熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repositor Title マクロファージにおける酸化低比重リポ蛋白質による PPARα PPARγ 活性化機序およびその意義 Author(s) 竹田, 佳代 Citation Issue date Type

熊本大学学術リポジトリ

Kumamoto University Repository System

Title

マクロファージにおける酸化低比重リポ蛋白質による

PPARα、PPARγ活性化機序およびその意義

Author(s)

竹田, 佳代

Citation

Issue date

2009-03-25

Type

Thesis or Dissertation

URL

http://hdl.handle.net/2298/14409

Right

　　学位論文

Doctor’s　Thesis

マクロファージにおける酸化低比重リポ蛋白質による

　　　PPARα、　PPARγ活性化機序およびその意義

　　（Impact　and　mechanism　of　Ox-LDL-induced

　　PPARα　and　PPARγ　activation　in　macrophages）

　　　　　　　竹田　佳代

　　　　　　　Kayo　Taketa

熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻代謝内科学

　　　　　　　指導教員

熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻代謝内科学

　　　　　　荒木　栄一　教授

　　　　　　　2008年3月

学位論文

Doctoti’s　Thesis

マクロファージにおける酸化低比重リボ蛋白質による

　PPARα、PPARγ活性化機序およびその意義

　Impact　and　mechanism　of　Ox－LDL－induced

PPARct　and　PPARLy　activation　in　macrophages

著者名

竹　田　　佳　代

kayo　Taketa

指導教員名

審査委員名

熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻代謝内科学

　　　　　　荒木　　栄一　教授

病態生化学担当教授

分子遺伝学担当教授

循環器病態学担当教授

心臓血管外科学担当教授

氏　名

氏　名

氏　名

氏　名

山縣　和也

臨池　雄一

小川　久雄

川筋　道雄

2008年3月

目次一

1．要旨＿＿＿＿＿＿．．＿＿＿＿＿．＿．＿．．＿＿＿＿＿．＿＿＿＿＿＿．．．＿＿＿＿＿＿．，．＿1

2．発表論文リスト．．．．．．．．．＿．．．一．．．＿＿＿．．．＿．＿．．．．．．．．＿＿．．＿：．．．．．＿＿．．．＿．．＿．．．．．．＿．4 3．謝辞．．．．．．．．．＿．．．一亀一．＿亀q．．噂9の．．、．Q．．．．．亀＿一＿＿一＿．．Gbb亀．．＿＿＿．＿．，D一＿．．b亀＿．◆＿。．＿一一．5 4，略語一覧＿．．．．．．．．．。．．．．＿．＿．．．一．．．．．．＿．．．．．．．。．．．．．＿．．．一．．＿．＿＿．．．．＿＿＿＿．．．．．．．．＿＿．6 5．研究の背景と目的．．＿＿＿．＿．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．＿．．．．．．．．．＿，．．。．．．．．．．．＿＿．．．．．．．．．．．．．．．．＿9 5一（1）粥状動脈硬化の進展過程．．＿．一一＿．。．．．．．．．．．．＿，＿．．．．．＿．．．．＿一．．＿．．＿．．．＿．．．＿．．．．．．g 5一（2）粥状動脈硬化病変形成における酸化LDLの役割．．＿．．．．．＿＿．．．．．．＿＿．．．．．．．．＿＿10 　5一　（3）Peroxisome　proliferator－activated　receptor　（PPAR）　．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，13

　（1）PPARサブタイプ＿＿＿＿＿＿．＿＿＿＿＿＿．．．＿＿＿＿．．＿．．＿＿＿＿．＿＿．14

　（ll）PPARsの構造．．．一一．．＿。一．．．．．．．．．．．一＿．．．一一．＿＿．＿．一．．＿．．．．．．．．＿．＿＿．．．．．．．．．．．．．＿14 　（皿）PPARsの機i能＿．．＿．．．。．．．＿．．＿．．．．．．．．．．．．．一＿＿．＿．．．．．．．．＿＿．＿．．＿．．．．．．．．．．．．．．．」5 5一（4）PPARαと動脈硬化症．＿．．．＿．．．．．＿＿．．．．．．．．．t．．．．．＿．＿．＿．．．．＿．．．．．．．．．．＿＿＿16 5一（5）PPARγと動脈硬化症。．．．．．．．一．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．＿．．．．．＿．．．．．．＿一一．．．．一＿．．．．＿．．＿．．．．18 5一（6）酸化LDLによるPPAR．α、　PPARγ活性化作用．．．．＿．．．．一一＿＿一．．．＿＿＿．．．＿．．．．．19 5一（7）本研究の目的．．．．．．．．＿＿．．．．．．．．．．．．．．．一一＿．．．．．．．．．．＿．．．．．．．．＿．．．．一．．．．。．．．．．＿．．．．．．＿19 6．材料と実験方法＿．＿一一＿．．．．．．．．．．．．＿．．．．．．．．．．＿。．＿＿＿．＿．．．．．．＿．．．．．．＿＿．．＿．．．．．．．＿．21 　6一（1）リポタンパクの精製．．．．．＿．．．．．．．．＿．．．一一．．＿．．．．．．．．．．．．，．．．．．．＿．．．．．．．．．．．．．＿＿．．．．．．．21 　6一（2）酸化LDLの調整＿＿．．．．．＿．＿＿＿．．＿＿＿＿．．＿＿．＿＿．＿．．．．＿＿．＿＿＿．．＿21 　6一　（3）　糸田A包．．『．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．＿．．．．．．．．．．．齢．．．．．．．．．．．∂．．．．一t．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．22 　6一（4）実験動物＿．．．．．．．．．．．．．．．．．一＿＿．．＿．．．．．＿＿＿．．．．．．．一一．．．．，．．．．．．．．．．．．．＿．．．．．．．…・＿・23 　6一（5）組織免疫染色．．＿＿．．．．．．．．．．．．＿．＿．．．．．■■．．。＿．．．．＿．．＿．．．．．．＿．．．．．．．．．．．．．．．．．．＿．＿23 　6一（6）PPARα、　PPARγ活性（fU11－length　PPAR　assay）の検討＿．．．．，．．．．．．．＿．．。．．．＿＿23

6一（7）PPARα、　PPARγリガンド結合活性（PPAR　ligand－binding　assay）の検討．．．．．．＿．．．24

6一（8）Enzyme－linked　immunosorbent　assay（E：LIZA）によるPPARs転写活性測定．．．．．．．．．25

6一（9）NF－id3活性測定．．＿＿．．．．．＿．．．．．．＿＿．．．．．．．．．．．．．．．．．＿．．＿．＿．＿．一．．．．．＿．．．．．．．＿25 6一（10）short　interfering　RNA（siRNA）の導入＿．．．．．．．．＿．．＿．．．＿＿＿．．．＿＿＿．．＿＿．．＿．26

6一（11）RT－PCR法によるCOX－2、　ABCA1、　MCP－l　mR：NA発現の検討＿＿．．＿t一＿．＿26

（A）RNAの抽出＿＿＿＿．．．．＿．＿＿＿＿＿＿．．．＿＿＿．＿＿＿＿＿＿。．，＿＿＿．＿＿26

（B）real－time　RT－PCR法によるCOX－2、　ABCA1、　MCP－l　mRNA発現量の定量．．．一．．．＿27

6一（12）ウェスタンプロット法による蛋白質リン酸化および蛋白質発現の検討．．．．．．．．．28

（A）蛋白精製＿＿＿＿．＿＿．＿＿＿＿＿＿．．．．＿＿＿＿＿＿．＿＿＿．＿＿＿。．．＿＿＿．28

（B）ウェスタンプロット法＿．＿．＿＿＿．．＿＿＿＿＿＿．．．＿＿＿＿＿＿．．＿＿．．＿＿29

6一（13）アデノウイルスベクターを用いた優性ネガティブ変異体の強制発現．．＿＿＿30

6一（14）Enzyme　lmmunoassay（EIA）による15d－PGJ2、　PGE2、　PGD2測定＿＿＿＿．＿＿30

6一（15）ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸組成の検討．．．．．．．．．．．．．．＿．＿．．．＿＿＿31 6一（16）統計学的解析．．．．．．．＿．．．．．．．＿．＿．．．．．．．。．．．＿一一．．．．．．．．．．．．＿．．，．．．．．．．．．．．．一．．一．．．．．．．31 7．実験結果．．．一一．．．．．．．一．．．＿．．．．．，．．．．．．一．．．．．．．，＿．．．．．．．＿．＿．．．．．．．．＿．＿一一．一一一．．．．．．．．＿＿．．．．．．．32

　7一（1）マクロファージにおける酸化LDLによるPPARα、　PPARγ活性化の検討．．＿＿．．．＿32

　7一（2）マクロファージにおける酸化LDLによる

　　　　　　PPARα、　PPARγ活性化に対するCOX－2の検討．．．．．．．＿．．．＿　．＿．35

　7一（3）酸化LDLのCOX－2発現増加に対するERK1／2の関与の検討．．．．．．．．＿＿．．＿．．．．＿37

　7一（4）マクロファージにおける酸化LDLによる細胞内脂質、15d－PGJ2検討＿＿．．．．＿．39

　7一（5）ApoEノックアウトマウスの動脈硬化病変における

　　　　　　COX－2、15d－PGJ2発現とPPARoc、　PPARγ活性化の検討．．．．．．．．＿．＿．．43

　7一（6）マクロファージにおけるPPARα、　PPARγ阻害による

　　　　　　酸化LDLによるABCA－1　mRNA発現の検討＿．＿＿．．．．．．．．＿＿．．・，．．．．＿，．45

　7一（7）マクロファージにおける酸化LDLによる

　　　　　　　MCP－1　mRNA発現におけるPPAR活性化の検討．．　　　　＿．．．．＿＿48

8．考察＿＿＿＿＿＿＿．．＿．．＿＿＿＿．＿．．＿一．＿．．．．．＿＿一．＿＿．．．．＿　　＿＿＿＿51

9．結語．．．．．．．．＿．．．一．．．．．＿．．．．．＿＿．．．．．．．．．＿．＿．．＿．．．＿．6．＿．＿＿．．．＿．＿　＿．＿．．＿．56 10．参考文献＿一．．．．＿．．．。．一．．．一一＿．．．．．．．．．．．＿．＿一．．．．．・・．・・．・．．・・一・．・・．………　　　…．．…58

1．要旨

　動脈硬化症の惹起分子の一つである酸化低比重リボ蛋白質（oxidised　low　density　lipo

protein；酸化LD：L）が、抗動脈硬化作用を有するperoxisome　proliferator－activated　receptor

（PPAR）一α（PPARα）やPPARyを活性化することが報告されている。しかしその詳細な機序、

臨床的意義については不明な点が残されている。本研究ではマクロファージにおける酸化

LDLのPPARα、　PPARγ活1生化の機序とその意義について検討した。

　酸化LDLはマクロファージにおいて濃度依存性にPPARα、PPARγ活1生化を誘導したが、

LDLではその効果は認められなかった。また、酸化LDLはcyclooxygenase－2（COX－2）の

mRNA、蛋白の発現をともに増加させ、　COX－2の発現を阻害すると、酸化：LDLによるPPARα、

PPA：Rγ活1生化は有意に抑制された。さらに、酸化LDLはextracellular－signal　regulated　kinase

1／2（ERK　l／2）、　p38　mitogen－activated　protein　kinase（p38MAPK）のリン酸化を誘導し、　ERK　1／2

の阻害剤では酸化LDLによるCOX－2の発現とそれに引き続くPPA：Rα、　PPARγ活1生化は抑

制されたが、p38MAPKの阻害剤では抑制されなかった。

　酸化LDLは細胞内の長鎖脂肪酸（アラキドン酸、リノレイン酸、オレイン酸、ドコサヘ

キサエン酸）を減少させるが、ERK　1／2の活性化に起因するCOX－2の発現増加と、それに

引き続く15－deoxy一△i2’i4－prostaglandin　J2（15d－PGJ2）の発i現増加を誘導した。このPPARγ

の直接的なligandとして知られている15d－PGJ2は、、PPARγだけではなくPPARαも活性化

した。

　さらにApoEノックアウトマウスの動脈硬化病変において、　COX－2、15d－PGJ2発現の上

昇やPPARα、　PPARγの活性上昇が認められた。

　次にこの酸化LDLによるCOX－2発現を介したPPARα、　PPARγの活性化の動脈硬化発症

進展に対する意義を検討した。興味深いことにPPARα、　PPARγを特異的に阻害すると、

ATP－binding　cassette　transporter　A　1（ABCA1）のrnR：NA発現が有意に抑制され、血中単球の

　　　　　　1

走化因子であるmonocyte　chemotactic　protein　1（MCP－1）のmRNA発現は増強した。

　これらのことから、酸化LDLにて刺激を受けたマクロファージでは、　ERK1／2－COX－2シグ

ナルを介してPPARα、　PPARγが活性化され、その結果、　MCP－1発現などの動脈硬化惹起分

子の抑制と、ABCA1などの動脈硬化抑制分子の産生により、動脈硬化惹起性の過剰応答を

抑制している可能性が示唆された。

2

Summary

　　　　　　　　It　has　been　reported　that　o）ddized　low－density　lipoprotein（Ox－LDL）can　activate　both peroxisome　proliferator－aetivated　receptor　（PPAR）一ct　（PPARct）　and　PPARy．　However，　the　detailed mechanisms　of　Ox－LDL－induced　PPARa　and　PPARy　activation　are　not　fully　understood．　ln　the present　study，　we　investigated　the　effect　of　Ox－LDL　on　PPARct　and　PPARy　activation　in macrophages．　Ox－LDL，　but　not　LDL，　induced　PPARct　and　PPARy　activation　in　a　dose－dependent manner．　Ox－LDL　transiently　induced　cyclooxygenase－2　（COX－2）　mRNA　and　protein　expression， and　COX－2　specific　inhibition　by　NS－398　or　meloxicam　or　siRNA　of　COX－2　suppressed Ox－LDL－induced　PPARor　and　PPARy　activation．　Ox－LDL　induced　phosphorylation　of　ER［K　l／2　and p38　MAPK，　and　ERK　I／2　specific　inhibition　abrogated　Ox－LDL－induced　COX・一2　expression　and PPARa　and　PPARy　activation，　whereas　p38　MAPK　specific　inhib　ition　had　no　effect．　Ox－LDL decreased　the　amounts　of　intracellular　long－chain　fatty　acids，　such　as　arachidonic，　linoleic，　oleic and　docosahexaenoic　acids．　On　the　other　hand．　Ox－LDL　increased　intracellular 　　　　　　　’ 15－deoxy－Ai2’i4－prostaglandin　J2　（15d－PGJ2）　level　through　ERK　I／2－dependent　overexpression　of COX－2．　Moreover，　15d－PGJ2　induced　both　PPARct　and　PPARy　activation．　Furthermore，　COX－2　and 15d－PGJ2　expression，　and　PPARs　activity　were　increased　in　atherosclerotic　lesion　of　apoE－deficient

mice．　Finally；we　investigated　the　involvement　of　PPARαand　PPA：Rγon　Ox－LDレinduced　mRNA

expression　of　ATP－binding　cassette　transporter　Al　（ABCAI）　and　monocyte　chemoattractant protein－1（MCP－1）．　lnterestingly，　specific　inhibition　of　PPARor　and　PPARy　suppressed

Ox－LDレinduced　ABCAl　mRNA　expression，　and　enhanced　Ox。LDL－induced　MCP－l　mRNA

expression．　In　conclusion，　Ox－LDL－induced　increase　in　15d－PGJ2　level　through　ERKI／2－dependent COX－2　expression　is　one　of　the　mechani　sms　ofPPARct　and　PPARy　activation　in　macrophages． These　effects　of　Ox－LDL　may　control　excess　atherosclerotic　progression． 3

2．発表論文リスト

1

2

3

4

5

Kayo　Taketa，　Takeshi　Matsumuq　Miyuki　Yano，　Norio　lshii，　Takafumi　Senokuchi，　Hiroyuki

Motoshima，　Yusuke　Murata，　Shokei　Kim－Mitsuyama，　Teruo　Kawada，　Hiroyuki　ltabe，　Motohiro　Takeya， Takeshi　Nishikawa，　Kaku　Tsuruzoe，　and　Eiichi　Araki．　Ox－LDL　activates　PPARct　and　PPARy

through　MAPK－dependent　COX－2　expression　in　macrophages．　」　Biol　Chem．

283（15）：9852－9862，　2008． Miyuki　Yano，　Takeshi　Matsumura，　Takafumi　Senokuchi，　Norio　lshii，　Yusuke　Murata，　Kayo

Taketa，　Hiroyuki　Motoshima，　Tetsuya　Taguchi，　Kazuhiro　Sonoda，　Daisuke　Kukidome，　Yoh

Takuwa，　Teruo　Kawada，　Michael　Brownlee，　Takeshi　Nishikawa，　and　Eiichi　Araki．　Statins activate　peroxisome　proliferator－activated　receptor－y　through　extracellular　signal－regulated kinase　1／2　and　p38　mitogen－activated　protein　kinaserdependent　cyclooxygenase－2　expression in　Mmacrophages．　Circ　Res．　100：1442－1451，　2007．

Yusuke　Murata，　Kaku　Tsuruzoe，　Junj　i　Kawashima，　Noboru　Furukawa，　Tatsuya　Kondo，

Hiroyuki　Motoshima，　Motoyuki　lgata，　Kayo　Taketa，　Kazunari　Sasaki，　Hideki，　Kishikawa，　C． Ronald　Kahn，　Tetsushi　Toyonaga，　and　Eiichi　Araki．　IRS－1　transgenic　mice　show　ingreased epididymal　fat　mass　and　insulin　resistance．　Bioehem　Biophys　Res　Commun．　364：301－307， 2007．

Noboru　Furukawa，　Nobuhiro　Miyamura，　Kenro　nishida，　Hiroyuki　Motoshima，　Kayo　Taketa，

Eiichi　Araki．　Possible　relevance　of　alpha　lipoic　acid　contained　in　a　health　supplement　in　case of　insulin　autoimmune　syndrome．　Diabetes　Res　Clinic　P｝，act．　75：366－367，　2007

Tatsuya　Kondo，　Saori　Tomita　，Hironori　Adachi，　Hiroyuki　Motosima，　Kayo　Taketa，　Akiko

Matsuyoshi，　Hiroshi　Tokunaga，　Nobuhiro　Miyamura，　and　Eiichi　Araki．　A　case　of

hyperinsulinemia　of　undetermined　origin，　successfully　treated　with　long－acting　octreotide． Endocr　J．　52：511－517，　2005．

4

3．謝辞

　本研究は熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻内科治療学講座で、荒木栄

一教授による御指導の下に行いました。研究について多面にわたり御指導を頂き、深く感

謝致します。

熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻内科治療学講座助教　水流丁丁博士

には、論文作成及び日頃の研究の中で貴重な御指導、御助言を頂きました。

　本研究の施行にあたり、熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻内科治療学

講座医員松村剛博士、本島寛之博士に実験の細部に至るまでの御指導、御助言を頂きまし

た。

　さらに熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻内科治療学講座技官一ノ瀬

賢司氏にも、御助言を頂きました。

　最後に、熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻内科治療学講座研究室の皆

様には日頃から御助言、御協力を頂きました。

　皆様に心より感謝致します。

5

4．略語一覧

M　arachidonic　acid

M－1，　activator　protein－1 ApoE，　apolipoprotein　E ABCAI，　ATP－binding　cassette　transporter　Al

cDNA，　complementary　deoxyribonucleic　acid

CIEBPB，　CCAATIenhancer－binding　protein－B

COX，　cycloxygenase

DBD，　DNA　binding　domain

DMSO，　dimethyl　sulfoxide

DN，　dominant　negative

DR，　direct　receptor 15d－PGJ2，　15－deoxy－Ai2’i4－prostaglandin　J2

EDTA，　ethylenediaminatetraacetic　acid

ELISA，　enzyme－linked　immunosorbent　assay

ERK　I／2，　extracellular－signal　regulated　kinase　1／2 FCS．　fetal　calf　serum 　　　’

GM－CSF，　granulocyte／macrophage　colony－stimulating　factor

田）］L，h量gh－density　lipoprotein

HDL－C，　HDL　cholesterol

HEPES，　N－2－hydroxyethylpiperazine－N’一2－ethanesulfonic　acid

HODE，　hydroxyoctadecadienoic　acid

ICAM－1．　intracellular　adhesion　molecule－1 　　　　　　　’ 　　　　　　6

llL．　interleukin 　　， iNOS，　inducible　nitric　oxide　synthase LBD，　ligand　binding　domain LDL，　low　density　lipoprotein LPL，　lipoprotein　lipase

LPS，　lipopolysaccharide

LXRct，　liver　X　activated　receptor　alpha MAPK，　mitogen－activated　protein　kinase M一・CSF，　macrophage　colony－stimulating　factor MCP－1，　monocyte　chemotactic　protein　1

Mm－Ox－LDL，　macrophage－mediated　oxidized　low　density　lipoprotein

m－Ox－LDL，　mildly　oxidized　low　density　lipoprotein NF－1くB　nuclear　factor　1くB 　　　　　　’ Ox－LDL，　oxidized　low－density　lipoprotein PAI－1，　plasminogen　activator　inhibitor－1

PAGE，　polyacrylamide　gel　electrophoresis

PB　S，　phosphate－buffered　saline PDGF，　platelet　derived　growth　factor PGD2，　prostaglandin　D2 PGE2，　prostaglandin　E2 PMA　，　phorbol　myristate　acetate PPAR，　peroxisome　proliferator－activated　receptor PPRE，　peroxisome　proliferators　response　element RT－PCR，　reverse　transcription－polymerase　chain　reaction 　　　　　　7

RXR，　retinoid　X　receptor SDS，　sodium　dodecyl　sulfate SR．　scavenger　receptor SREBP，　sterol　regulatory　element－binding　protein TBARS．　thiobarbituric　acid－reactive　substabces 　　　　　　’ TC，　total　cholesterol TG，　triglyceride TNF．　tumor　necrosis　factor 　　　　） TZDs　．　thiazolidinediones 　　　　　’ UCP　I，　uncoupling　proteins　1 VCAM－1．　vascular　cell　adhesion　molecule－1 　　　　　　　　’ VSMCs．　vascular　smooth　muscle　cells 　　　　　　’ WT，　wild　type 8

5．研究の背景と目的

本章では本研究の背景と目的について述べる。先ず、5一（1）では粥状動脈硬化の形成及び

進展過程を、5一（2）では粥状動脈硬化病変進行過程における酸化LDLの役割について歴

史的背景もふまえ述べる。5一（3）ではPPARに関する知見を述べ、特に5一（4）ではPPARα

と動脈硬化症との関連を、5一（5）ではPPARγと動脈硬化症との関連を、述べる。また5一

（6）では酸化LDLによるPPARα、PPARγの活性化についての既存の報告について述べる。

以上、5一（1）～（6）をふまえて5一（7）では本研究の目的について述べる。

5一（1）粥状動脈硬化の進展過程

　初期の粥状動脈硬化は、動脈内皮表面にごく小さな斑点状の脂肪沈着として認められる

脂肪線条（fatty　streak）と呼ばれる病変である。脂肪線条は主としてコレステロv・一・一ルエステ

ルを多量に蓄積したマクロファージ由来泡沫細胞の集籏であることが明らかにされている

（Rosenfeld　et　al。1990，　Spagnoli　et　al，1991）。病変の進行に従い、脂肪線条は線維性硬斑

（fibrous　plaque）に移行する。線維性硬斑は肉眼的には血管内腔に突出する硬性の隆起病

変として認められるが、組織細胞学的には平滑筋細胞、マクロファージ、Tリンパ球の浸潤

及びそれらの細胞壊死像ならびに脂肪蓄積を結合組織が被覆した状態である。さらに病変

が進むと結合組織がより増加し、：石灰化や血栓の付着を伴う複合病変へと進展する。この

様な粥状動脈硬化病変の発症、進展の機序については、R．ossの提唱した傷害反応仮説

（Response　to　lnjury　Hypothesis）がある（Ross．1999）。この仮説は、まず何らかの刺激（紫

外線、酸化ストレス、一酸化窒素、高血糖、高血圧、喫煙等）により内皮細胞に障害が生

じ、それに対する反応として液性因子を介した応答が細胞間で繰り返され、結果として病

変が進行するとしたものである。当初、血管内皮細胞に接着した血小板に重点がおかれて

　　　　　　　9

いたが、現在単球及びリンパ球の関与を中心に考えられている。現時点では、以下のよう

な過程を経て粥状動脈硬化症は発症、進展していくと考えられている（図1）。

（1）何らかの刺激による内皮細胞の血管恒常性維持機構の破綻と接着分子の発現

（2）単球、Tリンパ球の内皮細胞への接着及び内皮細胞下への侵入

（3）リボ蛋白の内皮細胞下への浸潤及び酸化修飾などによる動脈硬化惹起性リボ蛋白への

　　変化

（4）単球から分化・成熟したマクロファージの動脈硬化惹起性リボ蛋白による泡沫化

（5）泡沫細胞からの様々なサイトカイン放出

（6）中膜平滑筋細胞の内膜への遊走、内膜での増殖、及び泡沫化

（7）血管構成細胞による細胞間基質の産生と蓄積

　　　　　　　LD殴容体　　　　　　　native、LDL　　血管内腔

　　　　　　　o

　　　　　　単磁鯉／儲分子

　　　　　　　血管内皮

　　　　　　　細胞

　　　　　　　↓函

マ。。＿◎＿＿姦…酸化修飾

　　　　　　　スカ塞蓉謀ヤー　　　　　　酸化LDL　　内膜

　　　　國畢

1鋸錘iiiiiil…1＿＿

　　　　　　　中膜

　　　　　　　　　脂肪滴

　図1：動脈血管壁における泡沫細胞の形成機構

　血中単球は、血管内皮細胞表面の接着分子を介し内細胞の間隙を抜けて内皮下へ侵入し分化・成熟して

　マクロファージになる。このときLDL受容体の消失とマクロファージスカベンジャー受容体の発現が認

　められる。また血中LDLも血管内皮細胞下へ移行すると内皮細胞などから産生されるフリーラジカルの

　作用により酸化的な修飾を受け、酸化L肌へと変化する。マクロファージは、スカベンジャー受容体を

　介して酸化LDLを取り込みコレステロールエステルを多量に蓄積した泡沫細胞へ変化し、動脈硬化初期

　病変が形成される。

5一（2）粥状動脈硬化病変形成における酸化LDLの役割

　動脈硬化初期病変である脂肪線条（fatty　streak）の組織学的特徴は、細胞内に大量のコレ

ステロールエステルを蓄積したマクロファージ由来泡沫細胞の集籏を認めることである。

　　　　　　10

多くの疫学的研究により、血中low－density　lipoprotein（LDL）コレステロール高値と狭心

症や心筋梗塞などの虚血性心疾患の発症頻度が強い相関を示すことは明らかとなってきた

が、LDL高値がいかなる機序で粥状動脈硬化の発症、進展に関与するかは、長い間不明で

あった。家族性高コレステロール血症はLD：L受容体の遺伝的欠損であるが、それにも関わ

らず動脈壁にはコレステロールエステルを大量に蓄積したマクロファージ由来の泡沫細胞

が認められることから、マクロファージはLDL受容体を介さない経路でコレステロールを

取り込み、泡沫細胞となると考えられた。実際、静脈血から得られたLDLを単球／マクロフ

ァージに接触させるだけでは泡沫化は生じない。そこで、GoldsteinらはLDLが生体内で何

らかの修飾を受けることにより化学修飾LD：しとなり、マクロファージに認識され取り込ま

れるという仮説をたて、マクロファージを泡沫化させるリボ蛋白質（動脈硬化惹起性リボ

蛋白質）の検索を行った。以前よりマクロファージは陰性荷電を持つ粒子に対する高親和

性結合部位の存在が考えられていた。LDLを無水酢酸と反応させてリジン残基のε一アミノ

基にアセチル基を選択的に導入したアセチルLDLは陰1生荷電が増加することが判明し、ま

たエンドサイトーシス型の受容体を介して迅速かつ活発に取り込まれ、マクロファージの

泡沫化を来すことが発見された（Goldstein　et　al．1979）。現在そのアセチルLDLに対するマ

クロファージの膜受容体はマクロファージスカベンジャ・・一…受容体と呼ばれ、細胞内コレス

テロールレベルによる発現調節を受けず活発にアセチルLDLを取り込むという特徴を有す

る。この受容体は、1990年にKodarnaらにより構造が決定されている（Kodama　et　al．1990）。

この他にも現在までに構造の異なるスカベンジャー受容体が次々に明らかにされている。

　さて、アセチルLDLはスカベンジャー受容体を介してマクロファージに取り込まれるこ

とにより実験的な泡沫細胞を形成させることはできるが、無水酢酸などの反応性の高いア

セチル基の供与体が生体内に存在することは考えにくいため、生体内で起こり得るLDL

の化学修飾が検索された。そこでSteinbergらはLDLを血管内皮細胞と共培養し、そこで

得られた化学修飾LDLは、マクロファージに取り込まれて泡沫化を起こす性質を持つこと

　　　　　　　11

を発見した（Henriksen　et　al．1981）。この化学修飾LDLは遷移金属イオンにより酸化され

た化学修飾：LDLと同一のものであることが確認され、酸化LDLと命名された。生体の血

液中には多量の抗酸化物質が存在し、また酸化LDLは肝臓において速やかに代謝されるこ

とから、：LDLの酸化は血液中ではなく主に血管壁内において起こると考えられている。こ

の過程においては血管構成細胞である血管内皮細胞、マクロファージ、あるいは平滑筋細

胞などが関与する細胞依存性酸化反応と銅イオンや鉄イオンなどの遷移金属の作用による

酸化修飾（化学的酸化反応）の二つの反応が関与していると考えられている。

　動脈硬化巣に：おける酸化LDLの存在は免疫組織学的に証明されており（O’Brien　et　al，

1991）、現在では酸化LDLが動脈硬化惹起性リボ蛋白質として動脈硬化病変の進展に中心

的役割を果たしていると考えられている（Steinberg　et　al．1989）。これまでに数多くの酸化

：LDLの生理作用が報告されている。（1）マクロファージの泡沫化、（2）単球の血管内皮

への遊走能増強（酸化LDL単独でも遊走因子として働き、また血管内皮細胞に対し

monocyte　chemotactic　protein　1（MCP－1）の産生を誘導することにより単球の血管内皮下へ

の遊走を促す。）、　（3）マクロファ・・一…ジを病変部位へ留める作用、　（4）内皮細胞におけ

る接着分子（intracellular　adhesion　molecule－1：ICAM－1、　vascular　cell　adhesion　molecule－1：

VCAM－1）の発現充進、（5）内皮細胞でのエンドセリン産生の増加による内皮細胞依存性

血管弛緩作用の抑制効果、　（6）内皮細胞からのplasminogen　activator　inhibitor－1（PAI－1）

産生の増加による血栓形成の促進、（7）マクロファージの増殖作用、（8）platelet　derived

groWth　factor（PDGF）やその受容体を発現させることによる血管平滑筋細胞の遊走や増殖

誘導などがあげられる。

　なお、ここに示している以外にも様々な酸化LDLの生理作用が報告されており、酸化

LDLは動脈硬化病変のあらゆる進展過程に深く関わっている。

12

5一（3）Peroxisome　proliferator－activated　receptor（PPAR）

ペルオキシゾーム増殖剤活性化型受容体（peroxisome　proliferator－activated　receptors：PPARs）

の発見は1990年代初頭のPPARαの発見に端緒を有する。その後PPARβ／δ、　PPARγが次々

に発見された。以来10数年間、この3種類のサブタイプを有するPPARsの研究は大きく

展開してきた。その理由の第一は、PPARsが生体の糖・脂質代謝のみならず、発癌、骨代

謝、炎症、線維化などにおいて多様な生理機能を有し、したがって糖尿病、高脂血症、肥

満などの生活習慣病、癌、炎症性疾患、動脈硬化症など多くの疾患の成因への関与が明ら

かになってきたことである。その理由の第二は、PPARγアゴニストであるチアゾリジン誘

導体が糖尿病治療薬として、PPARαアゴニストのフィブラート薬が高脂血症治療薬として、

それぞれの疾患の治療の上で重要な位置を占めるようになり、またさらに多くのPPARs標

的薬が開発中であり、創薬の大きなうねりが続いていること、第三に基礎研究の進歩があ

げられる。PPARsとリガンドの相互作用の立体構造の解明、コアクチベーターやリプレッ

サーの機能や転写制御のメカニズムの解明など、この分野の基礎研究も更に発展を続けて

いる。

13

（1）PPARサブタイプ

発現部位

機能

代表的リガンド

PPARα

肝臓、骨格筋、褐色脂肪細胞、血管、

}クロファージ

脂肪酸燃焼、

Gネルギー消費

ブイブラート薬

ｷ鎖脂肪酸

vy　l4643

PPARβ／δ

骨格筋、血管、マクロファージなど普

ﾕ的に発現。

脂肪酸燃焼

Gネルギー消費

長鎖脂肪酸

PPARγ

γ1：白色脂肪細胞

ﾁ2：白色脂肪細胞、血管、マクロファ

[ジ

脂肪細胞分化

塩b蓄積

恆緕ﾓ

チアゾリジン誘導体

P5d－PGJ2

塩b酸酸化物

表1：PPARの特徴

　PPARのサブタイプは現在、α、β／δ、γの3型が報告されている。それぞれの特徴を上に

示す（表1）。

（ll）PPARsの構造

PPARの一次構造については、すべてのサブタイプで他の核内レセプターに特徴的なN

末端側DNA結合ドメイン（DNA　binding　domain：DBD）とC末端側リガンド結合ドメイン

（ligand　binding　domain：L：BD）が存在する。　DBDはアミノ酸配列上、よく保存されている

が、それに比べて、LBDのホモロジーは低い。しかし3つのサブタイプいずれにもクロス

するリガンドが存在することなどから、LBDの基本的な立体構造はすべてのサブタイプで

極めて類似していると考えられる（図2）。

14

PPAR　ct

PPAR　P

PPAR　y

H3N

H，N

H3N

1

M－1

　ri－i

101　166

244 AF－2 ri－i 468 AF－1 AF－2 1　　　　　　　　7　　　　　　　137　　　　　　　215　　　　　　41

・黙慧

禁一w、“鳩＿w＿＿醜湖鞘＿w＿ww獣 一一一…… kB】）

㎜」蝋、w

一

叢懸

AF－1

COOH

AF－2

COOH

1　　　　　　1　　　　　　　　175　　　　　　　　251

＿嘉

一

難DBD讐…

一一一一一溜LB】）一一一一職構糊

懸蝋、

_{＿粘鞭＿＿撚懸懲撚目}

COOH

図2：PPARの構造

DBD　：DNA－bindmg　domatm．　LBD　：Ligand－binding　domain．　AF－1　：Ligand－independent　Activaion　domain． AF－2　：Ligand－dependent　Activaion　domain

また、PPA：RのN末端とC末端にはそれぞれ転写活性領域AF－1（L，igand－independent

Activation　domain）、AF－2（Ligand－dependent　Activation　domain）と呼ばれる領域が存在する。

AF－1はプロテインキナーゼによってリン酸化を受けることにより、リガンド非依存性に転

写活性を調節する。AF－2はLBDと大きく重複しており、リガンドの結合だけでなくコア

クチベーター等の共役因子との相互作用により標的遺伝子の転写活性調節に大きく関与し

ている。

（皿）PPARの機能

　PPARは活性化すると、レチノイドXレセプター（Retinoid　X　receptor：RXR）と安定なヘ

テロダイマーを形成する。PPAR：RXRのヘテロダイマーは標的遺伝子の転写開始部位の上

流に存在するペルオキシゾーム増殖剤応答領域（peroxisome　proliferators　response　element：

　　　　　　　15

PPRE）に結合し、標的遺伝子の転写活性を制御する。　PPAR：RXRヘテロダイマーが結合

する標的遺伝子のPPREは、　direct　receptor（DR）と呼ばれる5’一AGGTCA－3’の配列が1塩基を

挟んで（多くはA）同方向に並んだ5’一AGGTCA－n－AGGTCA－3’のダイレクトリピート構造を

とる。代表的なPPAR標的遺伝子は、脂質代謝関連では：LPL、　CD36、　acyl－CoA合成酵素など、

脂肪細胞分化関連では、aP2、アディポネクチンなど、その他LXRα、　uncoupling　proteins　l

（UCP－1）などがあげられる。これらの直接的な標的遺伝子以外に、間接的発現制御を受

ける遺伝子群も多数報告されている。その分子制御機構として、PPARがある転写因子の発

現を直接制御し、その転写因子の標的遺伝子が発現する場合と、PPARと他の転写因子が直

接結合し、その転写因子の転写活性化能を制御する場合が考えられる。前者の例としては

PPARαやPPARγによって誘導される同じ核内レセプター型転写因子LXRαの作用による、コ

レステロール逆転送系の促進や脂肪酸代謝を担う一連の遺伝子群（ATP－binding　cassette

transporter　A1　（ABCA1）、　SREBPなど）があり（Chawla　et　al．2001）、後者ではマクロファ

ージ炎症時にPPARが転写因子AP　Iと結合することで抑制される、AP　I標的遺伝子群（IL－1、

IL－6）がある（Delerive　et　al．1999）。

5一（4）PPARαと動脈硬化症

　PPARαの活性化剤としてはフィブラート系の薬剤がすでに世界中で広く使用されており、

そのトリグリセリド血症の治療効果から抗動脈硬化作用を持ちうることが古くから考えら

れていた。しかし、このフィブラート系薬剤を用いた数多くの臨床試験の結果では、逆に

高トリグリセリド血症単独では心血四病の弱いリスクにしかならないということが明らか

にされている。一方、低high－density　lipoprotein（HDL）血症、糖尿病、高血圧などの他の

リスクを合併している高triglyceride（TG）血症患者を対象としたVA－HIT試験では、フィブ

ラート系薬剤（ゲムフィプロジル）は選択的に心血管イベントの発症を減少させている。

　　　　　　　16

また、2型糖尿病患者9795人を対象にした無作為前向き試験（FIE：LD　Study）の結果から、

フィブラート系薬剤（フェノフィブラート）が非致死性心筋梗塞や冠血行再建術が有意に

抑制し、さらに全心血管疾患イベントを有意に抑制することが報告されている。このよう

なフィブラート系薬剤を用いた臨床試験の結果から、PPARαの活性化がトリグリセリド低

下作用以外の何らかの抗動脈硬化作用を有している可能性が考えられる。実際、PPARCtに

は、脂質代謝の調節だけではなく、血管壁の炎症反応を抑制する作用を持つことを示す多

くの実験的あるいは臨床的報告がある。特に動脈硬化構成細胞に対する直接的な効果とし

て、血管内皮細胞ではNF－KBの活性抑制を介したICAM－1、　VCAM－1などの接着分子及び

MCP－1などの産生抑制効果など、マクロファージでは、やはりNF－iC13の活性抑制を介した

tumor　necro　sis　factor　ct（TNF一α）、誘導型NO合成酵素（inducible　nitric　oxide　synthase：iNO　S）、

などの炎症惹起因子の産生抑制効果、また脱泡開化分子であるABCAIの発現誘導効果など、

また血管平滑筋細胞では増殖抑制効果などが報告されている（図3）。

図3＝PPARα、　PPARγによる血管構成細胞に対する抗動脈硬化作用

NF－ld3：　nuclear　factor－kB，　iNOS：　inducible　NO　synthase，　ABCA　I：　ArlP－binding　cassette　activator－1，　IL－6： interleukin－6，　MCP－1：　monocyte　chemokine　protein－i，　VCAM－1：　vascular　chemoattractant　molecule－1，

　　　　　　　17

5一（5）PPARγと動脈硬化症

　これまでにPPARγアゴニストであるチアゾリジン誘導体は、　LDL受容体欠損マウスや

ApoEノックアウトマウスなどの動脈硬化モデル動物において動脈硬化抑制効果を有して

いると報告されている（Li　et　al，2000，　Chen　et　al．2001）。PPARγは血管やマクロファージに

も発現しており、PPARγアゴニストが代謝改善作用に加え、そのレセプターを介する直接

作用によっても抗動脈硬化作用を発揮していると思われる。

　近年、PPARγにより単球のマクロファージへの分化が誘導されることが示唆されており、

PPARγが粥状硬化の初期段階である泡沫細胞の形成に関わっているのではないかと考えら

れている。PPARγの単球／マクロファージにおける発現は、これまでにヒト末梢血由来の単

球、マウスリンパ節マクロファ・一・一・一ジ、マウス腹腔マクロファージにおいて確認されている

が、粥状硬化病変部の泡沫細胞にも発現していることが報告されている（Tontonoz　et　al。

1998）。元来、単球におけるPPARγの発現量は低いが、　GM－CSF、　M－CSF、活性型ビタミン

Dやボルボールエステルなどでマクロファージへの分化を誘導すると増加する。ヒトの単

球に酸化LD：Lを添加するとPPA：Rγの発現が誘導されることや、マクロファージによる酸

化LDLの取り込みのメカニズムにおいてもPPA：Rγが関与していることが報告されている

（Tontonoz　et　al．1998）。さらに、活性型マクロファージにおいてPPARγの発現が認められ

ること、更にPPARγのリガンドであるチアゾリジン系誘導体（thiazolidinediones：TZDs）

や15－deoxy一△12’14－prostaglandin　J2（15d－PGJ2）、高濃度の非ステロイド性抗炎症薬がスカベ

ンジャーレセプターAI（SR－AI）、　iNOS、　TNF一α、　interleukin－1β（IL－1β）、　IL－6などの発現

を抑制することが報告され（Ricote　et　al．1998）、抗炎症作用と同時に抗動脈硬化作用とし

てマクロファージ機能制御にPPARγが深く関与していることが示唆された。しかし現在で

は、PPARγの活1生化はコレステロール引き抜きに関与するABCA1の発現を誘導し、脱泡

　　　　　　　18

沫化の誘導を促進することが考えられている。（Chinetti　et　al．2001）。以上のことより、PPARγ

はマクロファージ由来泡沫細胞の関与する動脈硬化初期病変の発症・進展に、何らかの形

で関与している可能性が考えられる。

5一（6）酸化LDLによるPPARα、　PPARγ活性化作用

　近年、動脈硬化惹起因子である酸化LDLが、血管内皮細胞においてPPARαの活性を誘導

すること（Lee　et　al．2000，　Delerivea　et　al．2000）、またサル腎臓由来線維芽細胞であるCV－1

細胞においてPPARγの活性化を誘導すること（Nagy　et　al．1998．）が報告された。その活性

化の機序としては、酸化LDL中に存在する酸化リン脂質や9－hydroxyoctadecadienoic　acid

（9－HODE）、13－hydroxyoctadecadienoic　acid（13－HODE）などがそれ単独でPPARα、　PPARγ

の活1生化を誘導することから、これら酸化脂質による作用であると考えられているが、詳

細は不明である。一方、酸化LDLによるこれらPPARの活1生化は、スカベンジャーレセプタ

ーの一つであるCD36の産生を誘導し、酸化：LDLの取り込みを増加させることが報告され、

マクロファージの泡沫化にも関与する可能性が考えられた（Nagy　et　al．1998）。しかしなが

らチアゾリジン系薬剤を用いた検討で、PPARγの活性化した状態では、　CD36産生増加を起

因とした変性LDLの取り込み増加率は非常にわずかで、逆にABCA1の産生からコレステロ

ールの引き出し効果が強く現れることが知られている（Chinetti　et　al．2001）。また、　PPARα

及びPPARγの活性化は明らかな抗炎症作用を引き起こすが、同様に酸化L，DしもまたしP　Sなど

の炎症性応答によるサイトカイン産生を抑制する効果を持つことが、一部のグループより

報告されており（Hamilton　et　al．1995）、この応答は酸化：LDLの持つPPARα、　PPARγの活性

化を介して引き起こされている可能性が考えられる。

5一（7）本研究の目的

19

　前述のように、酸化LDLは動脈硬化症の発症・進展において重要な役割を担っているこ

とが報告されている。その一方で、酸化LDLは抗動脈硬化作用を持つPPARα、　PPARγの活

性化能をも持ちうるが、その活性化機序の詳細や、臨床的意義に関しては、全く知られて

いない。そこで本研究では、酸化LDLによるPPARα、　PPARy活性化の詳細なメカニズムを

解明するとともに、酸化LDLによるPPAR活1生化を介した動脈硬化惹起因子への影響を検討

することで、酸化：LDLのPPAR活性化の臨床的意義を解明し、さらにはその機序を応用した

動脈硬化新規治療法の確立を目的とした。

20

6．材料と実験方法

6一（1）リポタンパクの精製

　LDL（d＝LO19～1．0639／ml）は、本研究に対し同意を得た正脂血症健常人より、空腹時に

採血し得られた血漿から超遠心法を用いて調整した（H：akamata　et　a1。1994）。LDLはl　mM

EDTA生理食塩水で透析し、4℃で保存した。　LDLはアガロースゲル電気泳動及び

SDS－PAGEを用いて電気泳動度及びアポ蛋白組成を確認した。

6一（2）酸化LDL　（Ox－LDL）の調整

　LD：LをPB　Sで1　mg／mlに希釈し、最終濃度5μMの硫酸銅を加えた。37℃で20時間放置し

た後、最終濃度1mMのEDTAを添加し、氷中で冷却した。濃縮の後、　l　mM　EDTA生理食塩

水で透析し、4℃で保存した。またmildly　oxidized　LDL　（m－Ox－LDL）はLDLをPBSで0．1

mg／mlに希釈し、最終濃度5μMの硫酸銅を加え、37℃で5時間放置した後、最終濃度1　mM

のEDTAを添加し、氷中で冷却した。マウス腹腔常在マクロファージを使った本実験系に

おいて、エンドトキシンはlng／ml未満の濃度では細胞毒性はなく、増殖にも影響がないこ

とを確認しており、本実験で使用した酸化LDL中のエンドトキシン濃度はlpg／mg　protein未

満であった。マクロファージによるLDLの酸化は、100μgのLDLと100nMの硫酸銅を添加し

た、細胞培養液（6一（3）細胞参照）でマウスの腹腔マクロファージを20時間培養したもの

をmacrophage　mediated　oXidized　LDL（Mm－Ox－LDL）として用いた（Lindstedt　et　al。1993）。

脂質の酸化は、Naganoらに従い、チオバルビツール酸反応陽性物質（thiobarbituric

acid－reactive　substabces：TBARS）　を測定し確認した（Nagano　et　al．1991）。

21

6一　（3）　糸田月包

　雄性DDYマウス（6～8週齢）をジエチルエーテル麻酔し頚動脈及び鎖骨下動脈を切断、

流水下に失血死させた後、腹部を70％エタノールで消毒し表皮を切開した。氷冷したPBS

を10ml注射器で腹腔内へ注入し、腹腔洗浄により腹腔細胞を回収した。回収した細胞は

4℃で1000rpm、5分間遠心して上清を吸引破棄後RPM【1640－10％FCSに再懸濁し、血球

計算板を用いて細胞数を算定しプレートへ分配した。CO2培養器（37℃、5％CO2）内で

2時間艀置した後、浮遊細胞をPBSで洗浄除去し、プレートに付着した腹腔マクロファー

ジを実験に使用した。

　溶液の組成：RPMI　l　640－10％FCS

　　　RPMI　1640　（Gibco：BRL社）　10．4　g

　　　NaHCO3　1．2　g

　　　HEPES　2，38　g

　　　ペニシリン　　　　　　　100000U

　　　　　　　p

　　　ストレプトマイシン　　　100mg

　以上を蒸留水に溶解し、pH　72に滴定後、900　mlとし100・mlのウシ胎児血清（Fetal　Calf

Serum：FCS，　INTERGEN社）を加えフィルター滅菌し、細胞培養液として使用した。

　Mouse　macrophageのcell　llneであるRAW　264．7細胞は、同じRPMI　1640－10％FCSにて

培養し、2x105から2x106個／mlの濃度で実験に使用した。

　Human　monocyteのcell　lineであるTHP－1細胞は、同じRPMI　1640－10％FCSにて培養し、

200nMのphorbol　myristate　acetate（PMS）で8時間刺激し、　macrophageへ分化誘導した。

浮遊細胞をPB　S（phosphate－buffered　saline）で2度、洗浄除去し、再び実験で使用するまで

　　　　　　　22

RPMI　l640－10％FCSにて培養した。

6一（4）実験動物

　動物実験は熊本大学動物実験指針及び動物実験資源局（lnstitute　of　Laboratory　Animal

Resources：ILAR）ガイドラインに準じて行った。熊本大学生命資源研究・支援センターに

てspecific　pathogen－free（SPF）の環境下で、人工照明を12時間の明暗周期で管理し、飼料

及び水は不断給与できる環境とした。動物実験には24週齢の雄のApoEノックアウトマウ

スと、コントn一一ルとして背景を揃えた24週齢の雄のC57BL／6マウスを用いた（wild　type：

WT）。飼料はSPFグレードのマウス通常食CLEA　Rodent　Diet　CE－7（CLEA社）にて飼育し

た。

6一（5）組織免疫染色

　ApoEノックアウトマウスとwild　type（WT）マウスより大動脈洞を採取し、　oil　red　Oで染

色した（Fujiwara　et　al．2007）。免疫染色には3μmの厚さのパラフィン固定切片を作成した。

酸化LDLの免疫染色は一次抗体にビオチン化したFOH：1・a／DLH3を用い、マクロファージの

CD　l　l　bにはanti－integrinαM　（goat）（Santa　Cruz　Biotechnology社）を用いた。二次抗体に

は、酸化LDLに対してはperoxidase－conjugated　atreptavidin　（Nichirei社）、CD　l　l　bに対しては、

Hitofine　Simple　Stain　Mouse　MAX－PO（goat）　（Nichirei社）を用いた。最後に、

3，3－diaminobenzidineで発色させた後、核をヘマトキシリンで染色した。コントロールは、

一次抗体を省いた同様の手技で行った。

6一（6）PPARct、　PPARγ活性（fU11－length　PPAR　assay）の検討

　　　　　　　23

　PPARの活性化は、PPARα，、　PPARγ発現ベクター、及びPPAR結合領域（PPR：E）のsequence

（UAS）が3コピー存在するluciferase　reporter　plasmid（（AOX）3－1uc）を用い測定した。

（血ll－length　PPAR．　assay）。　PPARα発現ベクター（pCMV－hPPARα）はMiyamoto、　Kakizawaら

に、PPARγ発現ベクター（pCMX－PP　ARy2）はBrownleeらに供与を受け実験に使用した。

　PPA：Rα活性を測定するため、1穴あたり2xlO6個のRAW264．7細胞を付着させた6穴プ

レート（直径34mm）に対し、　l　wellあたり1μgのpCMV－hPPARα、（AOX）3－lucを、1well

あたり5μ1のLIPOFECTAMI：NE　2000（lnvitrogen社）を用いて導入した。また、　PPARγ活

性を測定するため、1穴あたり2xlO6個のRAW264．7細胞を付着させた6穴プレート（直

径34mm）に対し、1wellあたり1μgのpCMV－hPPARγ、（AOX）3－lucを、1wellあたり5

μ1のLIPOFECTAMINE　2000（lnvitrogen社）を用いて導入した。5時間培養後、種々の刺

激を添加したのちにさらに24時間培養し、細胞溶解液を用いて細胞を溶解した後、溶解液

をサンプルとし、Dual－Luciferase　Reporter　Gene　Assay　system（Promega社）を用いてルシフ

ェラーゼ活1生を測定した。得られた結果は、同時に導入したSV40をそのプロモーター部

位に持つintemal　control　plasmid（renilla　luciferase　plasmid；Promega社）によるIuciferase活

性の値を用いてトランスフェクション効率の補正を行った。

6一（7）PPARα、　PPARyリガンド結合活性（PPAR　ligand－binding　assay）の検討

　PPARαのリガンド結合活1生は、哺乳類には存在しないGAL4のDNA結合領域とPPARα

のリガンド結合領域の血sion蛋白を発現させるplasmid（pM－PPA：Rα）と、　GAL4のDNA

結合領域のsequence（UAS）が4コピー存在するluciferase　reporter　plasmid（p4xUASg－tk－1uc）

を用い測定した（PPARct　ligand－binding　assay）。同様にPPARγのリガンド結合活性は、　GAL4

のDNA結合領域とPPARγのリガンド結合領域の血sion蛋白を発現させるplasmid

　　　　　　　24

（pM－PPARγ）と、　GA：L4のDNA結合領域のsequence（UAS）が4コピー存在するluciferase

reporter　plasmid　（p4xUASg－tk－1uc）を用い測定した（PPARγligand－binding　assay）。

　PPARαリガンド結合活性を測定するため、1穴あたり2x106個のRAW264．7細胞を付着

させた6穴プレート（直径34mm）に対し、1wellあたり1　ptgのpM－PPARα、p4xUASg－tk－luc

を、Iwe11あたり5μ1のUPOFECTAMI：NE　2000（lnvitrogen社）を用いて導入した。同様

に、PPARγリガンド結合活性を測定するため、1穴あたり2xIO6個のRAW264．7細胞を付

着させた6穴プレート（直径34mm）に対し、1wellあたり1　pgのpM－PPARα、

p4xUASg－tk－lucを、1we11あたり5μ1のLIPOFECTAM【NE　2000（lnvitrogen社）を用いて

導入した。5時間培養後、各種刺激を添加したのちにさらに24時間培養し、細胞溶解液を

用いて細胞を溶解した後、溶解液をサンプルとし、Dual－Luciferase　Reporter　Gene　Assay

system（Promega社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。得られた結果は、同時に

導入したSV40をそのプロモーター部位に持つintemal　control　plasmid（renilla　luciferase

plasmid；Promega社）によるluciferase活性の値を用いてトランスフェクション効率の補正

を行った。

6一（8）Enzyme－linked　immunosorbent　assay（ELISA）　によるPPARs転写活性測定

　普通食で飼育した24週齢の雄のApoEノックアウトマウスと、24週齢の雄のC57BL，／6

マウスより大動脈洞を採取し、PPARα、　PPARγの転写活性測定をPPARα、　PPARδ、　PPARγ

Comp豆ete　Transcription　Factor　Assayキット（Cayman　Chemical社）を用いて行った。

6一（9）NF－KB活性測定

NF－icBの活性を測定するため、1穴あたり2x106個のRAW264．7細胞、マウス腹腔マク

　　　　　　25

ロファージ、THP－1細胞を、それぞれ付着させた6穴プレート（直径34　mm）に対し、1well

あたり1pgのNF一田のluciferase　reporter　plasmid（p］N［F・・i（B－Luc）を1wellあたり5μ1の

LIPOFECTAMINE　2000（Invitrogen社）を用いて導入した。5時間培養後、各種薬剤を添加

したのちにさらに24時間培養し、細胞溶解液を用いて細胞を溶解した後、溶解液をサンプ

ルとし、Dual－Luciferase　Reporter　Gene　Assay　system（Promega）を用いてルシフェラーゼ活

性を測定した。得られた結果は、同時に導入したSV40をそのプロモL・一一一ター部位に持つ

internal　control　plasmid（renilla　luciferase　plasmid；Promega社）によるluciferase活性の値を

用いてトランスフェクション効率の補正を行った。

6一（10）short　interfering　RNA（siRNA）の導入

　1穴あたり2x106個のRAW264．7細胞、マウス腹腔マクロファージをそれぞれ付着させ

た6穴プレート（直径34mm）に対し、1wellあたり1μgのCOX－2、　PPARα、　PPARγ、

controlのsiRNA（Santa　Cruz　Biotechnology社）を、1wellあたり5叫のLIPOFECTAI）vllNE　2000

（Invitrogen社）を用いて導入した。4時間培養後、メディウムをRPMI　1640－10％FCSに

交換し、各種刺激を添加したのちにさらに24時間培養し、mRNA、ウェスタンプロットの

サンプルとした。

6一（11）RT－PCR法によるCOX－2、　ABCA1、　MCP－1　mRNA発現の検討

（A）RNAの抽出

　1穴あたり2×106個の細胞を付着させた6穴プレート（直径34mm）に各種薬剤を添

加し、2mlの培養液で培養した。40Cに冷やしたPB　Sで洗浄した後、1　mlのTRIzol試薬

（Invitrogen社）を加え、細胞をスクレイパーにてプレートより剥離し、1．5　mlチューブに

　　　　　　26

移した。室温にて5分間静置後、クロロホルムを200μ1加え、30秒間よく撹拝し、さらに

2分間室温に静置。次に、15，000回転、4℃で15分間遠心し、上清400μ1を新しい15ml

チューブに移した。400　plのイソプロパノールを加え、室温にて10分間静置後、15，000回

転、4℃で10分間遠心した。上清を取り除き、lmlの75％エタノールを加え、軽く撹搾

した後、15，000回転、4℃で5分間遠心した。上清を取り除き、ペレットを軽く空乾した

後、RNA分解酵素を含まない水に溶解し、分光測光法で濃度を測定した。1μgのtotal　RNA

からReverTraAce－alpha（TOYOB　O社）を用いてfirst　strand　cDNAを合成した。

（B）rea1－time　RT－PCR法によるCOX－2、　ABCAI、　MCP－1　mRNA発現量の定量

　以下に示すプライマー及び条件で、Light　CyclerシステムSYBER・Green　1（Roche　Molecular

Biochemicals社）を使用し、それぞれmR：NAの発現量を定量した（Bendriss－Vermare　et　al．

2001）　．

　　　PCRプライマー：

　　　COX－2：

　　　　forward　primer：　5’一CCAGAGCAGAGAGATGAAA－3’

　　　　reverse　primer：　5’一GGTACAGTTCCATGACATC－3’

P－actin：

forward　primer：　5’一GTGGGCCGCTCTA（］K3CAC　CAA－3’

reverse　primer：　5’一CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC－3’

ABCAI：

forward　primer：　5’一ATTGCCAGACooAGCCG－3’

reverse　primer：　5’一TGCCAAAGGGTGGCACA－3’

　　　　　　　27

MCP－1：

fbrward　primer二5’一GGTCCCTGTCATGCTTCT－3’

reverse　primer：　5’一CATCTTGCTGGTGAATGAGT－3’

　　　条件：

　　　Annealing　55　OC．　denature　95　OC．　enlongation　72　OC　40　cycles

　内部コントロールとしてβ一アクチンを同様の方法で定量し、mRNA発現量を補正した。

Light　Cycllerソフトウエアによって得られたデータを解析し、それぞれのmRNA濃度を定

量した。最後の増幅サイクルの後、PCR産物の特異性を評価するためにMelting　curve分析

を実行した。さらにPCR産物は2％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色

した後、紫外線イメージングにより可視化し、単一のバンドであることを確認した。

6一（12）ウェスタンプロット法による蛋白質リン酸化及び蛋白質発現の検討

　（A）蛋白精製

　1穴あたり2×106個の細胞を付着させた6穴プレート（直径34mm）に各種薬剤を添

加し2mlの培養液で培養した。4℃に冷やしたPBSで洗浄した後、300μ1の蛋白抽出用

溶液を加え、細胞をスクレイパーにてプレートより剥離し、1．5mlチューブに移した。4℃、

20，000×g、10分間の遠心分離を施行し、上清を試料として使用した。また、動物より採取

した組織に対しては、1．5mlチューブに移し、500　Pt1の蛋白抽出用溶液を加え、ホモジナ

イズ後、4℃、20，000×g、10分間の遠心分離を施行し、上清を試料として使用した。蛋白

抽出液はCoomasie　brilliant　blue（CBB）G250を用いたBradfbrd色素結合法（Bio一一Rad社）

　　　　　　　28

にて、吸光度計で蛋白濃度を測定した。蛋白抽出用溶液の組成を下記に示す。

蛋白抽出用溶液

　30　mmol／l　Tris　（pH　7．4）

　150　mmol／l　NaCl

　10　mmol／l　EDTA

　1　mmol／l　Na3VO4

　20　mmol／l　Na4P202

　50　mmol／l　NaF

　1　O／，　NP－40

　1mmol／l　phenylmethylsulfonyl　fluoride　（PMSF）

　10　pg／ml　aprotinin 　1　pmol／l　leupeptin

　（B）　ウェスタンプロット法

　精製した各蛋白を50μgずつ分注し、試料溶解用溶液を加え95℃5分間煮沸しsodium

dodecyl　sulfate－polyacrylamide　gel　electrophoresis（SD　S－PAGE）を行った。　SDS－PAGE終了後、

セミドライ転写器を用いてニトロセルロース膜（Schleicher＆Schuell社）に電気的に転写し

た。目的とする蛋白の検出方法はChemiluminescence　Western　Blottingキット（BOE㎜GER

MANNHEIM社）に付属の使用法に従い行った。まず、ブロッキング液中で膜をブロッキン

グ。次に一次抗体反応（室温2時間）、二次抗体反応（ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG

抗体、室温30分）を行ったあと、発光基質を加え、発光をX線フィルムに感光した。定量

はフィルムをスキャナ・・一一で画像として取り込みN田Image　analyserにて解析を行った。蛋白

のリン酸化の強度は、非リン酸化抗体で検出した蛋白発現量で補正した後、4回の実験を平

　　　　　　　29

均化した。また非刺激対照群のリン酸化強度を100とした時の％±標準偏差で表した。以下

に一次抗体反応で用いた抗体を示す。

抗COX－2抗体（Cayman　Chemical社）

抗ERK　1／2抗体（Santa　Cruz　Biotechnology社）

抗phospho－ERKI／2抗体（Cell　Signaling社）

抗p38MAPK抗体（Santa　Cruz　Bioteclmology社）

抗phospho－p38MAPK抗体（Santa　Cruz　Biotechnology社）

抗PPARα抗体（Santa　Cruz　Biotechnology社）

抗PPARγ抗体（Santa　Cruz　B　iotechnology社）

6一（13）アデノウイルスベクターを用いた優性ネガティブ変異体の強制発現

　dominant　negative　ERK　（DN－ERK）、　dominant　negative　p38MAPK　（DN－p38　MAPK）そ

れぞれの遺伝子を有する複製能の欠失したアデノウイルスを、感染多重度（multiplicity　of

infection；MOI）を約50に調整し、細胞に感染させた。3時間の感染操作後、細胞培養液を

交換し、48時間培養後、細胞を実験に用いた。

6一（14）Enzyme　Immunoassay（EIA）による15d－PGJ2、　PGE2、　PGD2測定

　　1穴あたり2x106個のRAW264．7細胞をそれぞれ付着させた6穴プレート（直径34

mm）に対し、各種刺激を添加した後に、さらに40μg／mlの酸化LDLまたは、　LDLを添加

し、24時間培養後、浮遊細胞をPB　Sで洗浄除去し、15d－PGJ2、　PGE2、　PGD2の測定をEIA

キット（Cayman　Chemical社）に付属の使用法に従い行った。

　　　　　　　30

6一（15）ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸組成の検討

　　1穴あたり2x106個のRAW264．7細胞をそれぞれ付着させた6穴プレート（直径34

mm）に対し、各種刺激を添加した後、24時間培養し、　Beckman　Coulter　Counter　Z2を用いて、

各サンプルの細胞数を2xlO4個に揃えた。　Folchらの方法にてサンプルより、総脂質の抽

出を行った（Folch　et　al．1957）。KOHで脱水し、脂肪酸をBF3でメチルエステル化後、ガス

クロマトグラフィー（GC－17A島津製作所）により、アラキドン酸、オレイン酸、リノレ

イン酸、ドコサヘキサエン酸を測定した。

6一（16）統計学的解析

　数値は平均値±標準偏差（SEM）で表記した。数群間の有意差は，　ANOVAにて検定し

た。また2群問の検定に関してはstudent’st－testにて有意差を検定した。いずれもp＜0．05の際

に、統計学的に有意と判断した。

31

7．実験結果

7一（1）マクロファージにおける酸化LDLによるPPARα、　PPA：Rγ活性化の検討

まず、酸化LDLによるマクロファージにおけるPPARα、　PPARγ活性化を検討した。5μM

の硫酸銅で20時間処理した酸化LD：しの添加により、PPARα、　PPARγ活1生（図4－1A）、PPARα、

PPARγリガンド結合活性（図4－1B）は、共に酸化LDLの濃度依存性に上昇した。しかし、

：LDLの添加では上昇しなかった。

87654321

　　　自邸ω煽Ω℃一〇一隔⊃」匡∪ 　〉呂〉場O“明く」」‘脚O＝①＝繭コ」

0

A

Ox－LDL　（pglml）

　LDL　（pglml）

％　Full－length　PPARoc 團F。ll－1。ngth、PPARγ

D）

一■

〔〔

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50

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（100｝　（一） （一）　（100）

B

き旧〉旧りO邸O⊆旧℃＝旧ρ一恩＝60昌】匡イ〜n哺n廟 　　　　（一三ω邸Ω眉廓O一…⊃1一匡》 　の　　　　　 _{9■　　0　　8　　轟0　　4　　つ■　　0}

va　Ga14－PPARor

N　Gat4－PPARy

　　Ox－LDL　（pglm　1）　（一｝　（1）　（1　0）　（20｝　（50）

　　　　LDL　（pglml）　（一｝　（一｝　（一）　（一）　｛一）

図4－1：酸化LDLによるPPARα、　PPARγ活性化の検討

RAW264．7　cellに示した濃度の酸化L肌、　LDLを添加し24時間培養した。

たようにPPAR活性（A）、

平均値±標準偏差を表した。ft，　p〈O．Ol，対対象の細胞群

　　　　　　32

（100）　（一） ｛一）　（100）

　　　　　　“材料と実験方法”に示し

PPAR．リガンド結合活性（B）を測定した。結果は4回の実験を平均化し、