Amphiregulin suppresses epithelial cellapoptosis in lipopolysaccharide-induced lunginjury in mice

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Amphiregulin suppresses epithelial cell

apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice

緒方, 彩子

https://doi.org/10.15017/1831411

出版情報：九州大学, 2017, 博士（医学）, 論文博士 バージョン：

権利関係：© 2017 The Authors. Published by Elsevier Inc. This is an open access article under the CC BY license

氏 名 ： 緒 方 彩 子

論 文 名 ： Amphiregulin suppresses epithelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice

（ Amphiregulin は LPS 肺 傷 害 マ ウ ス に お い て 肺 胞 上 皮 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 す る ）

区 分 ： 乙

論 文 内 容 の 要 旨

背 景 ： ARDS は Ashbaugh ら に よ っ て 1967 年 に は じ め て 提 唱 さ れ た 疾 患 で 、 好 中 球 性 炎 症 と 上 皮 傷 害 に よ っ て 特 徴 づ け ら れ る 。 ARDS の 一 般 的 な 原 因 と し て は 肺 炎 、 胃 酸 誤 嚥 、 敗 血 症 、 重 症 外 傷 等 が あ り 、 そ の リ ス ク や メ カ ニ ズ ム に つ い て も 検 討 さ れ て い る が 依 然 と し て 致 死 率 は 高 い ま ま で あ る 。 LP S は 肺 傷 害 や ARDS に 強 く 関 与 し て お り 、 マ ウ ス へ の 投 与 に よ り 好 中 球 集 簇 や ア ポ ト ー シ ス を 起 こ す こ と が 報 告 さ れ て い る 。 EGF famil y の 一 つ で あ る Amphiregulin は 細 胞 増 殖 に 寄 与 し て お り 、COPD、喘 息 患 者 の 損 傷 を 受 け た 肺 組 織 や 人 工 呼 吸 関 連 肺 傷 害 マ ウ ス モ デ ル の 肺 胞 上 皮 に も 発 現 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る 。ま た 近 年 Amphiregulin は LPS に よ る 肺 傷 害 を 抑 制 す る こ と が 報 告 さ れ て い る が 、 そ の メ カ ニ ズ ム に つ い て は 報 告 さ れ て い な い 。 本 研 究 に お い て 我 々 は LP S 肺 傷 害 マ ウ ス の ア ポ ト ー シ ス に お け る Amphiregulin の 役 割 を 検 討 し た 。

方 法 ： C57BL/6 マ ウ ス 、 雌 、 7 週 令 に 対 し て LPS0.5 mg/kg を 経 鼻 投 与 し 急 性 肺 傷 害 を 起 こ し た 。 こ の マ ウ ス に 対 し リ コ ン ビ ナ ン ト Amphiregulin7.5 µ g/bod y も し く は PBS を 、 LPS を 投 与 す る 6 時 間 前 、0.5 時 間 前 と 3 時 間 後 に 腹 腔 内 投 与 を 行 っ た 。 LPS 投 与 6 、 24 時 間 後 に こ れ ら の マ ウ ス に 対 し 組 織 学 的 検 査 、 免 疫 染 色 、 気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 、 Terminal deox ynucleotid yl transferase -mediated dUTP nick end label (TUNEL) 染 色 を 施 行 し た 。ま た マ ウ ス 肺 胞 上 皮 細 胞 の cell line で あ る LA-4 細 胞 に Amphiregulin 0、 10 、 100 nM を 3 時 間 投 与 し た の ち PBS で 洗 浄 し 、 LPS 0 、 50 µ g/ml を 投 与 し た 。 24 時 間 後 に 細 胞 を 回 収 し フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 、 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ を 行 い 、 Amphiregulin の ア ポ ト ー シ ス や そ の 経 路 に お け る 効 果 を 検 討 し た 。

結 果 ： LPS 肺 傷 害 マ ウ ス の 肺 組 織 に お い て は 炎 症 細 胞 浸 潤 、 浮 腫 、 肺 胞 出 血 が 見 ら れ た が 、 こ れ ら の 変 化 は Amphiregulin 投 与 に よ っ て 軽 減 さ れ た (Fig.

1A, B) 。ま た LPS を 投 与 さ れ た マ ウ ス の 肺 胞 洗 浄 液 中 の 総 細 胞 数 、好 中 球 数 、

肺 血 管 透 過 性 亢 進 を 示 す 蛋 白 濃 度 は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 比 較 し て 有 意 に 上

昇 し 、 Amphiregulin 投 与 に よ っ て 有 意 に 抑 制 さ れ た (Fig. 1C, D) 。 肺 胞 洗 浄 液

中 の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン (IL-1β 、IL-6、TNF α) や ケ モ カ イ ン (CXCL-1、CC L2)

は LPS 投 与 に よ っ て 有 意 に 上 昇 し 、 Amphiregulin 投 与 に よ っ て IL-6、 CC L2

は 軽 度 抑 制 さ れ た も の の 有 意 差 は 見 ら れ な か っ た 。 6 、 24 時 間 後 に LPS 投 与

Figure 1.

Amphiregulin は LPS に よ る マ ウ ス の 急 性 肺 傷 害 を 軽 減 し た

Figure 2. A mphiregulinは LP S に よ る LA-4 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 す る

マ ウ ス で は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 比 較 し て ICAM-1 が 有 意 に 上 昇 し 、 LPS 投 与 24 時 間 後 に は Amphiregulin 投 与 に よ っ て 有 意 に 抑 制 さ れ た 。 TUNEL 染 色 で は 、 LPS 投 与 に よ っ て 上 皮 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス が 見 ら れ る が 、 Amphiregulin 投 与 に よ っ て 有 意 に ア ポ ト ー シ ス は 抑 制 さ れ た 。 In vitro に お い て 、 LPS 投 与 24 時 間 後 に LA-4 細 胞 の 12. 39 ± 0.58% に ア ポ ト ー シ ス が 見 ら れ た が 、 LPS 投 与 前 に Amphiregulin 100 nM を 投 与 す る と 有 意 に 抑 制 さ れ た (Fig. 2A) 。 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 で は 、 Amphiregulin 投 与 に よ っ て カ ス パ ー ゼ 11 に 変 化 は な か っ た も の の 活 性 型 カ ス パ ー ゼ 8、 3 は 有 意 に 抑 制 し て い た (Fig. 2 B,C)。

考 察 ： Amphiregulin は 肝 障 害 や ブ レ オ マ イ シ ン 肺 傷 害 の 抑 制 に お い て 重 要 な 役 割 を 担 う 事 は 報 告 さ れ て い る 。今 回 我 々 は 、 LPS マ ウ ス 肺 傷 害 に お い て Amphiregulin は 肺 胞 上 皮 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 し 、 In vitro に お い て も カ ス パ ー ゼ 8 の 活 性 を 阻 害 す る こ と で ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 す る こ と を 示 し た 。し か し 炎 症 と ア ポ ト ー シ ス の い ず れ も 調 整 し て い る カ ス パ ー ゼ 11 に つ い て は Amphiregulin 投 与 に よ っ て 抑 制 さ れ て い な か っ た こ と か ら Amphiregulin は LPS 肺 傷 害 の 上 皮 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス に お い て 中 心 的 な 役 割 を 果 た し て は い る が 完 全 で は な い こ と が 考 え ら れ た 。ま た 肺 胞 洗 浄 液 中 の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン (IL-1 β 、 IL-6 、 TNFα ) や ケ モ カ イ ン (CXC L-1 、 CC L2) を 有 意 に 抑 制 し な か っ た が 、 過 去 の 報 告 と の LPS の 投 与 方 法 の 違 い の た め と 考 え ら れ た 。 LPS 肺 傷 害

マ ウ ス に お い て NF-κB を 介 し て 肺 組 織 中 の ICAM-1 の mRNA が 増 加 し 、結 果 と し て 好 中 球 の 集 簇 が お こ る と の 報 告 が あ る が 、 今 回 我 々 は Amphiregulin 投 与 に よ っ て 有 意 に ICAM-1 が 抑 制 さ れ る こ と を 報 告 し た 。 し か し そ の 機 序 に つ い て は 不 明 で あ り 、 更 な る 研 究 が 必 要 と 考 え ら れ た 。

結 語 ： 本 研 究 結 果 よ り 、 Amphiregulin は LPS に よ る 肺 傷 害 に お い て 肺 胞 上

皮 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 し 、 そ の 治 療 手 段 に な り 得 る と 考 え ら れ た 。