関 す 研究 ド 骨格筋

金沢大学十 全 医 学 会雑 誌 第9 6巻 第6 号 1 1 7 卜 1 1 8 8 く1 9 8 7ケ

骨 格 筋^{の C a 廿 パ} ラ ド^ッ クス に関する研 究

− そ^の発 現機 序お よ び筋 疾 患 成 立に関わ る意養の検^{討 一}

食沢 大 学 医 学部 付 属柄院神経 内科 く主任二高 守正治教 授う

橋 井 美 奈 子

く昭和6 2年1 1月2 5日受 付1

11 71

膜異 常^およ び筋細 胞 内過 剰Ca ^廿 を引き金と し て展 開^{す る}病 態と， ジス ト^ロ フ ィ ^ー筋との類似 性が 注目 さ れ て久しい． 本研 究は， 細 胞 内 過剰^{Ca 廿} 流入 を も た ら す膜の病 的機 序を解 明す る た め， 心筋で見 ら れ る Ca

サ パラ ドックス_，す な わ ち濯 流溶 液のCa

什 濃 度をフリ^ー か ら 正常に戻す と，Ca ^廿 が細胞 内^へ 過 剰流入 し筋 細 胞 壊死に至 る 現象が骨 格筋で も起^こる か を調^べ， 起^こる と す ればその発 現機 序は何である か につき検 討し た．ウ イ^スタ ^ー系雄ラット横 隔膜 筋を 用^い，Ca

腑 を含ま な^い溶 液 くCa ^廿 フリ^ー溶 液 げ 潜 流後， リ^ンゲ^ル液で再 濯 乱 Ca ^什 プ リ^ー 溶 液 濯 流前^に対す る変 化を，電 気生理学 的方 法， お よ び細胞 内イ オ^ン濃 度測 定^によ り調べた^． 更に本 現 象の発現機 序 検 討のた め， 濯 流溶 液^に種々の修 飾を加え た^．Ca

廿

フ リ^ー溶 液湾 流^によ る筋 張 力変 化で は， リ^ンゲル液 再 潜 流1 5 分後の記録で， 単収 縮 張力は 60 士1 1％ く^m e a n 士S．DI−， 強 縮 張 力^{は 6 0士1 0}％^に低 下し た^． 湾 流 条件を変え た場 合^の張力 変 化を Ca

廿 フリ^ー 溶 液^のみ の潜 流群と 比較し た結果 で は， Ca ^什 フリ^ー 溶液^へのウ ア^パイ^ン添加， お よ び再 湾 流溶 液^に低N a^＋処理 を加え た場 合， 再 濯 流後^の張 力 低下は ^一 層著 明 化し， 再 濯 流 中亡^Na^＋L⁻E^{Ca 廿}コ^。交 換系^によ る細 胞外^Na＋流 出，

細胞 内Ca ^廿 流入機 序が 示唆さ れ た． Ca 廿

フリ ^ー溶液 濯 流^句再 濯 流^にわ た り^ニフェ ジ ピンを添 加， ま た は Ca

廿

フリ^ー 溶 液の M _g ^廿 濃度を高め た場 合には，再 濯 流後^の張力 低 下は阻止 さ れず，本 現象^へ のslo w Ca ^廿 Cha n n el の関 与は少な^いと 示唆さ れ た．Ca ^骨 フリ ^ー溶 掛^こ，ミ トコンド リ ア脱 共 役剤のc a rbo nylcya nide^． p⁻triflu olo metho xy phe nylhyda z o n e くF C C Pl を添加し て， ミ ト^コンド リ ア^への Ca

廿 取り込み阻止^によ

る張力 低下 阻 止 を期待し た が， 逆^に張 力消 失^．持 続 的筋 拘締を認め，F C C P によ りade n o sin etri_pho sphate

仏T Pl過剰 消費^から細胞 崩壊が促さ れ る機 序^が考え ら れ た． 筋 細胞 内イ オ^ン濃 度は， Ca ^廿 フリ^ー溶 液^に ウ ア^パイ^ンを添加し本 現 象を強 調 化し た筋で， 再 漂流1 5 分後^に細 胞 内Ca ^廿 増 加， Na^十増 加， K^十減 少を みと め た． Ca ^廿 フリ^ー溶 液 湾 流直 後^では， Ca ^什 フリ ^ー 溶液のみの潜 流 群で細 胞 内Ca^{i ＋} 減少を認め， 低 Na^＋処理 を加え た C^{a 廿 フ}リ ^ー溶 液 潜流 群^では，Ca ^什 フリ^ー溶 液のみ の潜 流群^に比 し，細 胞 内Ca ^骨 減 少 が有 意に抑え ら れ， Ca ^什 フリ^ー溶 液 潜 流 中E^Na＋j^。一仁^{Ca 什}コ^．交 換 系^によ る細胞 外^への Ca

廿 流 出機 序が 示唆さ れ た． 以 上 よ り， 骨 格 筋^でも細 胞 内過 剰Ca

柵 流入によ る Ca ^サ パラ ドックスが起^こること を明ら かにす る と共^に， 発 現機 序と し て， Ca ^廿 フリ^ー溶 液 濯流 中で はE^{N a＋}j。

−E^{Ca 廿}L 交換 系が， リンゲ^ル液

再濯 流 中では仁^{N a＋}コ^ド亡^Ca一^け_コ0交 換 系が 主役を演 ずる と考え ら れ た．

Key ^{w o r}ds Ca^廿 p^{a r a}do x_， N a^＋−Ca^廿 e x cha ng^{e s}y^ste m ， Slo w C a^廿 cha n n el，

mito ch ondrial u n c o uple r

，intr a c ellular Ca^{i ＋} o v erlo ad

遺伝性， 進 行 性^の筋 力低 下を主 徴と す る筋ジスト^ロ あって細胞 外Ca ^骨 の細 胞 内^へ の過 剰 流入 が生じ，

フ ィ ^ー症 く^m u s c ula rdystr oph_yl ^にお け る筋 細胞 崩 壊 Ca

廿 依 存 性 中性プ^ロテ ア^ー ゼ が活性 化さ れ限 定 分解 成立 機序の ^一 つ と し て， 筋 細 胞 膜^に何ら かの異 常が が行わ れ， ま た リソゾ^ー ム ^ー カ テ プシ ン群^によ る非 限 A bbr e viatio n s こ A T P， ade n o sin e tri_ph o sphateニE D T A ， eth_yle n edia min etetr a a c etateニ E G T A ， eth_yle n egl_{yc o}l⁻bis⁻U^{，−a min o−eth}yl ethe rJ ^N ， N ^，−tetr a a C etic a cid₃ F C C P_， C a rb o nyl⁻

Cy^{a n}ide⁻P⁻triflu olo m ethoxy phe nylh_ydr a z o n e三O C P C

， 0⁻C r e S Ol⁻_ph_thalein c o m ple x o n eニPo_，

11 7 2 橋

定 分 解な どが進 行し， 筋 細 胞壊 死^に至 る過 程が考え ら れ て^いる^り21． しかし， 過 剰Ca ^骨 流入の最初の引き 金 と な る筋細 胞 膜 異常^が何^であ るか に ついて は， 多くの

議 論がある と^ころ で あ る^釣．

本 研 究は， この点の解明 の糸口 を求め る^こと を目 的 と し て， 心筋 壊 死^{の モ}デ^ルと し て広く研 究さ れて いる

t tca ^什 パラ ドック^ス，， 現 象の概 念を導入 し検 討し た^．

本 現 象は， Z im m e r m a n ら⁴¹が， ラッ ト^の心臓を C^{a 廿} フリ^ー溶 液で濯流し た後， さ ら^に Ca ^廿 を含む溶 液^で 再濯 流す る と， 心筋細 胞Ca

骨 の増 加と共^に， 非 可 逆 的な筋 張力 消 丸 著 明な 心筋 細胞 拘 縮， ク^レア チ^ンカ イ ネ^{ー ス} くC E

．^{う等筋 酵 素の大 量 遊 出を認め ること を発} 見し， 呼称さ れ た も の^である． その後， その成立機 序

に つ いて は， Ca

廿 cha n n el，N a^＋−Ca

廿 交換 系を含む

多く の解 析が加え ら れ て き た． 一方， 骨格 筋^{に つ い}て も， 異常Ca

廿 流入^によ る筋

壊 死の機 序を解 明す^べく， 実 験 的^に細 胞 外か らの非生 理的Ca

廿 流入 を お^こすモデルが作ら れ て き た．C^{a サ} イ オ ノフ ォア A 2 3 1 8 7^5I，塩 酸プ ビ^バカ イ^ン61，リゾ^レシ チン⁷月こよ る筋細 胞 処理 や， タ^ングステ^ン線 穿 刺^によ る膜 破 壊等⁸¹が そ れ である． しか し， いずれ も薬理学 軌 機 械 的修 飾を必 要と す る も の で あ^った． そこで，

これ ら の修 飾な しに細 胞 内 異 常Ca ^廿 流入 を も た ら す 方法と し て， 既述の Ca ^廿 パラ ドック^ス現 象が有用 と 考え ら れ る． し か し， 骨格 筋で も 心筋 同様^に本 現象が お こり う る か が問 題と な る． Ca rpe nte r ら^9l， So z a

ら^{1 011 1}鳩，骨格 筋で もお こり う る と報 告し て^いる が，彼 ら は大 量^{の et}hyle n edia min e tetr a a c etate くE D T A l ^．ethyle n egl_yc ol⁻b is⁻く月^{− am in o．ethylethe r}l N ，N^，−

t_etr a a c etic a cid くE G T Al を併用 し^て成 功し て お り，

これ ら キ^{レ ー} ト剤には^， 膜 結 合Ca ^什 に対す る キ^{レ ー} ト作用^{1 21}， N a^＋−Ca ^廿 交換 系促 進作用^{1 31}， お よ び N a^＋

等^のイ オ^{ン の}細 胞膜 透過 性を高め る作用^川が あ ること を考え れば， そ の^二次 的影 響^によ る修 飾は無 視^でき な いと思わ れ る．

本 研 究で は， Ca

廿 フリ^ー 溶 液作 製^のた めには最少 限 度^のE G T A く0．1 m Ml 添力朋子^{と ど め て，ラッ ト}横 隔 膜 筋を処理 し， 筋 張 力変 化お よ び筋 細 胞 内イ オ^ン濃 度 変 化を指 標と し て， 骨 格 筋^にお け る C^{a 廿 パ}ラ ドック ス現 象を定 量 的^に評価す る と共^に，

一 部， 心 筋のそ れ

と は異な る膜の イ オン透過 機 構を解 析し， 筋ジスト^ロ フ ィ ^ー 症類 似^のCa

廿

．indu c ed ^m y^op^athy の引き金と な る細 胞膜の病 態^{に つ}き検 討を加え考 察し た．

材 料お よ び方 法

工^． 動 物

雄ウ イ^スタ ^ー くW ista rl ラット く2 5 0^へ30 0 gl よ り 横 隔膜 筋 標 本を得， 下 記溶 掛^{こ て}湾流 し た．

工1 ^． 濯流 溶 液

リ^ンゲ^ル液 組 成は， 1 2 2 m M NaC l， 4．7m M K C l，

1 5．5 m M NaH C O3， l^．2 m M M gC 12， 1．2m M K H2P O4，2^．6 ^m M CaC 12，11．5 m M _glu c o s e，PH 7．4 と し た． Ca ^廿 を含ま な^いリンゲル液 く以下Ca ^什 フ リ ^ー 溶 液う は， 上記リ^ンゲ^ル液^から CaC l² を^のぞ き，

さ らに0^．1 m M E G T A を添 加し た． Ca．^什 フリ ^ー 溶液 中^の Ca ^骨 濃 度につ いて は， E G T A 末添 加 状 態で， 0^． c r e s ol⁻phthalein c o m ple x o n e くO C P Cl 法 に て 0^．O m gノd l を確 認， 従っ て E G T A O^{−1 m} M を添 加す るこ とによ り， 1 0−⁸M 程 度^に低 下す る と推 定し た^{1 引 用}． さ らに こ の Ca

什 フリ^ー 溶 汲， リ^ンゲル液^に種^{々 の}処理 を加え， 表1 に示 す順 序^で筋標 本を連流し た^． こ のう ち低Na^＋処理 を加え た溶 液^に は サッ カ ロ ^ー ス

くs u c r o s el 溶液を添 加して浸透圧 を調整 し た^． ま た^ニ

フェジ ピン くnifed ipin el は ^{1 m}gノ^ml の割 合で^エタ ノ^ー ル で溶 解 くエタ^{ノー ル}添 加は筋張 力^に影 響を与え な^{い こ}と を確 認^{1 7}り， リ^ンゲ^ル液^で最終 濃 度を 頼^M

と し た^1鋸． なお各港 流 液は， ガスく02こC O2^ニ95二5さ 負 荷， 37⁰C の ^一 定温 度下^{に お い}た．

HI． 電 気生 理学的 検 討

横 隔膜 筋 標 本 く乾 燥 重 量2 0 ^へ3 3 mgン を リ^ンゲル液

で濯 流 く表1 ， pe rfu sio nl l し^{つ つ}等 尺 性筋 張 力計^に

セッ ト， 最 大単 収縮 張力が得ら れ る静止時 張力と し，

白金 電 極 く筋全 長^にわ た り同 時 刺激のた め板電 極と し たl ^によ る最 大 刺激 く0^．5^m s e cl ^にて筋 直接 刺 激くd⁻ ツボ タ ラ リ^{ン 1}0 _メgノ^ml添 加^で筋 内神 経 刺 激^の可酸 性 除 却 し， 単 収縮 張 九 1 66 Hz 反 復 刺激^によ る強縮 張 力を記 録し た^． ひ き^つ づ き， 表^{1 の 2 句 7 の}漂 流 くpe rfu sio n 2_，31 を行^い経 過 中単 収 縮 張 力を記録， 強 縮 張 力^について は リンゲ^ル液 再漂 流 くp^{e r}fu sio n31 ¹5 分 後^のみ記録し た^． 諸処理^によ る張 力^の変 化は， 処理 前張 力 く1 00％う^の％で表 現し た^． な^お， 本 実 験^に要す る 3 0 分間 くpe rfu sio n 2^＋3l， 筋標 本を リ^ンゲ^ル液^の みで湾 流し た場合， そ^の前後^で張 力^の変 化は な^{い こ}と を確 認し たく表1， 表2−^{1う． ま た． 細 胞 内電極 法を}

用^い， 横 隔膜 筋^の直 接 刺 激によ る誘発筋 活動 電位^およ び静止膜 電 位を，処理前，Ca ^柵 フリ^ー 溶 液濯 流中，リ

m a xim um teta nic fo r c eニPt， m a Xim u m twitch fo r c ei Pv．

， p^{r O}babili_{t y} v e r s u si R S ， R iⁿ_g^{e r}

s olutio n ．

骨格 筋^のC^{a 什 パ}ラドック ス に関す る研 究

ンゲ^ル液 再濯 流 中で そ れ ぞ れ 記録し た．

1 V^． 筋 細胞内イ オ^ン濃度測 定 Ca

什 フリ ^ー 溶 液 濯流 後リンゲル経で再 濯 流し た群 く表¹p ²¹， ウ ア^パイ^ン くo u abainl添加Ca．^什 フリ ^ー 溶液 濯流 後^リンゲル鞭^で再 湾 流し た群 く表1−^{5う の} 筋細 胞 内^{Ca 什 ，M g 仲 ，Na＋，K＋}濃 度を リンゲル準^で

3 0分 間 湾 流し た対照筋 く表1 ⁻ い の そ れ と対比 し た^． さ ら^に， Ca ^什 フリ^ー 溶液1 5分 間潜 流 直後， リ^ン

1 1 7 ニう

ゲル液で の再 湾流^に移ら な^い時期で の筋細 胞 内イ オ^ン 変 化^{につ い て}，Ca

廿 フリ^ー 溶液 濯 流群 く表1 ⁻ 8う，

低Na^十処理 を加え た Ca ^廿 フ リ^ー 溶 液 濯 流 群 く表

1 −9 1，ウア パイ^ン添加Ca ^什 フリ ^ー溶液 濯 流群 く表 1−^{10ユ を}対照群 く表1 ⁻ い と比較し た． イ オン濃 度 測定^につい ては， まず濯 流 後^の筋標 本を直ちに0^．4 M サッカ^{ロ ー} ス ^．1 m M E G T A ^．10 m M ト リス緩 衝 液 くp王i 7^．4， 0 ^へ 2⁰cう^で洗 浄， つ い で濾紙で プ^ロ ット，

Table lI Su m m a ry of e xp^{e r}im e nt_algr o ups a nd s eq^{u e n c e o}f_pe rfu sio n s

Gr o up Pe rfu sio n l Pe rfu sio n 2 Pe rfu sio n 3

1^． R S

2． R S

3． R S

4． R S

5． R S

6． R S

7． R S

8． R S

9． R S

l O^． R S

R S Ca^刃イr e e s olutio n十E G T A

Ca甘イr e e s olutio n十E G

＋nifedipin eく⁴ _F^LMI Ca^什qfr e e，hi_gh M _g^{i ＋}く^{1 2} m M J

S Olutio n 十E G T A Ca^lしfr e e s olutio n十E G T A

＋o u abainく^1．7x IC^r．1 M I Ca＋しfr e e s olutio n十E G T A

Ca^龍一fr e e s olutio n十E G T A

＋F C C Pく0^．_{5 F}LMナ Ca^{l ＋−}fr e e s olutio n十E G T A

Ca^廿−fre e，lo w Na^＋く2 2．5 m M I

S Olutio n＋E G T A Ca^il−fr e e s olutio n ＋E G T A

＋o u abain く1^．7xlO仙⁴ MJ

R S，R inge r s olutio nニE G T A，eth_yle n egl_yc oトb isく⁻Jl⁻a mino ⁻ethyl ethe rl N，N^，−tetr a a C etic a cidニF C C P，C a rbo nylcya nide−^{P−triflu olo m etho x}y⁻ phe nylhydr a z o n eこ 密， Pe rfu sio n 3 w a s n otdo n e．

Tab^le 2^． C han ge S Of c o ntr a ctile pr ope rtie s afte r v a rio u s pe rfu sio n s of m u s cle

E認諾^{e ntal pt ％ Po ％} _訂^{Gr o up}孟

1． 10 0士 0 2． 6 0土 1 1 3． 6 5^士1 3 4． 65 士 12

5． 21 士8

6^． 33士 1 2

7^． 3^士3

ハ U

3 0

1 6 6 2 1 5

一＋

士

一十 士 士 士 士 0

ハ U

8 7 7 4 7

n U

6 5 6 2 3

1 く^{n こ} 5I

く^{n 二1 5}ナ

くn 二5う N．S．

く^{n こ 5}J N ．S．

く^{n 二 5}う 0．0 1 く^{n こ} 7ン 0^．01 く^{n こ} 3う 0^．01

S S O l Ol OI N N O．

0．

0^． Nu mbe r s of e xpe rim e ntal gr o up^s c o r r e sp^{o nd to tho s e in T able l− Fo r c e s e x}−

pr e s s ed a s pe r c e nt oftho s e r e c o rded prl O rtO the Ca^州−fr e e pe rfu sio n．Po， m a Xi⁻

m u m t_eta nic fo r c e三Pt_， m a Xim u m twitch fo r c ei Pv．Gr o up2．，Stat istic alc o mpa ri^．

S O n Ofthe m e a n s with Gr o up 2^． a ch ie v ed by Du n c a n^，s m ult i ple c o m pa ris o n te st，

Ea ch v alu e r epr e s e nts m e a n士S^．D^．．