OC．　denature　95　OC．　enlongation　72　OC　40　cycles

MCP－1：

Annealing　55　 OC．　denature　95　OC．　enlongation　72　OC　40　cycles

　内部コントロールとしてβ一アクチンを同様の方法で定量し、mRNA発現量を補正した。

Light　Cycllerソフトウエアによって得られたデータを解析し、それぞれのmRNA濃度を定

量した。最後の増幅サイクルの後、PCR産物の特異性を評価するためにMelting　curve分析

を実行した。さらにPCR産物は2％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色

した後、紫外線イメージングにより可視化し、単一のバンドであることを確認した。

6一（12）ウェスタンプロット法による蛋白質リン酸化及び蛋白質発現の検討

　（A）蛋白精製

　1穴あたり2×106個の細胞を付着させた6穴プレート（直径34mm）に各種薬剤を添加し2mlの培養液で培養した。4℃に冷やしたPBSで洗浄した後、300μ1の蛋白抽出用溶液を加え、細胞をスクレイパーにてプレートより剥離し、1．5mlチューブに移した。4℃、

20，000×g、10分間の遠心分離を施行し、上清を試料として使用した。また、動物より採取した組織に対しては、1．5mlチューブに移し、500　Pt1の蛋白抽出用溶液を加え、ホモジナイズ後、4℃、20，000×g、10分間の遠心分離を施行し、上清を試料として使用した。蛋白抽出液はCoomasie　brilliant　blue（CBB）G250を用いたBradfbrd色素結合法（Bio一一Rad社）

にて、吸光度計で蛋白濃度を測定した。蛋白抽出用溶液の組成を下記に示す。

蛋白抽出用溶液

　30　mmol／l　Tris　（pH　7．4）

　150　mmol／l　NaCl

　10　mmol／l　EDTA

　1　mmol／l　Na3VO4

　20　mmol／l　Na4P202

　50　mmol／l　NaF

　1　O／，　NP－40

　1mmol／l　phenylmethylsulfonyl　fluoride　（PMSF）

　10　pg／ml　aprotinin

　1　pmol／l　leupeptin

　（B）　ウェスタンプロット法

　精製した各蛋白を50μgずつ分注し、試料溶解用溶液を加え95℃5分間煮沸しsodium

dodecyl　sulfate－polyacrylamide　gel　electrophoresis（SD　S－PAGE）を行った。　SDS－PAGE終了後、

セミドライ転写器を用いてニトロセルロース膜（Schleicher＆Schuell社）に電気的に転写した。目的とする蛋白の検出方法はChemiluminescence　Western　Blottingキット（BOE㎜GER

MANNHEIM社）に付属の使用法に従い行った。まず、ブロッキング液中で膜をブロッキン

グ。次に一次抗体反応（室温2時間）、二次抗体反応（ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG 抗体、室温30分）を行ったあと、発光基質を加え、発光をX線フィルムに感光した。定量

はフィルムをスキャナ・・一一で画像として取り込みN田Image　analyserにて解析を行った。蛋白

のリン酸化の強度は、非リン酸化抗体で検出した蛋白発現量で補正した後、4回の実験を平

均化した。また非刺激対照群のリン酸化強度を100とした時の％±標準偏差で表した。以下に一次抗体反応で用いた抗体を示す。

抗COX－2抗体（Cayman　Chemical社）

抗ERK　1／2抗体（Santa　Cruz　Biotechnology社）

抗phospho－ERKI／2抗体（Cell　Signaling社）

抗p38MAPK抗体（Santa　Cruz　Bioteclmology社）

抗phospho－p38MAPK抗体（Santa　Cruz　Biotechnology社）

抗PPARα抗体（Santa　Cruz　Biotechnology社）

抗PPARγ抗体（Santa　Cruz　B　iotechnology社）

6一（13）アデノウイルスベクターを用いた優性ネガティブ変異体の強制発現

　dominant　negative　ERK　（DN－ERK）、　dominant　negative　p38MAPK　（DN－p38　MAPK）そ

れぞれの遺伝子を有する複製能の欠失したアデノウイルスを、感染多重度（multiplicity　of infection；MOI）を約50に調整し、細胞に感染させた。3時間の感染操作後、細胞培養液を交換し、48時間培養後、細胞を実験に用いた。

6一（14）Enzyme　Immunoassay（EIA）による15d－PGJ2、　PGE2、　PGD2測定

　　1穴あたり2x106個のRAW264．7細胞をそれぞれ付着させた6穴プレート（直径34

mm）に対し、各種刺激を添加した後に、さらに40μg／mlの酸化LDLまたは、　LDLを添加

し、24時間培養後、浮遊細胞をPB　Sで洗浄除去し、15d－PGJ2、　PGE2、　PGD2の測定をEIA キット（Cayman　Chemical社）に付属の使用法に従い行った。

6一（15）ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸組成の検討

　　1穴あたり2x106個のRAW264．7細胞をそれぞれ付着させた6穴プレート（直径34

mm）に対し、各種刺激を添加した後、24時間培養し、　Beckman　Coulter　Counter　Z2を用いて、

各サンプルの細胞数を2xlO4個に揃えた。　Folchらの方法にてサンプルより、総脂質の抽

出を行った（Folch　et　al．1957）。KOHで脱水し、脂肪酸をBF3でメチルエステル化後、ガス

クロマトグラフィー（GC－17A島津製作所）により、アラキドン酸、オレイン酸、リノレ

イン酸、ドコサヘキサエン酸を測定した。

6一（16）統計学的解析

　数値は平均値±標準偏差（SEM）で表記した。数群間の有意差は，　ANOVAにて検定し

た。また2群問の検定に関してはstudent’st－testにて有意差を検定した。いずれもp＜0．05の際に、統計学的に有意と判断した。

7．実験結果

7一（1）マクロファージにおける酸化LDLによるPPARα、　PPA：Rγ活性化の検討

まず、酸化LDLによるマクロファージにおけるPPARα、　PPARγ活性化を検討した。5μM

の硫酸銅で20時間処理した酸化LD：しの添加により、PPARα、　PPARγ活1生（図4－1A）、PPARα、

PPARγリガンド結合活性（図4－1B）は、共に酸化LDLの濃度依存性に上昇した。しかし、

：LDLの添加では上昇しなかった。

87654321

　　　自邸ω煽Ω℃一〇一隔⊃」匡∪

　〉呂〉場O“明く」」‘脚O＝①＝繭コ」

0 A

Ox－LDL　（pglml）

　LDL　（pglml）

％　Full－length　PPARoc 團F。ll－1。ngth、PPARγ

D）

一■

〔〔｝）－一（（）） 0葡－（

（

）⊃ 0一

ハ∠｛｛

）） ₅₀

ｩ

（

（100｝　（一）

（一）　（100）

B

き旧〉旧りO邸O⊆旧℃＝旧ρ一恩＝60昌】匡イ〜n哺n廟　　　　（一三ω邸Ω眉廓O一…⊃1一匡》　の　　　　　　9■　　0　　8　　轟0　　4　　つ■　　0

va　Ga14－PPARor N　Gat4－PPARy

　　Ox－LDL　（pglm　1）　（一｝　（1）　（1　0）　（20｝　（50）

　　　　LDL　（pglml）　（一｝　（一｝　（一）　（一）　｛一）

図4－1：酸化LDLによるPPARα、　PPARγ活性化の検討

RAW264．7　cellに示した濃度の酸化L肌、　LDLを添加し24時間培養した。

たようにPPAR活性（A）、

平均値±標準偏差を表した。ft，　p〈O．Ol，対対象の細胞群

　　　　　　32

（100）　（一）

｛一）　（100）

　　　　　　“材料と実験方法”に示し

PPAR．リガンド結合活性（B）を測定した。結果は4回の実験を平均化し、

マウスの腹腔マクロファージに50μg／mlの酸化LDLを添加し、同様の実験を行ったところ PPARα、　PPA：Rγのリガンド結合活性はそれぞれ、6．3倍、5．8倍に上昇した。また、　THP－1 細胞でもそれぞれ5．2倍、4．9倍に上昇が認められた。

次にmildly　oxidized　LD：L（m－Ox－LDL）でのPPARα、　PPARγ活性化を検討した。　m－Ox－LDL

は酸化LD：しに比べ表2に示すように酸化度の変化が軽度であったが、　m－Ox－LDLでもPPARα、

PPARγのリガンド結合活1生は上昇していた（図4－2）。

TBARS

Electrophoretic

@　mobili

Intact　apoB

LDL

nmol　MDA／mg　LDL

@　　　2．2土0．2

relative　to　LDL

@　　　l

％of　LDL

@　lOO m－Ox－LDL ^{8．3±0．5★} ^{1．5±0。1★} ^{67．5±2．2★}

Ox－LDL

^{22，8土1．2★} ^{2．8±0．2★} ^{43．5±1．8★}

表2：硫酸銅によるLDLの酸化反応の検討

LDLに5pMの硫酸銅を加え、37℃で20時間放置したOx－LDLと5時間放置したm－Ox－LDLを作製し、

その酸化LDLの酸化度の変化をTBARS、　Electrophoretic　mobility、　Intact　apoBの量で評価した。

“，p＜0．Ol，対しDL

5　　　4　　　3　　　2　　　1　　　0

　　　　自嘱ω邸Ω眉一〇↑…コ」匡》

蓄〉旧ぢ巴＝旧要旧Ω亡影O旧剛匡く」」

（“） Ox－LDL

（20　pglml）

m－Ox－LDL

｛20　pglml）

図4－2：m－Ox－LDLによるPPARα、　PPARγリガンド結合活性への影響

RAW　264．7cellに20μg！mlの酸化LDL、　m－Ox－LDLを添加し、24時間培養後、“材料と実験方法”に示したようにPPARα、　PPARγリガンド結合活性を測定した。結果は3回の実験を平均化し、平均値±標準

偏差を表した。’t，pく（）．Ol，対しDLの細胞群

　また、生体内では、LDLの酸化は血管内皮細胞やマクロファージにより受けると考えられている。そこで、より生体内に近い酸化LDLとしてマクロファージにて酸化させた酸化

LDL（Mm－Ox－LDL）を用い、　PPARα、　PPARγの活性化能を検討した。　Mm－Ox－LDLはTB　ARS が7．1±0．3　nmol　MDAImg　LD：しであったのに対し、マクロファージ非存在下で同様に培養し

たLDL　（c－LD：L）では、　TBARSが2．4±0．4　nmol　MDA／mg　LDLと、　nativeなLDLと同程度で

あった。さらにこの酸化LDLを用いてPPARα、　PPARγの活性化を検討したところ、

Mm－Ox－LDLではPPARα、　PPARγリガンド結合活性は上昇したが、　c－LDLでは活性の上昇は認められなかった（図4－3）。

　　　　　　　言

　　　　　　　葺　　4

ドキュメント内熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repositor Title マクロファージにおける酸化低比重リポ蛋白質による PPARα PPARγ 活性化機序およびその意義 Author(s) 竹田, 佳代 Citation Issue date Type (ページ 34-40)

OC． denature 95 OC． enlongation 72 OC 40 cycles

MCP－1：

Annealing 55 OC． denature 95 OC． enlongation 72 OC 40 cycles

量した。最後の増幅サイクルの後、PCR産物の特異性を評価するためにMelting curve分析

した後、紫外線イメージングにより可視化し、単一のバンドであることを確認した。

6一（12）ウェスタンプロット法による蛋白質リン酸化及び蛋白質発現の検討

にて、吸光度計で蛋白濃度を測定した。蛋白抽出用溶液の組成を下記に示す。

150 mmol／l NaCl

1 mmol／l Na3VO4

20 mmol／l Na4P202

50 mmol／l NaF

1mmol／l phenylmethylsulfonyl fluoride （PMSF）

（B） ウェスタンプロット法

dodecyl sulfate－polyacrylamide gel electrophoresis（SD S－PAGE）を行った。 SDS－PAGE終了後、

セミドライ転写器を用いてニトロセルロース膜（Schleicher＆Schuell社）に電気的に転写し た。目的とする蛋白の検出方法はChemiluminescence Western Blottingキット（BOE㎜GER

はフィルムをスキャナ・・一一で画像として取り込みN田Image analyserにて解析を行った。蛋白

のリン酸化の強度は、非リン酸化抗体で検出した蛋白発現量で補正した後、4回の実験を平

均化した。また非刺激対照群のリン酸化強度を100とした時の％±標準偏差で表した。以下 に一次抗体反応で用いた抗体を示す。

抗COX－2抗体（Cayman Chemical社）

抗p38MAPK抗体（Santa Cruz Bioteclmology社）

抗phospho－p38MAPK抗体（Santa Cruz Biotechnology社）

6一（13）アデノウイルスベクターを用いた優性ネガティブ変異体の強制発現

れぞれの遺伝子を有する複製能の欠失したアデノウイルスを、感染多重度（multiplicity of infection；MOI）を約50に調整し、細胞に感染させた。3時間の感染操作後、細胞培養液を 交換し、48時間培養後、細胞を実験に用いた。

6一（14）Enzyme Immunoassay（EIA）による15d－PGJ2、 PGE2、 PGD2測定

1穴あたり2x106個のRAW264．7細胞をそれぞれ付着させた6穴プレート（直径34

し、24時間培養後、浮遊細胞をPB Sで洗浄除去し、15d－PGJ2、 PGE2、 PGD2の測定をEIA キット（Cayman Chemical社）に付属の使用法に従い行った。

6一（15）ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸組成の検討

出を行った（Folch et al．1957）。KOHで脱水し、脂肪酸をBF3でメチルエステル化後、ガス

イン酸、ドコサヘキサエン酸を測定した。

6一（16）統計学的解析

た。また2群問の検定に関してはstudent’st－testにて有意差を検定した。いずれもp＜0．05の際 に、統計学的に有意と判断した。

7一（1）マクロファージにおける酸化LDLによるPPARα、 PPA：Rγ活性化の検討

まず、酸化LDLによるマクロファージにおけるPPARα、 PPARγ活性化を検討した。5μM

PPARγリガンド結合活性（図4－1B）は、共に酸化LDLの濃度依存性に上昇した。しかし、

：LDLの添加では上昇しなかった。

87654321

0

A

LDL （pglml）

D）

〔〔 ｝） －一 （（ ）） 0葡 －（

）⊃ 0一

）） 50

ｩ

B

va Ga14－PPARor N Gat4－PPARy

Ox－LDL （pglm 1） （一｝ （1） （1 0） （20｝ （50）

図4－1：酸化LDLによるPPARα、 PPARγ活性化の検討

RAW264．7 cellに示した濃度の酸化L肌、 LDLを添加し24時間培養した。

32

PPAR．リガンド結合活性（B）を測定した。結果は4回の実験を平均化し、

は酸化LD：しに比べ表2に示すように酸化度の変化が軽度であったが、 m－Ox－LDLでもPPARα、

PPARγのリガンド結合活1生は上昇していた（図4－2）。

TBARS

@ mobili

LDL

％of LDL

Ox－LDL

m－Ox－LDL

図4－2：m－Ox－LDLによるPPARα、 PPARγリガンド結合活性への影響

RAW 264．7cellに20μg！mlの酸化LDL、 m－Ox－LDLを添加し、24時間培養後、“材料と実験方法”に示 したようにPPARα、 PPARγリガンド結合活性を測定した。結果は3回の実験を平均化し、平均値±標準

LDL（Mm－Ox－LDL）を用い、 PPARα、 PPARγの活性化能を検討した。 Mm－Ox－LDLはTB ARS が7．1±0．3 nmol MDAImg LD：しであったのに対し、マクロファージ非存在下で同様に培養し

あった。さらにこの酸化LDLを用いてPPARα、 PPARγの活性化を検討したところ、

Mm－Ox－LDLではPPARα、 PPARγリガンド結合活性は上昇したが、 c－LDLでは活性の上昇は 認められなかった（図4－3）。

言

葺 4

OC．　denature　95　OC．　enlongation　72　OC　40　cycles

Annealing　55　 OC．　denature　95　OC．　enlongation　72　OC　40　cycles

量した。最後の増幅サイクルの後、PCR産物の特異性を評価するためにMelting　curve分析

　150　mmol／l　NaCl

　1　mmol／l　Na3VO4

　20　mmol／l　Na4P202

　50　mmol／l　NaF

　1mmol／l　phenylmethylsulfonyl　fluoride　（PMSF）

　（B）　ウェスタンプロット法

dodecyl　sulfate－polyacrylamide　gel　electrophoresis（SD　S－PAGE）を行った。　SDS－PAGE終了後、

セミドライ転写器を用いてニトロセルロース膜（Schleicher＆Schuell社）に電気的に転写した。目的とする蛋白の検出方法はChemiluminescence　Western　Blottingキット（BOE㎜GER

はフィルムをスキャナ・・一一で画像として取り込みN田Image　analyserにて解析を行った。蛋白

均化した。また非刺激対照群のリン酸化強度を100とした時の％±標準偏差で表した。以下に一次抗体反応で用いた抗体を示す。

抗COX－2抗体（Cayman　Chemical社）

抗p38MAPK抗体（Santa　Cruz　Bioteclmology社）

抗phospho－p38MAPK抗体（Santa　Cruz　Biotechnology社）

れぞれの遺伝子を有する複製能の欠失したアデノウイルスを、感染多重度（multiplicity　of infection；MOI）を約50に調整し、細胞に感染させた。3時間の感染操作後、細胞培養液を交換し、48時間培養後、細胞を実験に用いた。

6一（14）Enzyme　Immunoassay（EIA）による15d－PGJ2、　PGE2、　PGD2測定

　　1穴あたり2x106個のRAW264．7細胞をそれぞれ付着させた6穴プレート（直径34

し、24時間培養後、浮遊細胞をPB　Sで洗浄除去し、15d－PGJ2、　PGE2、　PGD2の測定をEIA キット（Cayman　Chemical社）に付属の使用法に従い行った。

出を行った（Folch　et　al．1957）。KOHで脱水し、脂肪酸をBF3でメチルエステル化後、ガス

た。また2群問の検定に関してはstudent’st－testにて有意差を検定した。いずれもp＜0．05の際に、統計学的に有意と判断した。

7一（1）マクロファージにおける酸化LDLによるPPARα、　PPA：Rγ活性化の検討

まず、酸化LDLによるマクロファージにおけるPPARα、　PPARγ活性化を検討した。5μM

　LDL　（pglml）

〔〔｝）－一（（）） 0葡－（

）） ₅₀

va　Ga14－PPARor N　Gat4－PPARy

　　Ox－LDL　（pglm　1）　（一｝　（1）　（1　0）　（20｝　（50）

図4－1：酸化LDLによるPPARα、　PPARγ活性化の検討

RAW264．7　cellに示した濃度の酸化L肌、　LDLを添加し24時間培養した。

　　　　　　32

は酸化LD：しに比べ表2に示すように酸化度の変化が軽度であったが、　m－Ox－LDLでもPPARα、

@　mobili

％of　LDL

図4－2：m－Ox－LDLによるPPARα、　PPARγリガンド結合活性への影響

RAW　264．7cellに20μg！mlの酸化LDL、　m－Ox－LDLを添加し、24時間培養後、“材料と実験方法”に示したようにPPARα、　PPARγリガンド結合活性を測定した。結果は3回の実験を平均化し、平均値±標準

LDL（Mm－Ox－LDL）を用い、　PPARα、　PPARγの活性化能を検討した。　Mm－Ox－LDLはTB　ARS が7．1±0．3　nmol　MDAImg　LD：しであったのに対し、マクロファージ非存在下で同様に培養し

あった。さらにこの酸化LDLを用いてPPARα、　PPARγの活性化を検討したところ、

Mm－Ox－LDLではPPARα、　PPARγリガンド結合活性は上昇したが、　c－LDLでは活性の上昇は認められなかった（図4－3）。

　　　　　　　言

　　　　　　　葺　　4