博 士 論 文 概 要
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(2) リソグラフィ技術の進展は、その応用先を半導体素子製造だけでなく、生体分子や細胞を対象とし たパターン形成をも可能にした。そこでは、フォトリソグラフィに求められてきた従来の感光性ポリ マーだけでなく、熱や pH に対する感応性を有する分子や自己組織化単分子膜が用いられている。い ずれにしても、リソグラフィのための感応性に加えて、生体分子や細胞への親和性が同時に担保され ている。 細胞パターニングでは例えば、基板表面の特定部位に細胞を接着させるために、細胞接着性分子と 非接着性分子とからなるパターンが予め基板表面に形成される。その表面に細胞を播種することによ って、細胞が自ら細胞接着性表面へと遊走し、細胞接着性表面に接着して成長する性質が上手に利用 される。こうして細胞接着性表面のみに細胞を接着させることができる。細胞接着性／非接着性分子 からなるパターンの形状を 1 m レベルで制御することが可能となっており、単一細胞レベルでの細胞 パターニングも可能である。1 m レベルでの制御性は、単一細胞接着位置の制御に留まらず、細胞の 伸展、細胞分裂の方向、神経細胞の場合には神経突起の伸長方向や本数といった細胞の形状制御も可 能であることを意味する。このような精緻なパターニング技術の活用により、細胞の形状と機能の関 係性を単一細胞レベルで評価したり、配列した単一細胞の薬理作用を定量的に評価するためのバイオ チップを作製したりすることができるようになった。 本論文の対象である神経細胞は脳神経系の情報伝達を司る細胞である。特定の接続構造を介して高 次の情報処理がなされるため、従来の半導体素子製造における目的との類似性から、リソグラフィの 有用性 ― 神経細胞同士の接続制御 ― を期待できる。しかしながら、神経細胞は比較的脆弱な細胞で あり、他の細胞に比べてパターン上で培養することが難しい。とりわけ、単一神経細胞レベルでのパ ターニングは困難である。神経細胞は厳密な細胞極性を有し、神経突起から伸長した複数の突起は樹 状突起と軸索とに分化する。また、神経細胞は興奮性神経細胞と抑制性神経細胞とに大別でき、さら に多数の細胞種に分類される。細胞種に応じて発現する機能も異なる。細胞の種類、形状、および発 現する機能の間に相関が認められることから、細胞パターニング技術を活用して神経細胞の接着位置 や形状を制御し、それに応じて機能や接続状態を制御することができれば、神経回路網の情報伝達様 式について、知見を深めることができると考えられる。 本論文は、細胞へのダメージを軽減できる新たな細胞パターニング方法の開発、および、表面パタ ーン上で培養した単一神経細胞の機能制御に関して述べたものであり、全 5 章からなる。以下に各章 の概要を述べる。 第 1 章「序論」では、細胞パターニング技術の先行研究の長所と短所をまとめ、現状の課題と将来 性について述べる。そして、本研究の目的を具体的に明らかにする。 第 2 章「可視光応答性酸化チタンの光触媒作用を活用した液中細胞パター二ング法の開発」では、 パターン形成における細胞へのダメージ軽減を目的として、可視光応答型酸化チタンの光触媒能を活 用した液中細胞パターニングについて述べる。細胞接着を時空間的に制御するためには、細胞が接着 する足場を細胞培養環境下（培養液中）で改質する必要がある。例えば、基板表面の特定部位を非接 着性から細胞接着性へと培養液中で改質できれば、細胞の遊走や分裂方向、さらには神経突起の伸長 方向を、その場（細胞培養環境下）で制御できる。このような液中パターニングを実現するために、 著者は酸化チタンの光触媒作用に着目した。酸化チタンは化学的に安定で透明な材料で、生体適合性 を有し、細胞培養の足場材料に適する。これまでに、細胞非接着性の有機シラン単分子膜を成膜した 酸化チタン表面に紫外光を照射することにより、この有機シラン単分子膜を部分的に光分解し、PC12 細胞（ラット副腎髄質褐色細胞腫）の遊走・分裂方向や、ラット海馬神経細胞の接着領域が制御でき No. 1.
(3) ることが示されていた。一方で、紫外光は細胞にダメージを与えることが知られており、比較的脆弱 な神経細胞の突起誘導に用いることはできない。そこで著者は可視光応答型酸化チタンに着想を得て、 細胞に導入されるダメージの低減を目的として、可視光応答型の酸化チタン薄膜を石英基板表面に蒸 着し、この薄膜上で PC12 細胞の液中パターニングの実行可能性を評価した。酸化チタンは 600 ℃以 上で熱処理を施すとルチル型の結晶構造をとり，吸光波長を 411 nm にまで長波長化できる。また、 結晶中に酸素欠損を含むことで、酸素欠損準位を介した長波長化も見込めることから、スパッタ装置 を用いて、酸素を流入せずに 640 ℃で酸化チタンを蒸着した。X 線結晶構造解析の結果、この酸化チ タンはルチル型の結晶構造をとり、可視領域での吸光性を示した。すなわち、過去の報告にある結晶 構造が再現された。この酸化チタン表面に細胞非接着性のオクタデシルシラン単分子膜を成膜し、コ ラーゲンを含む培養液に浸漬した後、波長 420±20 nm、約 1 kJ cm-1 の可視光を照射したところ、照 射領域内のオクタデシルシラン単分子膜が分解し，コラーゲンに置換した。この表面に PC12 細胞を 播種したところ、照射領域のみに PC12 細胞が集団となって接着した。この細胞集団に隣接して約 1 kJ cm-1 の可視光を培養液中で照射し、さらに培養を継続したところ、照射領域に向かって細胞が遊走し 増殖した。また、細胞に直接紫外光と可視光を照射した際の酸化ストレスを、酸化ストレスマーカ CellROX を用いて定量的に評価したところ、1 kJ cm-1 の可視光を照射した場合の酸化ストレスは、未 照射の細胞のそれに比べて低いものであった。一方、200 J cm-1 の紫外光（波長 360-370 nm）を照射 した場合の酸化ストレスは、光をまったく照射しなかった細胞のそれと比べて増大した。この結果は、 可視光応答型酸化チタンの光触媒を活用した液中細胞パターニングが細胞に与えるダメージが、従来 の紫外光による液中細胞パターニングが与えるダメージに対して十分に低く抑えられ、液中細胞パタ ーニング手法として有用性が高いことを示している。本手法は、単一神経細胞の突起誘導とそれによ る局所神経回路の形成に特に有用である。 第 3 章「単一神経細胞の長期培養に向けたマイクロパターン上での細胞部位の形状制御」では、軸 索と樹状突起の伸長方向を規定したパターン上で単一神経細胞を長期的に培養するための手法の開発 について述べる。細胞体接のための円形パターン（直径 15 m）を中心に、放射状に伸びた 4 本のラ インパターン（100 m×1 本， 20 m×3 本）を持つマイクロパターン上で単一神経細胞を培養する と、ラインパターンに沿って神経突起が伸長する。ここで、非対称的に長い（100 m 長）の 1 本の ライン上に伸長した突起が軸索に分化し、残りの 3 本の短いライン上（20 m 長）に伸長した突起は 樹状突起となることが報告されていた。これにより培養 2 日目に神経細胞は極性を獲得する。第 2 章 の液中パターニングと本手法とを融合すると、単一細胞間の軸索と樹状突起とを、細胞培養環境下に おいて、非標識で接続することができるため、特定の接続構造を有する神経細胞回路を構成する手法 として有用である。しかしながら、この非対称マイクロパターンを用いて単一神経細胞を培養すると、 培養 4 日目には約半数が死滅し、培養 7 日目の生存率は 13.3%に留まる。著者は、上記の非対称パタ ーンの形状を改良することにより、培養皿での培養と同じように神経細胞を長期間培養できると考え、 細胞体接着部位、軸索伸長経路、および、樹状突起伸長経路のそれぞれについて検討した。 メトキシ基を末端基としてポリエチレングリコールを主鎖とするシランカップリング剤から成膜さ れた単分子膜（細胞接着阻害領域）と poly-D-lysine 吸着表面（細胞接着領域）とをカバーガラス表面 に作り分けた。作製したマイクロパターン上でラット海馬神経細胞を培養し、培養 2、4、7、10 日目 に光学顕微鏡で観察し、生存率を測定した。その結果、軸索伸長経路（長いラインパターン）を 400 m に長くしたパターン上では培養 7 日目の生存率が 63%に向上した。また、細胞体が十分に伸展できる ようの中央の円形パターンの直径を 25 m に増大したパターン上では培養 7 日目の生存率が 36％に向 上した。一方，軸索伸長経路の長さを 100 m で一定とし、樹状突起の伸長経路の数や樹状突起の長 No. 2.
(4) さを変えたパターン上では、細胞の生存率に変化は見られなかった。これらの結果から、パターン上 で孤立して培養された神経細胞は、細胞体が十分伸展でき、なおかつ軸索の伸長可能距離が長くなる ほど長期間生存できることを示唆している。これらの結果を踏まえて、400 m 長のラインパターン 1 本と 20 m 長のラインパターン 3 本が中央の円形パターン（直径 25 m）から放射状に伸びたパター ン上で神経細胞を培養したところ、培養 7、10 日目の生存率が 58%、46%にそれぞれ向上した。加え て、このパターン上に大脳皮質神経細胞を播種して培養したところ、上記の海馬神経細胞と同等の生 存率を示した。 第 4 章「表面マイクロパターンを用いた興奮性/抑制性神経細胞の非標識判別」では、マイクロパタ ーンを活用することにより、生きた状態の神経細胞の細胞種を非標識で判別できる新手法について述 べる。大脳皮質の主要な神経回路はグルタミン酸作動性の興奮性神経細胞と GABA 作動性の抑制性神 経細胞で構成される。興奮性細胞と抑制性細胞はそれぞれ特異的な遺伝子発現パターンを有するため、 その違いに基づいて両者を判別できるが、そのためには免疫染色法や遺伝子導入といった化学固定や 蛍光標識を前提とする手法に頼らざるを得なかった。分散培養系において、神経細胞の種類を生かし た状態でかつ非標識で判別できれば、単一細胞内の分子イメージングや神経細胞回路を再構成する際 に大きな利点となる。 分散培養系において、興奮性細胞と抑制性細胞とでは極性形成時期に差があることが知られていた。 また、第 3 章で記述したように、異なる長さを持つ複数のラインパターンに沿って神経突起を伸長さ せると、最も長いラインに沿って伸長した突起が軸索に分化することが分かっている。前者は興奮性 細胞と抑制性細胞の判別の基準として、後者は非標識で軸索を判別するのに活用できる。そこで筆者 は、両者を組み合わせた新しい判別法の検討を行った。すなわち、マイクロパターン上で神経細胞を 培養し、ラインパターンに沿って伸長する軸索の伸長速度を計測することで、その神経細胞が興奮性 または抑制性細胞のどちらであるかを判別できるかを実験的に検証した。 第 3 章で記述した長期培養可能な非対称マイクロパターンを用いた。興奮性細胞と抑制性細胞の存 在比がおおよそ 4:1 であるラット大脳皮質神経細胞を用いた。培養 2 日目から 7 日目において 24 時間 毎に細胞の形態を観察し、軸索伸長経路に伸びる突起の長さを計測した。その後、MAP2 （全神経細 胞マーカ）と GAD67 （GABA 作動性神経細胞マーカ）を用いた免疫蛍光染色を施し、最終的に各細 胞が興奮性／抑制性細胞のどちらであるかを決定した。 非対称マイクロパターン上で細胞を培養すると、抑制性神経細胞の軸索形成が興奮性神経細胞のそ れに比べて遅くなり、培養 6 日目の軸索長しきい値を 110 m に設定すると 98%の確率で興奮性／抑 制性細胞の判別が可能であることが分かった。パターンなしのガラス表面でも抑制性細胞の軸索形成 が興奮性細胞のそれよりも遅くなる傾向をもつことを確認したが、パターンなしの場合には、培養日 数の経過に応じて軸索長がばらつき、興奮性-抑制性判別のためのしきい値を設定できなかった。これ らの結果は、パターン上では軸索伸長方向と本数が規定されるため、細胞ごとの軸索形成のタイミン グが一定になるように制御されたため、興奮性／抑制性の軸索伸長速度に明確な差が生まれたと考え られる。 第 5 章「結論」で本論文の結論を述べる。本論文で著者は細胞に与えるダメージの少ない新しい液中 細胞パターニング法について述べた。マイクロパターンの形状を制御することで、マイクロパターン 上での神経細胞の長期培養および判別が可能となった。これらの新手法を組み合わせることにより、 単一神経細胞を素子とする局所神経回路を基板上に構築し、神経回路の構成的に探究するためのプラ ットフォームを作ることができる。第 5 章では本研究の将来性および波及効果についても述べる。 No. 3.
(5) Ｎｏ.1. 早稲田大学 氏名. 河野. 翔. 博士（工学）. 学位申請. 研究業績書. 印 （2018 年 2 月 7 日現在）. 種 類 別. 題名、. 発表・発行掲載誌名、. 発表・発行年月、. 連名者（申請者含む）. 学術論文 ◯. S. Kono, K. Furusawa, A. Kurotobi, K. Hattori, H. Yamamoto, A. Hirano-Iwata, T. Tanii: In situ modification of cell-culture scaffolds by photocatalysis of visible-light-responsive TiO2 film, Japanese Journal of Applied Physics, 57 (2018) 027001. 学術論文 ◯. S. Kono, H. Yamamoto, T. Kushida, A. Hirano-Iwata, M. Niwano, T. Tanii: Live-cell, label-free identification of GABAergic and non-GABAergic neurons in primary cortical cultures using micropatterned surface, PLOS ONE 11 (2016) e0160987. 学術論文 （共著）. R. M. Hasani , G. Ferrari, H. Yamamoto, S. Kono, K. Ishihara, S. Fujimori, T. Tanii, E. Prati: “Control of the correlation of spontaneous neuron activity in biological and noise-activated CMOS artificial neural microcircuits”. [arXiv,(2017),1702.07426-]. 学術論文 （共著）. K. Sekine, H. Yamamoto, S. Kono, T. Ikeda, A. Kuroda, T. Tanii: Surface modification of cell scaffold in aqueous solution using TiO2 photocatalysis and linker protein L2 for patterning primary neurons, e-Journal of Surface Science and Nanotechnology 13 (2015) 213.. 学術論文 （共著）. H. Yamamoto, T. Demura, K. Sekine, S. Kono, M. Niwano, A. Hirano-Iwata, T. Tanii: Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment using TiO2 Photocatalysis, Journal of Visualized Experiments 104, 10.3791/53045 (2015).. 学術論文 （共著）. H. Yamamoto, T. Demura, M. Morita, S. Kono, K. Sekine, T. Shinada, S. Nakamura, T. Tanii: In situ modification of cell-culture scaffolds by photocatalytic decomposition of organosilane monolayers, Biofabrication 6 (2014) 035021.. 国際学会. S. Kono, K. Furusawa, S. Fujishiro, H. Yamamoto, T. Tanii, In situ modification of cell-culture scaffolds by photocatalysis of visible-light-responsible TiO2 film, 5th RIEC International Symposium on Brain Functions and Brain Computer, Sendai, February,2017.. 国際学会. S. Kono, T. Kushida, H. Yamamoto, T. Tanii, Live-cell identification of excitatory-inhibitory cell types of cultured cortical neurons focusing on specific axon growth length on micropatterns, 4th RIEC International Symposium on Brain Functions and Brain Computer, Sendai, February, 2016.. 国際学会. S. Kono, T. Kushida, H. Yamamoto, T. Tanii, Live-cell, label free identification of excitatory-inhibitory neurons on micropatterned surfaces, Eighth International Conference on Molecular Electronics and Bioelectronics (M&BE8), Tokyo, June, 2015.. 国際学会. S. Kono, K. Ishihara, S. Fujimori, H. Yamamoto, T. Tanii, Size-dependent modulation of spontaneous activity in micropatterned neuronal networks, 3rd RIEC International Symposium on Brain Functions and Brain Computer, Sendai, February, 2015. 国際学会. S. Kono, H. Yamamoto, K. Sekine, T. Tanii, In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers on Titanium Dioxide, The 5th International Symposium on Advanced Materials Development and Integration of Novel Structural Metallic and Inorganic Materials (AMDI-5), Tokyo, November, 2014..
(6) Ｎｏ.2. 早稲田大学 種 類 別. 題名、. 博士（工学） 発表・発行掲載誌名、. 学位申請. 研究業績書. 発表・発行年月、. 連名者（申請者含む）. 国際学会. S. Kono, T. Kushida, H. Yamamoto, T. Tanii, Fabrication of micropatterned substrate for live-cell, label free identification of excitatory-inhibitory neurons, The 7th International Symposium on Surface Science (ISSS-7), Matsue, November, 2014.. 国際学会. S. Kono, H. Yamamoto, T. Kushida, T. Tanii, Live-cell, label-free identification of excitatory-inhibitory neurons in culture using surface micropatterns, The 2nd RIEC International Symposium on Brain Functions and Brain Computer, Sendai, February, 2014. 国際学会 （連名）. H. Yamamoto, S. Kono, T. Tanii, M. Niwano, A. Hirano-Iwata, TiO2-assisted photocatalytic lithography: Applications in patterning neuronal cells and networks, The 2017 European Materials Research Society Spring Meeting (EMRS Spring 2017), Strasbourg, France, May, 2017. 国際学会 （連名）. K. Hattori, S. Kono, H. Yamamoto, T. Tanii, A computational study on spontaneous activity of a single neuron, The 5th RIEC International Symposium on Brain Functions and Brain Computer, Sendai, February, 2017. 国際学会 （連名）. K. Sekine, H. Yamamoto, S. Kono, S. Fujishiro, T. Ikeda, A. Kuroda and T. Tanii, Laser-Scanning Photocatalytic Lithography of Organosilane Monolayers for Fabrication of Artificial Neuronal Circuits, 28th International Microprocesses and Nanotechnology Conference (MNC2015), Toyama, November, 2015.. 国際学会 （連名）. K. Sekine, H. Yamamoto, S. Kono, T. Ikeda, A. Kuroda, T. Tanii, Surface modification in aqueous solution using TiO2 photocatalysis and a linker protain L2 for patterning primary neurons, The 7th International Symposium on Surface Science (ISSS-7), Matsue, November, 2014.. 国際学会 （連名）. H. Yamamoto, S. Kono, T. Kushida, A. Hirano-Iwata, M. Niwano, T. Tanii, Optimization of micropattern geometry for long-term culture of isolated neurons and identification of excitatory-inhibitory cell types, Neuroscience 2014, Washington DC, USA, November, 2014. 国際学会 （連名）. T. Demura, H. Yamamoto, M. Morita, S. Kono, S. Nakamura, T. Tanii, Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayer on TiO2 and its Application to In-Situ Modification of a Cell-Culture Surface, 25 th International Microprocesses and Nanotechnology Conference (MNC2012), Hyogo, October, 2012.. 国際学会 （連名）. H. Yamamoto, T. Demura, M. Morita, S. Kono, S. Nakamura, T. Tanii, In-situ modification of cell-culture scaffolds by TiO2 photocatalysis, 6th International Symposium on Nanomedicine, (ISNM2012), Matsue, November, 2012.. 国内学会. 河野翔, 黒飛敦, 服部晃平, 山本英明, 谷井孝至, 可視光応答酸化チタン薄膜の光触媒能を利 用した細胞の液中パターニング(II), 第 78 回応用物理学会秋季学術講演会，福岡国際会議場， 福岡，2017 年 9 月．. 国内学会. 河野翔, 黒飛敦, 服部晃平, 山本英明, 平野愛弓, 谷井孝至, 可視光応答酸化チタンの光触媒 作用を活用した液中表面改質と細胞パターニング, 第 37 回表面科学学術講演大会，横浜市立 大学，神奈川，2017 年 8 月．.
(7) Ｎｏ.3. 早稲田大学 種 類 別. 題名、. 博士（工学） 発表・発行掲載誌名、. 学位申請. 研究業績書. 発表・発行年月、. 連名者（申請者含む）. 国内学会. 河野翔，藤森壮也，山本英明，谷井孝至，有機単分子膜パターンにより細胞間接続を制御し た 2 細胞神経回路の構築と解析，第 77 回応用物理学会秋季学術講演会，朱鷺メッセ，新潟， 2016 年 9 月．. 国内学会. 河野翔, 櫛田昂歳, 山本英明, 谷井孝至, マイクロパターン上での培養による興奮性-抑制性 神経細胞の非標識判別 II, 第 76 回応用物理学会秋季学術講演会，名古屋国際会議場，愛知， 2015 年 9 月．. 国内学会. 河野翔, 櫛田昂歳, 山本英明, 谷井孝至, マイクロ加工基板を用いた興奮性/抑制性神経細胞 判別法の開発, 第 37 回日本神経科学大会，パシフィコ横浜，神奈川，2014 年 9 月．. 国内学会. 河野翔, 山本英明, 出村崇徳, 森田麻裕, 中村俊, 谷井孝至, マイクロ加工基板上にパターニ ングされた神経細胞における極性形成(Ⅱ), 第 60 回応用物理学会春季学術講演会，神奈川工 科大学，神奈川，2013 年 3 月．. 国内学会. 河野翔，山本英明，森田麻裕，谷井孝至, マイクロ加工基板上での単一神経細胞の長期培養, 第 74 回応用物理学会秋季学術講演会，同志社大学，京都，2013 年 9 月．. 国内学会 （連名）. K. Hattori, S. Kono, T. Yoneyama, A. Nakanishi, H. Yamamoto, T. Tanii, An experimental and computational study on spontaneous firing pattern of a single neuron, 第 27 回日本神 経回路学会全国大会，北九州国際会議場，福岡，2017 年 9 月．. 国内学会 （連名）. 古澤昂平, 河野翔, 藤城翔偉, 山本 英明, 谷井孝至, 可視光応答酸化チタン薄膜の光触媒能 を利用した細胞の液中パターニング, 第 64 回応用物理学会春季学術講演会，横浜メッセ，神 奈川，2017 年 3 月．. 国内学会 （連名）. 藤城翔偉，関根浩平，河野翔，池田丈，黒田章夫，山本英明，谷井孝至, レーザ走査光触媒 リソグラフィを活用した液中細胞パターニング, 第 63 回応用物理学会春季学術講演会，東京 工業大学，東京，2016 年 3 月．. 国内学会 （連名）. 櫛田昂歳，河野翔，山本英明，谷井孝至, マイクロパターン上での培養による興奮性-抑制性 神経細胞の非標識判別, 第 61 回応用物理学会春季学術講演会，青山学院大学，神奈川，2014 年 3 月．. 国内学会 （連名）. 山本英明, 森田麻裕, 出村崇徳, 河野翔, 谷井孝至, 中村俊, 素子数が規定された培養神経細 胞ネットワークにおける自発的神経活動の解析, 第 36 回日本神経科学大会，国立京都国際会 館，京都，2013 年 6 月．. 国内学会 （連名）. 森田麻裕, 山本英明, 出村崇徳, 河野翔, 中村俊, 谷井孝至, マイクロパターン基板上の微小 神経回路における自発的神経活動, 第 60 回応用物理学会春季学術講演会，神奈川工科大学， 神奈川，2013 年 3 月．. 国内学会 （連名）. 出村崇徳, 山本英明, 森田麻裕, 河野翔, 中村俊, 谷井孝至, 酸化チタンの光触媒作用を用い た有機シラン単分子膜の液中分解と細胞培養環境での細胞接着足場改質, 第 60 回応用物理学 会春季学術講演会，神奈川工科大学，神奈川，2013 年 3 月．.
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