 100 125 150

+Ifenprodil (pmol) AM251 (0.01 fmol, i.t.)

**

## ##

##

(B)

Be h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

CSF CSF 1.25 5.0 20 20

0 25 50 75 100 125 150

**

##

#

+CPP (pmol) AM251 (0.01 fmol, i.t.) (C)

Be h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

CSF CSF 250 500 1000 1000 0

25 50 75 100 125 150

**

##

##

+D-APV (pmol) AM251 (0.01 fmol, i.t.) (D)

Be h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

16

1.3.5. AM251

SBL

NOS

AM251

NOS

L-NAME（5.0-320 nmol）

7-NI（2.5-10 nmol）

^ω -propyl-L-arginine（3.75-15 nmol）およ

iNOS

1400W（7.5-30 nmol）を同時に投与して 30

L-NAME、 7-NI、 N ^ω -propyl-L-arginine

AM251

SBL

iNOS

1400W

AM251

SBL

を示した。NOS 阻害剤を単独で投与しても

CSF

Fig.7. Effect of L-NAME (A), 7-NI (B), N ^ω -propyl-L-arginine (C), and 1400W (D) on AM251-induced scratching, biting and licking response in mice. Each NOS inhibitor was co-administrated i.t. with AM251 (0.01 fmol) in a total volume of 5 μL. The duration of scratching, biting and licking induced by AM251 was determined over a 30 min period starting immediately after injection. Each value represents the mean ± S.E.M. of ten mice in each group.

★★ P<0.01 when compared with artificial CSF-controls. ^## P<0.01 , ^# P<0.05 when compared with AM251 (0.01 fmol) alone.

CSF CSF 5.0 20 80 320 320 0

25 50 75 100 125 150

+L-NAME (nmol) AM251 (0.01fmol, i.t.)

**

#

##

##

(A)

B e h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

CSF CSF 2.5 5.0 10 10

0 25 50 75 100 125 150

+7-NI (nmol) AM251 (0.01 fmol, i.t.)

**

#

##

(B)

B e h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

CSF CSF 3.75 7.5 15 15

0 25 50 75 100 125 150

+N ^ -propyl-L-arginine (nmol) AM251 (0.01 fmol, i.t.)

**

#

##

(C)

B e h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

CSF CSF 7.5 15 30 30

0 25 50 75 100 125 150

+1400W (nmol) AM251 (0.01fmol, i.t.)

**

# #

(D)

B e h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

17

1.3.6

AM251

ERK

MEK

U0126

i.t.投与した 0.01fmol

AM251

ERK

i.t.投与 15

vehicle

i.t.投与した AM251

pERK1

pERK2

U0126（2.5nmol）を AM251

pERK1/2

AM251

total ERK

0.01fmol

の

AM251

SBL

vehicle

抑制した。U0126（2.5nmol）は

vehicle（6.71%DMSO）処置群と比べて有意

vehicle AM251 AM251+U0126 0.0

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

pERK1 pERK2

* **

## #

(B)

F o ld i n c re a s e o f p E R K l e v e ls

18

Fig8. Alterations in spinal ERK phosphorylation (pERK) after i.t. injection of AM251 and the effect of the MEK inhibitor U0126. (A) Western blots of the dorsal spinal homogenates for pERK1/2 and total ERK (tERK). Dorsal spinal cord samples were taken 15 min after i.t. injection of AM251 (0.01 fmol). U0126 (2.5 nmol) was co-administrated i.t. with AM251 (0.01 fmol). This Western blot is representative of seven independent experiments.

Densitometric quantification from (A) is shown (B). (C) Inhibition of AM251-induced behavioral response by U0126 (0.625-2.5 nmol). The total time of scratching, biting and licking response are indicated. Each value represents the mean ± S.E.M. of ten mice in each group. ^★★ P<0.01, ^★ P<0.05 when compared with vehicle (6.71% DMSO) -controls. ^# P<0.05 when compared with AM251 (0.01 fmol) alone.

Vehicle Vehicle 0.625 1.25 2.5 2.5 0

25 50 75 100 125 150

**

#

##

+U0126 (nmol) AM251 (0.01 fmol, i.t.) (C)

B e h a v io ra l re s p o n s e (s e c /3 0 m in )

19

1.3.7. AM251

ERK

N ^ω -propyl-L-arginine、1400W

nNOS

iNOS

pERK1/2

N ^ω -propyl-L-arginine

1400W

AM251（0.01fmol）と共に投与して検

N ^ω -propyl-L-arginine

pERK1

pERK2

1400W

pERK1

pERK2

CSF AM251

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

pERK1 pERK2

AM 251+

N ^ -propyl-L-arginine

# #

**

* (B)

F o ld i n c re a s e o f p E R K l e v e ls

20

Fig9. Effect of the selective nNOS inhibitor N ^ω -propyl-L-arginine (A, B) and the selective iNOS inhibitor 1400W (C, D) on spinal ERK phosphorylation (pERK) after i.t. injection of AM251 (0.01 fmol). Western blots of the dorsal spinal homogenates for pERK1/2 and total ERK (tERK). Dorsal spinal cord samples were taken 15 min after i.t.

injection of AM251 (0.01 fmol). N ^ω -propyl-L-arginine and 1400W were co-administrated i.t. with AM251 (0.01 fmol).

Densitometric quantification from (A) and (C) is shown (B) and (D). Each value represents the mean ± S.E.M. of seven mice in each group. ^{★ ★} P<0.01, ^★ P<0.05 when compared with artificial CSF-controls. ^# P<0.05 when compared with AM251 (0.01 fmol) alone.

CSF AM251 AM251+1400W

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

3.0 pERK1

pERK2

*

**

#

(D)

F o ld i n c re a s e o f p E RK le v e ls

21

1.4

これまでの動物実験で、CB

1

SR141716A

i.t.投与する

NMDA

^{62), 63)}

AM251

CB 1

ACEA

に抑制され、

CB 2

JWH-133

CB 1

AM251

CB 1

i.t.投与した AM251

P

異なり、投与後

10-15

P

i.t.投与した時に比べて Scratching

データには示していないが、

AM251

morphine（0.25-1.0 mg/kg i.p.）の前処理や、AM251

i.t.投与するこ

AM251

NK 1

Sendide）

および非競合的

NMDA

NMDA

capsaicin

TRPV1

ス

P

P

capsaicin

AM251

4

i.t.投与で前処理した際も有意な減少を示したことから、

AM251

P

ミン酸の遊離を介した

NK 1

NMDA

一次知覚神経終末から放出されるサブスタンス

P

NK 1

NMDA

²⁺

NOS

capsaicin

NO

22

センジャーとして深く関与している。本研究では非選択的な

NOS

L-NAME

7-NI、さらに nNOS

N ^ω -propyl-L-arginine

AM251

かしながら、iNOS阻害剤である

1400W

NOS

NO

iNOS

nNOS

i.t.投与した AM251

MEK

U0126

pERK

MEK

pERK

pERK

N ^ω -propyl-L-arginine

pERK1/2

pERK1

pERK2

疼痛関連行動には脊髄後角における

nNOS-ERK

AM251

CB 1

してサブスタンス

P

さらに遊離されたサブスタンス

P

NK 1

NMDA

nNOS

NO

ERK

nNOS-ERK

23

第

2

β-カリオフィレン誘発性抗侵害作用における末梢カンナビノイド 受容体とオピオイド受容体の関与

2.1.

近年、我が国ではストレスの緩和や美容を目的としたアロマテラピーが普及 している。アロマテラピーは花や木、種子などの植物を由来とする精油を用い た自然療法であり、その歴史は長い。動物および人間において嗅覚による刺激 や皮膚粘膜を介した方法で体内へ吸収されて作用を示す

^{64), 65)}

ミカン科ベルガモットの果実に含まれる

bergamot essential oil

l-linalool

linalyl acetate

capsaicin

TRPV1

受容体に作用することが知られている。

TRPV1

⁺

Ca ²⁺

（1.6μg/paw）をマウスの足底内へ投与すると、投与した足への

biting

licking

0-5

ている

⁶⁶⁾

capsaicin test

morphine

i.t.投与により用量依存的に抑制されることが知られている。

Sakurada

capsaicin test

BEO

linalool

かにしている

⁶⁷⁾

linalool

paclitaxel

68)

linalool

一方、大麻の精油成分であるβ-caryophyllene（BCP）は、丁子や黒胡椒のよ うな食用植物および香辛料に広く含まれているセスキテルペン類の精油として 知られている。現在、アロマセラピーの分野では不安や更年期症状の改善など を目的として広く用いられている。BCPには動物実験において抗炎症効果が認 められており、ラットにおいては

carrageenan

E 1

誘発性の浮腫を抑制することが示されている

^{69), 70)}

24

トリウムによって大腸炎を誘発したマウスに経口投与した場合にも抗炎症効果 が認められている

⁷¹⁾

⁷²⁾

β-caryophyllene (BCP) l-linalool linalyl acetate

Fig.10. Structure of β-caryophyllene (BCP) , l-linalool and linalyl acetate.

しかしながら

BCP

BCP

morphine

25

2.2

2.2.1

全ての実験には体重

22-25g

ddY

22-24℃と 50-60%にそれぞれ維持した。

2.2.2.

capsaicin

1

×15.0×12.5cm）にてマウスを訓化した。マイクロシリンジ（50μL）（Hamilton）

および

26

20μL

capsaicin（1.6μg/paw）液を右後

20μL

jojoba wax

Licking

Biting

測定は

capsaicin

5

2.2.3

マウスの腰椎を指でしっかりと固定し動かないようにした後、無麻酔下で腰 椎の

5

6

1/5

5μL/マウスの割合でゆっくりと投与した。

マイクロシリンジおよび注射針はペプチドの吸着を防ぐ目的で、あらかじめシ リコン化を施したものを使用した。

2.2.4

capsaicin, BCP, naloxone hydrochloride, naloxone methiodide,

β-funaltrexamine（β-FNA）,

nor-binaltorphimine（nor-BNI）, naltrindole hydrochloride（NTI), antiseram against

AM251, AM630 （Tocris）, morphine hydrochloride （Sankyo）,を使用した。各薬物は

capsaicin

dimethylsulfoxide（DMSO）に溶解後、生理食塩水にて希釈し

BCP

jojoba wax

jojoba wax

capsaicin

26

投与

10

morphine hydrochloride

i.t.投与は滅菌人口脳脊髄液（CSF（126.6 mM NaCl, 10.0 mM NaHCO 3 , 2.5 mM KCl, 2.0 mM MgCl 2 , 1.3 mM CaCl 2 , 1.0 mM glucose）

2.2.5

実験は

1

10

グループ間の統計学的検定は、分散分析（ANOVA）後に多重比較（Dunnett test）

を行った。いずれも危険率

5％未満（p<0.05）を有意差ありとして判定した。