328 金沢大学十全医学会雑誌 第77巻 第2号 328−334 (1968)
Lactobacillus bifidusレて関する研究
〔1〕 各種環境下における穎粒体存続と菌生存能との関係
金沢大学医学部微生物学講座(主任 西田尚紀教授)
高 村 保 徳
(昭和43年8月22日受付)
Lactobacillus bifidusは乳幼児のnormal flora の主たる成分を構成するものであることはひろく知ら 拠ているが最近Haenelら1)は成人のnormal flora としてもE.coliに匹適するか或はそれ以上に存在す ることを示している.L. bifidusは腸管に共存する 他のLactobaciUusと形態的生物性状の上で大きく 異るので最近の分類ではActinomycesに入れるか2)
或はBifidobacteriumとして3)1つのnew genus を作りここに入れる傾向がつよい.この菌群の形態的 特徴としてその名前の示す如き尾部が2つに分岐する 性質の他にその作るclub shapeはMycobacterium
Corynebacterium,或は Actinomycesのclub
shape と著しく似ている. Corynebacterium や Mycobacteriumのclub shape或はその先端の大 ぎな下下に関しての研究は数多く行われMudd 4)に よってひろく綜説されているがし,bifid飴のそれに 関しての報告は全くないといって良い.著者の同僚の 石田ら5)寺本6)は Cbrynebacterium の club shape或は所謂oval granuleについて検討しこれ がこの菌の生存にあっかる耐久形であることを主張し か.著者らはし.bifidusが保存しにくい菌である ことを考え,この菌の穎粒と生存力との問題について 検討したいと考え本実験を行った.実験方 法
1.分離培養法:本菌の分離培地としてPetuely 培地7)及び20%母乳寒天培地8)を使用した.生後 7日ないし5カ月の天然栄養児9例,混合栄養児3 例,入工栄養児2例,1年ないし3年の幼児3例の合 計17例より,なるべく新鮮な糞便を採取しプこれを適 当に稀釈して分離培地に塗布し,ピロガロール・炭酸 ソーダ法9)により嫌気性とし,370Cで48時間培養し
た.分離培地に発育した集落の内,その性状及びグラ ム染色並びにNeisser染色の所見より本四集落と思 われるものを選び,1.0%ブドウ糖・0.3%粉末酵母 エキス・0.1%寒天加brain heart iufusion培地
(pH=6.8)(以下B培地と省略)に穿刺培養した.以 後この培地にうえ継ぎ菌株を確保した.
II.同定法:本菌を同定する上に必要な生物学的性 状は未だ一定していないが,諸家の成績を要約した次 の如き基準に従った.1.偏性嫌気性である事,2.
多形性でL.bifidusの名にふさわしく尾部の分岐し た独特の菌形態を有し通常グラム染色陽性であるか,
時に顯学部を除く菌体蔀分が陰性に染ることがあり,
また菌体内に1ないし数ケのグラム強陽性の畑町を有 する事,3.胞子を作らず運動性のない事,4.カタ ラーゼ反応陰性で硝酸塩を還元しない事,4.につい ては成績記載10)の如く行った.糖分解用培地として 次の如き組成11)のものを使用した.
Proteose peptone(Difco)
NaCl
Sodium thio91ycollate 粉末寒天
各種糖液 0.2%B.T, B.
蒸溜水
pH=6.8 115。C 糖分解を行う場合,
2.09 0.59 0。19 0.19 1.09 1.2m1 100m1 15分丁子
予め菌を0.1%寒天加brain heart infusion培地に37。C 48時間穿刺培養してお き,発育の盛んな菌を直径約8mmの渦巻型自金耳 で採り,糖分解用培地の中に穿刺した.37。Cの艀卵 器に入れ10日間連日菌の発育状態と培地の色の変化を 観察した.
皿.菌の生存試験法:本実験に使用した菌株は Studies on Lσo o∂oo〃1%εβヴゴ4〃ε〔1〕Some Correla士ions betweell the Granule Formation in Different Environments and the Survival of this Species. Yasunori Takamura, Department of Bacteriology (Director;Prof. S. Nishida), School of Medici且e, Kanazawa University.
0.5%寒天加brain heart infusion培地(pH=6.8)
(以下BHI軟寒天培地と省略)に良く慣れ,良好な 発育を示したので,保存培地としてこれを使用した.
更にBHI軟寒天培地に,それぞれ血液10%,乾燥 ヘモグロビン0.5%,血球10%に加えたものを使用
した.これらの培地は中試験管に・約10m1つつ注入 し高層培地として用いた.B培地に37。C 48時間培 養した菌を上記白金耳ですくい上げ,直ちに各種軟寒 天高層培地の各々につき10本ずつそのなるべく中心部 に穿刺培養した.
37。C 36時間培養後ゴムキャップで密栓し0〜4。C及 び37。Cに保存した.
IV.菌の生死の判定法:各保存培地より毎月1回前 記白金耳で,なるべく培地底部より穿刺線に沿って菌 をすくい上げ,直ちにB培地に穿刺し37。C 48時間 培養した.菌の生えの悪い場合は72時聞迄培養し菌の 発育の有無を観察した.その結果・穿刺線に沿って一 面に菌の発育の認められるものを菌生存陽性と判定し た.尚一話語話した保存培地はそのまま放棄し次回の 使用に供しなかった.
V.・穎粒体存続の判定法: まず顯粒体の定義として は,寺本2)がCorynebacterium diphtheriaeのそ れに対してなした定義に従った.グラム強陽性に染ま るclub−shape或は「oval granule」で, vegetative phaseの菌体に見られる「顯粒部が上体を膨隆させ ていないもの」と区別した.一方また,穎粒体でもグ ラム染色性がvegetative cellより橿化したものは 除外した.このような際には穎粒は大きく膨化し,そ の限界が不鮮明となる傾向を示した. (図1,及び図 3参照.即ち,図3の(a)並びに図1の(b)はそれ ぞれグラム強陽性に染まる典型的なclub−shape並 びに「oval granule」を示し,図1の(c)はグラ ム染色性のすでに感化し膨化したものを示す。)
染色標本を鏡検し数=視野の菌合計約1000ケ中の訓諭 点数を計算した.尚同様な実験を2旧くりかえして計
3回の平均値即ち約1000ケの菌体中の穎粒体の数を求 めた,乱心体を全く認めないものを一,1〜9ケのも のを±,10〜99ケのものを+,100ケ以上のものを十 と定め,そのうち+以上のものを穎粒体存続陽性と判 定した.
W.写真:Nikon F型カメラ並びに同写真装置
(拡大力率1:2)を使用した.
表1 分離菌株の糖分解能成績
菌株名
糖
12345678123456789
■一−⊥−ニーユー1 1⊥ーユー一 一 一 ﹇ 一 一 ︻ 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一
LLLLLLLLLLLLLLLLL
︾同①げ一昌OωO十一
E十±十±十±十 十±十
十
×覧︒ωΦ
十十十十十十十十十
十
十十十
十
国下口Oω①
十十十一十 十︑十十十十±十
十± 閑鋤hh一昌OωO十十十十十十十十十十十十十十・十十十
Oεooooo十十十十十十十十十十十十十十十十
一U№nけOωΦ・
十十十十十十十十十十十十十十十十
+1+
ぎ巳凶
±
実 験 成 績 1.分離所見
Petuely培地でも母乳寒天培地でも大体同様の所見
を示した.即ち37。C 48時間嫌気性培養後の集落は直 径約0.5〜2.Ommの種々の大きさのものが見られた が,乳白色を呈し半球状で軟かく不透明で特に著しい 光沢はなかった.集落が小さい時はやや扁平で灰白色 であったが,集落が大きくなるに従い白磁色となり半 球状に盛上るのが認められた.それらの集落をグラム 染色し鏡検すると,通常グラム陽性の桿状ないしは菌 一三は菌側よりY字状に分岐した形態が認められ『た
(図2).また常にNeisser染色により所謂異染小体 を菌体内に1〜3ケ認めた.時にグラム陽性のclub−
shape或は「ovale granule」を示すものも認められた
(図3).また,天然栄養児由来のものにグラム染色で 一体は淡赤色で核様体だけが黒紫色に染まり菌端が細 くなった桿菌状の形態を示すものをしばしば認めた
(図4).
分離し得た菌株17株を選び生物学的検査を行った.
全株共胞子を作らず運動性は認められなかった.また カタラーゼ反応陰性で,硝酸塩を還元しなかった.B 培地培養4日目の培地のpHは,いつれも3.4〜3.8 であった.6〜7種の糖について行ったが糖分解の結 果は表1の如くであった.
以上の生物学的性状の結果並びに偏性嫌気性である こと,集落の性状及びグラム染色により独特の菌形態
330 高 村
を有する事より,全株共L.bifidusと同定した.こ の17株の菌を使用し以下の実験を行った.
皿.BHI軟寒天培地及び10%血液加BHI軟寒天
培地における保存温度の穎粒体存続並びに菌生存期間 に及ぼす影響
本実験に入る前に予備試験として,寒天濃度0%,
0.1%,0.5%,1.0%とした各BHI培地を作り,そ れぞれに菌を培養し25。Cに保存した.そして1カ 月後に穎粒体形成度並びに菌生存度を検討した結果,
0.5%にしたものが最も条件が良いように思われたの で,以下の実験には寒天濃度0.5%の培地を主とし
て使用した.
経験上血液を加えた培地の中では亭亭体の形成が良 い事が判っていたので,BHI軟寒天培地と共に10%
血液加BHI軟寒天培地を使用し両者を比較対照し
た.
さて各保存培地に発育盛んな種々の菌を37。C 36時 間培養後,37。C及び0〜4。Cに保存したが,菌株に よりその時すでにclub−shape或はoval granule をとるものが見られた.
結果は表2の如くであった.BHI軟寒天培地で 37。Cに保存したものは,1カ月以内に死滅しまた願 粒体の存続も平均0.4カ月と極めて悪かった.一方,
0〜4。Cに保存したものは平均2カ月生存し,二二体 の存続は平均0.6カ月であった.
これに比浸,10%血液加BHI軟寒天培地で37。C に保存したものは平均3,1カ月生存し,穎粒体の存続 は平均3.6カ月と比較的良好であった.また0〜4。C
に保存したものは平均2.4、カ月生存し,頬粒体の存続 は平均1.3カ月であった.
従って0〜4。Cに保存した場合,培地の血液の有無 にかかわらず穎粒体の存続と菌の生存期間との間に何 らの関係も見出されなかったが,血液加培地で37。C に保存したものが,その他の条件のものに比較して一 番生存力が強く,また穎粒体の存続と菌の生存期間と の関係も著しく密接である事が判明した.
皿.0.5%乾燥ヘモグロビン加BHI軟寒天培地にお ける保存温度の穎粒体存続並びに菌生存期間に及ぼす 影響
乾燥ヘモグロビンは容易に手に入るので,血液の代 りにこれを加えた培地で同様の実験を行った.結果は 表3の如くであった.
37。Cに保存したものは平均3.5カ月生存し,0〜
4。Cに保存したものは平均2.8カ月生存した.明ら かに37。Cでは0〜4。Cに比較して長く生存した.
また二丁体は37。Cに保存したものは平均3.7カ月 存続し,0〜4。Cに保存したものは平均1.5カ月存続
した.従ってここでも0〜4。Cでは穎粒体の存続と 菌の生存期間との間に何らの関係も見出されなかった が,37。Cの場合両者の関係は著しく密接である事が
判明した.
また,本実験と皿の実験との成績は,大体同様の 結果を得たので,血液の代りに乾燥ヘモグロビンでも 充分代用し得ると考えられた,
]V.種4の糖分解能を示す菌株を用いての0.5%乾 燥ヘモグロビン加BH:1軟寒天培地における雲粒体存
表2 BHI軟寒天培地(1)及び10%血液加BHI軟寒天培地(皿)における 保存温度の穎粒体存続並びに菌生存期間に及ぼす影響
噌⊥24FOρ078
一 一 一 一 一 一 一LエエLLLL
平 均
37。C
1
穎粒体
000ーム■11←0
0.4
生 存
00000︵UO
0
﹈1
顯粒体
ρ02噌⊥47・200
3.6
生 存
621460∩δ
3.1
0〜4。C 1
霊山体
0001占ームー占−
0.6
生 存
QUOJ9臼0δ−漏噌■喧■
2.0
:皿
山粒体
002229﹈−
1.3
生 存
4333212
2.4
*越中数字は雨粒体の存続並びに菌生存月数を示す.
続と菌生存期間との関係,
実験 2)3)に使用した菌株はすべてDhenert 分類12)のV群に属すると思われるものであった.そ こで更に種4の糖分解能を示す菌株(皿群,IV群と思 われるものを含む)を使用して,保存温度37。Cで 同様の実験を行った.培地は0.5%乾燥ヘモグロビ ン加BHI軟寒天培地を使用し,対照としてBHI軟 寒天培地を併用した.
結果は表4の如くであった.乾燥ヘモグロビン加培 地では対照と比較し,生存力は極めて強く平均3、8カ
表3 0.5%乾燥ヘモグロビン加BHI軟寒 天培地における保存温度の二二体存続 並びに菌生存期間に及ぼす影響
ーム9臼nδ∠て︻08一 一 一 一 一 一
LLLLLL
平 均
37。C
穎粒体
*
234274
3.7
生 存
2342ハ04
3.5
0〜4。C 穎粒体
0034凸20
1.5
生 存
422423
2.8
米表中数字は表2参照.
月生存した.また,穎粒体形成も良好で平均4カ月存 続した,従って本実験でも忌地体の存続と菌の生存期 間との関係は著しく密接である事が判明した.尚,本 実験では各菌株の群の種類と生存力との間に特別の関 係を認める事ができなかった.
V.10%血球加BHI軟寒天培地における保存温度の 顧粒体存続並びに菌生存期間に及ぼす影響.
結果は表5の如くであった.0〜4。Cに保存したも のは平均2.5カ月生存し,穎粒体は平均0.8カ月存 続した.また37。Cに保存したものは平均3.3カ月 生存し,穎粒体は平均3.3ヵ月存続した。本実験では 37。Cに保存の場合,穎粒体の存続と菌の生存期間と は全く一致した.
VI,血液ブイヨン培地における穎粒体存続と菌生存期 間との関係
本菌はある菌株を除き血液ブイヨン培地には極めて 発育が悪く,直接培養する事は困難だったので,予め 0。1%寒天加brain heart infusion培地に37。C 48 時間培養した菌を用意しておき,駒込ピペットで約 0.2mrづう血液ブイヨン中に注入し,ゴムキャップ で密接後直ちに25。Cに保存した.尚,本実験には
5株を使用し同様の実験を4回行った.
結果は表:6の如くであった.各回の穎粒体存続と菌 生存期間との一致率を見るに,それぞれ88%,91%,
89%,94%であり,ここでも両者の関係は著しく密 接である事が判明した.
表4 BHI軟寒天培地(1)及び0.5%
乾燥ヘモグロビン加BHI軟寒天培地 (皿)における頼粒体存続と菌生存 期間との関係(保存温度37。C)
考 察
L.bifidusの発育形式に関しては従来多くの報告13)
〜16)がある.例えば石原17)はwarm stage obser・
し−11 L−12 L−13 L−14 L−15 L−16 L−17 L−18 L−19
平 均
1 穎粒体
*
010100011
0,4
生 存
000000000
0
皿 亡霊体
365463234
4.0
生 存
354472234
3.8
表5 10%血球加BHI軟寒天培地に おける保存温度の穎粒体存続並びに 菌生存期間に及ぼす影響 保存 温度
菌株名 L−1 L−2 L−5 L−8
平 均
37。C
粗粒体 3*
3 4 3
3.3
生 存 3 3 4 3
3,3
0〜40C
顎口体 0 0 3 0
0.8
生 存 3 2 3 2
2.5
*表中数字は表2参照. *表中数字は表2参照.
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vationにより,初期の分岐糸状発育;期とこれに続く 桿状細菌発育期の極めて特異な二相生の発育形式を確 認した.このような発育過程における種々の形態は,
著者の実験の途中においてもしばしば観察されたが,
この事は本菌の発育形式はActinomycesのそれに非 常に類似しており,真性細菌とは異なるものを持って いるように思われた.
さて,L. bifidusの定型的な形態としてY字状に 分岐した桿菌様形態があげられるが,同一菌株でも上 述した如く発育の時期の相違や四境条件により,しば しば棍棒状や球形等の多彩な形態を示す.これらの形 態変化を起す原因として,培地の種類,pH,塩類の 影響,酸素分圧の差異,或はdegeneration等あげら
れる3)18)19)が,未だ明らかでない.
所で,著者が本研究でなした如く,L. bifidusの 陳旧化した培地でしばしば認められる顯粒状構造と菌 の生存能との関係について追求した報告は他に接して いない.これは本四が,栄養要求の極めて厳しい菌で あり,また偏性嫌気性である為,培地条件や酸素の浸 入等によりすみやかに死滅するので,一定の二二下に 中期月も保存し,逐次形態的な変化を観察するのが困 i平な事も一因と思われた.ともあれ著者の研究は,前 に寺本がC.diphtheriaeで証明した如く,本丁の 丁丁培地で最:も現われ易い「oval granule」(club−
s坤peの尾部はグラム陰性化して先端膨隆部のみ残 る)即ち一粒体が,この菌の生存にあずかる代謝冬眠 ともいうべき状態の一種のrest formである事を暗 示した.尚,著者ぶ使用した培地で本丁を長く保存し た場合,種々の大きさの穎粒体が認められたが,大き く膨隆したも.のは大きさを増すにつれグラム染色性が 悪くなり,ついに陰性化し崩壊していくのが認められ
たので,菌の生存にあっかるのはグラム強陽性の比較 時小さなものでないかと推察された.しかしながら,
更に恥しい細胞化学的検索が必要と思われた.これは 後報で更に述べたい.
結 論
1.L. bifidusは10%血液加BHI軟寒天培地 において,370Cに保存のものは0〜4。Cに保存のも のよりも明らかに生存期間が長かった.またタ0.5%
乾燥ヘモグロビン加BHI軟寒天培地でも同様の結果
を示した.
2.各種培地において且つ頼粒体形成能力の異なる 菌株を用いての実験の結果,L. bifidusの糸粒体存 続は菌の生存期間と極めて密接な関係がある事が判明
した.
稿を終るにあたり,御指導と御校閲下さいました西田尚紀教授 に衷心より感謝申し上げます.
文 献
1)Haene1, H., K:6hler, F.,:Mertsc11ヅH,&
Pardeman皿, Ch.:Zb1. Bkt., Abt.1,つrig.,
177,41 (1940). 2) Rosebury, T.= Biacteria indigenous to man, in R, Dubos ed. Bacteria
&mycotic infections of man 4 th ed. p.326 J.B. Lippincott Co., Philadelphia.(1965).
3)Pr6vot A.&Fredette. V.3Manual for the classification and determination of the anaerobic Bacteria l st ed. p.361 Lea&Febi。
ger Co., Philadelphia.(1965). 4)
Mudd, S.:Annual Rev..Microbiol.8,1
表6 血液ブイヨン培地における穎粒体存続と菌生存期間との関係(保存温度25。C)
実験回数 菌株名
L−1 L−2 L−3 L−4 L−8
平 均
第1回
越智体
6*
3 5 4 6
4.8
生 存 5 3 4 3 6
4.2
第2回
穎粒体
6 6 3 3 4
4.4
生 存 6 6 2 3 3
4.0
第3回
穎粒体
5 4 3 4 2
3.6
生 存 5 3 2 4 2
3.2
第4回
穎粒体
5 4 2 4 2
3,4
生 存 4 4 2 4 2
3.2
*表中数字は表2参照.←
(1954). 5)石田宗治・寺本友一・西田尚紀3 医学と生物学,63,146(1962). 6)
寺本友一3十全医会誌,69,55(1963).
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Flanders, Tl., Tomare11i, R. M.&Gy6rgy,
P.: J.Bact.,60,681(1950). 19)
本間道・太田淳・新井四郎=小児科臨床,
13, 1274 (1960).
Abstract
Lαo o∂σ6〃1πs∂ヴゴ4%scultured in braill heart ir面sioll half fhlid medium colltai・
ning 10%blood survived definitely longer lat 37。C than at O to 4。C. The same result was obtained also when the blood was replaced by O.5%霞haemoglobin. 一 Furthermore,.L.ゐヴ∫4%3 strains differing ill the ability to form granules we■e examined as for surval and it was demonstrated that the granule formation was closely ass ⊃ciated with the ability to survive.
謝
高 村図1 Lbifidus, L−6株,×2500,
10%血液加工BHI軟寒天培地,37。 C 5カ月培 養,グラム染色.
b=oval granule
c.グラム陽性のうすれた膨隆した穎粒
顯、
図2 Lbifidus, L−13株,×2500,
20%母乳寒天培地,37。C48時間培養,グラム染
色.
図3 L.bifidus, L−6株,×2500,
20%母乳寒天培地,37。C48時問培養,グラム染
色.
a=oval granule
鵜
轟嘩縫 翻.義義螺
図4 Lbifidus, L−12株, x2500,
20%母乳寒天培地,370C48時間培養,グラム染
色.
撫論
難
彊㍉声