処置にてマクロファージ内のPPARα、 PPARγ発現はそれぞれ72％、77％に減弱した。また、
PPARγのsiRNAはPPARγ1、 PPARγ2ともに抑制した。このPPARα、 PPARLγ siRNA処置細胞で
は、コントロールと比較して、酸化LDLによるABCA1のmRNAの発i現を著明に抑制し、PPAR．α、 PPARγともに阻害することにより相加効果が得られた（図9－2）。
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（＋） （＋） （＋）
7一（7）マクロファージにおける酸化LDLによるMCP・・1 mRNA発現におけるPPAR活1生化の 検討
次にPPARα、 PPARγのアンタゴニストを用いて酸化LDLによるMCP－l mRNA発現に対す る各種阻害剤の効果を検討した。マウスの腹腔マクロファージにおいて、40μg／mlの酸化
LDLはMCP－1のmRNA発現を4．7倍増加した。 PPARαの阻害剤GW6472（GW）、PPARγ阻害剤TOO70907（T）にてMCP－1のmRNA発現は増加し、 PPARα、 PPARγを同時に阻害すること でMCP－1のmRNA発現を相加的に増加させた（図10－1）。
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＃＃
（一） （＋） （＋） （＋） （＋）
con con ct y ctty
図10－1：マウス腹腔マクロファv・・一ジにおける酸化L肌によるMCP－1発現の検討
マウス腹腔マクロファージに “材料と実験方法”に示したように、PPARαの阻害剤GW6472（GW）、
PPARγ阻害剤Too70907（T）で1時間前処理（A）、若しくは、 PPARα、 PPARγのsiRNAを感染後（B）、
40μglmlの酸化LDLを添加し、24時間培養後、“材料と実験方法”に示したように、 MCP－1のm：RNA発 現をRT．PCR法にて測定した。“， p＜0．Ol，対対象t， p＜0．Ol，対酸化LDL添加の細胞群††， p＜
0．Ol，対酸化L肌とGW若しくはT添加の細胞群瓶く0．Ol，対酸化LDL添加の細胞群＃＃， p＜0．01，
対酸化LDLとPPA：Rα、 PPARγのsiRNAを感染させた細胞群
酸化LDLはマクロファージにおいて抗炎症作用を呈することが報告されている
（Hamilton et al．1995，0hl sson et a11996）。PPARα、 PPARγが、この酸化LDLによる抗炎症
作用に関与しているかを検討するために、LP SによるMCP－1 mRNA発現に対するPPARα、
48
A 含6ω邸Ωコ。↑》＜Z匡∈｝，」O
PPARγ特異的阻害の効果を検討した。
1μg／mlのLipopolysaccharide（LPS）刺激にて、マウス腹腔マクロファージにおいて、MCP－1 のmRNA発現は10．5倍に上昇したが、酸化LDLはこの上昇を抑制した。 PPARα阻害剤
GW6472（GW）、PPARγ阻害剤TOO70907（T）はこの抑制を著明に回復させ、 GW6472、TOO70907でPPARct、 PPARyを共に抑制すると、相加的に回復した。また、 PPARα、 PPARy
のsiRNAはそれぞれコントロールと比較して、酸化LDLによるMCP－1 mRNA発現抑制を著明に回復し、PPARα、 PPARγを共にsiRNAにて処理することにより、その回復には相加効 果がみられた（図10－2）。
12
10
8 6 4 2 0 LPS
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Ox－LDL （一） （一） （＋） （＋｝ （＋） （＋） Ox－LDL （一｝ （一） （＋） （＋） （＋） （＋）
siRNA con con con ct y ct＋y
図10－2：LPSによるMCP－1発現誘導に対する酸化mしの効果マウス腹腔マクロファージに “材料と実験方法”に示したように、PPARαの阻害剤GW6472（GW）、
PPARγ阻害剤Too700907（T）で1時間前処理（A）、若しくは、 PPARα、 PPARγのsiRNAを感染後（B）、
40pg〆mlの酸化LDLを添加し、24時間培養後、“材料と実験方法”に示したように、 MCP－1のmRNA発 現をRT－PCR法にて測定した。＊， p＜O．O l，対対象 †， p＜0．Ol，対 酸化LDL添加の細胞群 ††， p＜
0．Ol，対 酸化LDLとGW若しくはT添加の細胞群 ＃，＜O．Ol，対 酸化L肌添加の細胞学 ＃＃， p＜0，01，
対酸化LDLとPPARα、 PPARγのsiRNAを感染させた細胞群
一方、MCP－1の発i現は転写因子の一つであるNF－KBの活1生化に誘導を受けることが報告さ
れている（Ueda et al．1997）。そこで次に、酸化LDLによるNF一田の活性化について検討し
49た。40μg／mlの酸化LDLによりNF－KBの活性化は上昇した。 PPARα、 PPARγをそれぞれsiRNA で阻害すると、この活性化の上昇は増強され、PPARα、 PPARγをともにsiRNAで抑制する
と、相加的な増強効果が認められた。さらに1μg／mlのLPSはNF－mbの活性化を上昇させる が、酸化：LDLはこの活性化の上昇を抑制した。 PPARα、 PPARγをそれぞれsiRNAで阻害す ると、この活性化の抑制は回復し、、PPARα、 PPARyをともにsiRNAで抑制すると、相加的 な回復効果が認められた（図10－3）。
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図10－3：NF－KB活性に対する酸化LDLの影響
マウス腹腔マクロファージに “材料と実験方法”に示したように、PPARα、 PPARγ、 LacZのsilVNAを 感染後、40μg！mlの酸化LDLを単独添加し24時間培養後（A）、または、40μg！m lの酸化LDLとlpglm 1 のlipopolysaccharide（LPS）を同時に添加し24時間培養後（B）、“材料と実験方法”に示したように、
NF・KBの活性を測定した。’， p＜0．Ol，対対象 ’”，p＜0．Ol，対 LPS添加の細胞群 ＃， p＜0．Ol，対 酸 化LDLとPPARα、 PPARγ、 LacZのsiRNAを感染させた（LPS添加の）細胞群 ＃＃， p＜0，01，対 酸化LDL
とPPARα、 PPARγのsiRNAを感染させた（LPs添加の）細胞群
50
8．考察
酸化：LDLとPPARsの活性化
これまで、酸化LDLによるPP ARα、 PPARyの活1生化には酸化LDLに含まれる、9－HODE、
13－HODE、酸化リン脂質などが、その直接的なリガンドとなり活1生化を誘導すると報告さ
れてきた（Lee et al．2000， Nagy et al．1998）。しかし今回の検討により、酸化LDLによるPPARα、
PPARγの活性化にはCOX－2の過剰発現も関与していることが考えられた。
酸化LDLによるPPARα、 PPARγ活性化が、 LDLの酸化の程度に起因しているかを検討す るため、酸化の程度を弱めたmildly oxidized LDL（m－Ox－LDL）を用いて検討した。すると、
m－Ox－LDLでも著明にPPARα、 PPARγの活性化を誘導することから、酸化LDLによるPPARα、
PPARyの活性化にはその：LDLの酸化に起因するものと考えられた。さらに、硫酸銅による LDLの酸化よりも、動脈硬化病変でより生理的に起こっていると思われる、マクロファー
ジの存在下で酸化を誘導したmacrophage－mediated Ox－LDL（Mm－Ox－LDL）を作製し、その効 果を検討したところ、やはり同様にPPARα、 PPARγの活性化が認められたことから、実際
に動脈硬化巣において、酸化LDLによるPPARの活1生化が引き起こされている可能性が考
えられる。
酸化：LD：しによるPPARs活性化機序一COX－2の関与
COX－2はprostaglandin（PG）合成における律速酵素であり、アラキドン酸から、 PGG2を 経てPGH2までの合成に関与している（Campbell W B et al．1996）。酸化LDL，が単球、マク
ロファージにおいてCOX－2の発現を誘導することは既に幾つか報告されている（Pontsler et
51
al． 2002，Claus et al．1996）が、その詳細な機序、臨床的意義については不明な点が多く残
されていた。今回の検討により、マクロファージにおいて酸化LDLがCOX－2の発現を誘導：するが、こ の時、酸化LDLにより誘導されるp38MAPKの活性化は関与せず、 ERK 1／2の活性化が関与す ることを見出した。さらに、酸化LDLによるPPARα、 PPARyの活性化はCOX－2、 ERK1／2の 阻害により有意に阻害されることから、マクロファージにおいて、酸化LDLによるPPARα、
PPARγの活性化はEPK 1／2を介したCOX－2の発現に起因すると考えられた。興味深いことに、
申請者らはスタチン製剤がPPARα、 PPARγの活性化能を持つこと、その機序にCOX－2の過 剰発現が関与することを報告している （Yano et al．2007）。これらの事象は、 COX－2の過 剰発現に繋がる細胞応答には、PPARα、 PPARγ活性誘導の可能性が存在することを示唆し
ている。
様’々な刺激によるCOX－2の転写調節機構としては、転写因子である
CCAAT／enhancer－binding protein一β（C／EB耶）やAP－1の関与が報告されている。一方、今回 の検討でCOX－2発現にはERK1／2が関与することを見出したが、このAP－1やC旭BPβの活性 はMAPKのシグナル伝達により制御されていると考えられている。このことから、酸化LD：し
によるCOX－2発現には、これら転写因子の関与が予想される。今後、これらの証明のためにさらなる検討を行う予定である。
酸化：LD：しによるPPARs活性化機序
一ERK I／2－COX－2シグナルを介した15d－PGJ2産生の関与
本研究では、酸化LDLによるCOX－2の発現が細胞内の15d－PGJ2を増加させることを見出
した。さらに、酸化LD：Lは15d－PGJ2のみならず、 PGD2、 PGE2も増加させることから、酸化 LDLによるCOX－2発現はPGの下流のシグナルを調節していると考えられる。15d－PGJ2が、
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PPARγの強力なリガンドであることは良く知られているが、Formanらは、15d－PGJ2がPPARα の直接的なリガンドではないが、PPARαの活性化能を持ちうることを報告しており
（Forman et al．1997）、この点は本研究の実験結果と一致している。このことにより、COX－2 による15d－PGJ2の増加は酸化LDLによるPPARα、 PPARγ活性化の機序の一つと考えられる。
様々な動脈硬化巣にはCOX－2の産生増加が認められること、さらにはLDL受容体欠損マ