Inhibition of ABCG2 enhances chemo-sensitivity of murine glioma stem cell-like cells to temozolomide and reduces spheroid-forming capability
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(2) 論文内容の要旨. 佃的】. 悪性グリオーマに対する治療はテモゾロミドの登場により成績向上が得られたが、画期的な生命予後改. 善効果は乏しく、未だ予後不良疾患である。悪性グリオーマが難治性である理由のーつとして、多剤薬剤 耐性能が挙げられる。この多剤薬剤耐性能にっいては腫傷幹細胞の関与が指摘されており、また細胞の薬 剤耐性能獲得には薬剤排出分子である ABC 輸送体が重要な働きをしている。そこで、我々はグリオーマ. 幹細胞においても ABC 輸送体が薬剤耐性能獲得に関与しており、これらを阻害することでグリオーマ幹 細胞の薬剤感受性が向上すると推測した。 【方法】. マウス脳内に自発型グリオーマを発生させ、その腫傷組織からグリオーマ幹細胞を誘導した。これら の細胞が腫傷幹細胞の性質を有することを、inviv0 頭蓋内腫傷細胞移植および nestin/CD133 等のグリ オーマ幹細胞マーカーの発現解析を用いて確認した。これらの幹細胞における各種ABC輸送体発現量 を定量PCR を用いて測定し、invitr0 にてテモゾロミド感受性を評価した。同時に幹細胞の指標である. Sidepopulation 解析もあわせて行った。次に SiRNA を用いてグリオーマ幹細胞に発現する ABC輸送体 を抑制し、テモゾロミド感受性の変化を再評価した。 【結果】. 自発型マウスグリオーマ組織より、幹細胞培養条件下にスフェロイドを形成する細胞集団を単離した0 これらの細胞は同系マウス頭蓋内に移植することで腫傷形成を来たし、さらにグリオーマ幹細胞の主たる マーカーである nestin/CD133 を高発現したため、グリオーマ幹細胞の特徴を満たした0 またこれらのス フェロイド形成細胞は接着型腫傷細胞に比ベ、 ABC凱、 ABCCI、 ABCG2 等の各種ABC輸送体遺伝子 を高発現してぃた。この所見と一致して、スフェロイド形成細胞は接着型腫傷細胞に比ベてテモゾロミド. 耐性であり、更にSideP叩Ulation解析による薬剤排出能も亢進していた。次にABCG2 を SiRNA を用い て発現抑制したところ、スフェロイド形成細胞のテモゾロミド感受性亢進と腫傷形成能低下を認めた0 【考察】. 悪性グリオーマの薬剤耐性能にっいて、グリオーマ幹細胞に高発現する ABC輸送体の関与か示唆され、 更にABCG2を阻害することによって、テモゾロミド感受性亢進および腫傷形成能低下が得られた0 これ らの結果より、グリオーマ幹細胞に対するABCG2を標的とした新規化学療法の開発が治療成績改善に貢 献する可能性が考えられた。 【結論】. 本研究により、悪性グリオーマの薬剤耐性能にはグリオーマ幹細胞に高発現する ABC 輸送体、特に ABCG2が強く関与しており、これを阻害することによってテモゾロミド感受性亢進および腫傷形成能低 下が得られることが判明した。. -22-.
(3) ノえ、. 年. 2014年12月. 月. 日. 出版物の種類及び名称. 日. 公表予定. ノ气、. 表. 出版物名 Acta Medica Kinki university. 容. 博士論文の印刷公表. 表. V01.39 NO.2. 内. 2014年12月日掲載予定 ノ＼. 文. -23-.
(4) 文. 査. の. ^. 本研究の要旨. 【目的】、_、、、、、、、、、、、. 悪性グリオーマは近年、経ロアルキル化剤のテモゾロミドが標準的化学療法薬剤となり、治療成. 霜が向上したが、今な給予後不良である。テモゾロミドの抗腫傷効果は腫傷に発現するMGMT遺伝 子の発現に依存十るが、それ以外にも、;台療中の多面1薬剤耐性の発現が影響することが明らかと. なってぃる。とくに、長近、腫癌細胞b中でも腫傷幹細胞が腫傷の多剤薬剤耐性能において重要 と示唆されてぃる。一般に腫癌細胞の多剤薬剤耐性能獲得においては多剤薬剤排出分子である 朋C 輸送体タンパ》が重要である。そこで我々は悪性グリオーマ動物モデルを用いて腫傷幹細胞 を単離し、テモゾロミド投与によ、ABC 輸送体タンパクの誘導を検討した。さらに、朋C 輸送体. タンパクを阻害することで腫傷幹細胞の薬剤感受性を向上させうるかどう%、を検討Lた。. 【方法】、_、、,,.、 自発型グリオーマを発生するマウスモデルを用い、その腫傷組織からグリオーマ幹ホ醐包を誘導し た。これらの細胞が腫癌幹細胞の性質を有することを、in ⅦW 頭蓋内腫癌細胞移植および. nestin/CD133 等のグリオーマ幹細胞マーカー発現解析等により確認した。次にこれらの幹細胞. における各種ABC輸送体発現量を RT-qpcR 等を用いて測定した。次に inV北r0 にてテモゾロミ. ド感受性を評価した。その際、幹ネ醐包の指標である SideP四Ulation 解析もあわせて行った。. さぢに、si則Aを用いてグゾ矛ーマ幹細胞に発現する ABC輸送体発現を抑制し、テモゾロミド感. 受性の変化を再評価した。. 【結果】、,、,,ソ. 自発型マウスグリオーマ組織より、幹細胞培養条件下にスフェロイドを形成する細胞集団を単離. した。それらの細胞は同系マウス頭蓋内に移植すると腫傷形成を来たし、すべてのマウスを腫傷 死さ、た。単離した細胞条団は、腫薄幹細胞の主たるマーカーである nestin および CD133 を 強発現し、グリオーマ幹細胞の特徴をほぽ全て満たしてぃた。またこれらのスフェロイド形成細 胞は接着型腫癌細胞に比ベ、 ABCBI、 ABCCI、 ABCG2 等の各種朋C輸送体サブタイプ遺伝子を強発. 現してぃた。スフェロイド形成細胞は接着型腫癌細胞に比ベ、テモゾロミド耐性であり、さらに. Sidep。PU仏ti飢解析による薬剤排出能も高く、ABC 輸送体造伝子発現と薬剤排出能とb相関が. 認められた。これらサブタイプのうち、薬剤排出能ヘの寄与度が高いとされる朋CG2 を Si餓A. を用いて発現抑制したところ、スフェロイド形成細胞のテモゾロミド感受性は増強し、同時に腫. 傷形成能の低下もみられた。. 【考察】_、、、,_、、. 本研究により、悪性グリオーマにテモゾロミドを投与すると、グリオーマ幹細胞にABC 輸送体が. 発現し、薬剤耐怪を獲得することが示された。特にABCG2 を阻害することでテモゾロミド感受性. 増強、ならびに、腫傷形成能低下をもたらすモとができた。以星より、グリオーマに対するテモ ゾロミド治療に給いて、グリオーマ幹細胞の朋C 輸送体を稼的とした新規補助療法が薬剤耐性を 克服する可能性が示唆された。 審査結果の要旨. 本研究は難治性の悪性グリオーマに対して、標準的化学療法薬剤であるテモゾロミドの薬斉而ナ性. の解明と克服を目希したものである。マウスグリオーマモデルから誘導したグリオーマ幹細胞を. 用い、薬剤抵抗性とABC輸送体発現の相関を証明した。更にSiRNAを用いて朋CG2の発現抑制を行. い、腫傷細胞の形成能低下を得た。この結果は朋CG2阻害剤による新たな補助療法の可能性を示. 唆〒るものであり、ニューロオンコロジー分野において、独創的な研究と考えられた。 最終試験の結果. 学位申請者は審査委員から複数の口頭試問を受けたが、個々の質問に対して適切に回答し、合格 と判定した。 学位授与の可否. 本研究は学位授与に値すると判定した。. -24-.
(5) 博・論博. 博士判立論文最終試験結果の報告書 平成 27年1月29日. 「〕ト';、 j＼アト＼ 1. 風. 審査委 副主査. 知. ︹. 1. 員. 副主査. ノ. 、、 K. 主査. 泛、鳥.11^. 副査. 气. ^. ⑳. 吉岡宏真. 学位申請者氏名. Inhibition of ABCG2 enhances chemo-sensitivity Of murine glioma stem ce11-1ike ce11S to. 論. 文題目. temoz010mide and reduces spheroid-fotmin宮 Capability. (グリオーマ幹細胞における薬剤排出分子朋CG2 の 阻害によるテモゾロミド感受性亢進および腫傷形成 能低下に関する研究). 要旨. 本研究は難治性の悪性グリオーマに対して、標準的化学療法薬剤であるテモゾロミドの 薬剤耐性の解明と克服を目指したものである。マウスグリオーマモデルから誘導したグリ オーマ幹細胞を用い、薬剤抵抗性とABC輸送体発現の相関を証明した。更にSiRNAを用いて ABCG2 を阻害することでテモゾロミド感受性増強、ならびに、腫傷形成能低下をもたらす ことを確認した。本研究は、グリオーマに対するテモゾロミド治療において、朋CG2阻害剤. による新たな禰助療法の可能性を示唆するものであり、ニューロオンコロジー分野におい 、独創的な研究と考えられた。. 公聴会において、審査委員より、本研究内容に関する複数の口頭試問も行ったが、学位申. 請客は適切な回蓉を行い、本学莅論文が論文提出者の研究成果一あるととを権認Lた。以 上にて、審査委員は、最桑試験は合格と判定し、本研究が学位授与に値すると判断し元。. -25-.
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