東北医科薬科大学
審査学位論文（博士）要旨
氏名（本籍） ｻﾄｳ ﾄｼﾕｷ
佐 藤 稔 之（秋田県）
学位の種類 博士（薬学）
学位記番号 博薬学第6号
学位授与の日付 平成30年3月9日
学位授与の要件 学位規則第４条１項該当
学位論文題名 カエル卵由来シアル酸結合性レクチンの悪性中皮腫治療戦 略への応用
論文審査委員
主査 教 授 顧 建 国
副査 教 授 原 明 義
副査 教 授 細 野 雅 祐
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カ エ ル 卵 由 来 シ ア ル 酸 結 合 性 レ ク チ ン の 悪 性 中 皮 腫 治 療 戦 略 へ の 応 用
東 北 医 科 薬 科 大 学 大 学 院 薬 学 研 究 科 佐 藤 稔 之
悪 性 中 皮 腫 は ， 中 皮 細 胞 由 来 の 高 悪 性 度 が ん で あ り ， 罹 患 者 の 約 70～ 80％ に お い て ， ア ス ベ ス ト 暴 露 歴 が 報 告 さ れ て い る ． ア ス ベ ス ト 暴 露 に よ り ど の よ う に が ん 化 が 起 こ る の か は 不 明 だ が ， ア ス ベ ス ト 暴 露 か ら 悪 性 中 皮 腫 の 発 症 ま で 平 均 20～30 年 か か る と い わ れ て お り ， 今 後 ， 国 内 外 で 悪 性 中 皮 腫 患 者 数 が 増 加 す る こ と が 予 測 さ れ て い る ． し か し ， 現 在 の と こ ろ の 治 療 選 択 肢 は 限 ら れ て お り ， 化 学 療 法 で は 葉 酸 代 謝 拮 抗 薬 pemetrexed と ， 白 金 製 剤 で あ る cisplatin の 併 用 レ ジ メ ン が ， 米 国 で は 2004 年 2 月 に ， 日 本 で は 2007 年 1 月 に そ れ ぞ れ 標 準 レ ジ メ ン と し て 承 認 さ れ て い る ． こ の 併 用 療 法 に よ り ， 奏 効 率 ， 無 増 悪 生 存 期 間 ， 全 生 存 期 間 ， お よ び QOL を 改 善 す る こ と が 報 告 さ れ て い る が ， 患 者 の ほ と ん ど で 治 療 後 1 年 以 内 に が ん の 増 悪 あ る い は 再 発 が み ら れ る こ と ， 薬 剤 耐 性 が 生 じ る こ と が 明 ら か に な っ て い る こ と か ら ， 新 た な 治 療 薬 の 開 発 が 期 待 さ れ て い る ．
ウ シ ガ エ ル (Rana catesbeiana) 卵 由 来 シ ア ル 酸 結 合 性 レ ク チ ン (sialic acid binding lectin，cSBL) は ， シ ア ル 酸 を 含 む 複 合 糖 質 と 結 合 す る レ ク チ ン 活 性 ， お よ び ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ オ チ ド を 認 識 し 分 解 す る リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ (RNase) 活 性 を 併 せ 持 つ こ と で 抗 腫 瘍 活 性 を 発 揮 す る 多 機 能 性 タ ン パ ク 質 で あ る ． こ の レ ク チ ン は ， 多 く の が ん 細 胞 に 対 し て 抗 腫 瘍 活 性 が 認 め ら れ て い る 一 方 で ， 正 常 細 胞 に 対 し て は ほ と ん ど 細 胞 毒 性 を 示 さ ず ， 非 常 に 高 い が ん 細 胞 選 択 性 を 持 つ こ と を 報 告 し て き た ． 今 日 汎 用 さ れ て い る DNA 障 害 性 薬 剤 と 比 較 し ，RNase の 抗 腫 瘍 作 用 は 遺 伝 毒 性 を 示 さ な い と 考 え ら れ て お り ，cSBL は RNA を タ ー ゲ ッ ト と し た 新 規 作 用 機 序 に よ る 抗 が ん 剤 と し て 期 待 さ れ る ．
第 一 章 で は ，in vitro に お け る 数 種 の 悪 性 中 皮 腫 細 胞 株 (H28，H2452，
MESO-1，MESO-4， お よ び MSTO) へ の cSBL の 有 効 性 ， 既 存 治 療 薬 と の 併 用 効 果 な ら び に そ の 作 用 機 序 に つ い て 解 析 を 行 っ た ． そ の 結 果 ，cSBL は 最 大 濃 度 (20 µM) に お い て も ， 正 常 細 胞 (MeT5A) の 生 存 率 を 40% 程 度
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し か 低 下 さ せ ず ， 一 方 で ，pemetrexed は 10 nM で 50%，cisplatin は 10 µM で 70% 低 下 さ せ た こ と か ら ，cSBL が 高 い が ん 細 胞 選 択 性 を 持 つ こ と が 示 さ れ た ． さ ら に が ん 細 胞 選 択 性 の 指 標 と し て ， 相 対 的 感 受 性 (RS， が ん 細 胞 で の IC50 値 と MeT5A で の IC5 0 値 の 比) を 算 出 し た ．RS>1 あ る い は <1 の と き ， が ん 細 胞 選 択 性 が そ れ ぞ れ 高 い ， あ る い は 低 い こ と を 示 す ．H2452，MESO-1， お よ び MESO-4 は pemetrexed (RS: 0.37，0.06， お よ び 0.06) に 対 し ， ま た H28，H2452， お よ び MESO-1 は cisplatin (RS:
0.66，0.24， お よ び 0.26) に 対 し ， そ れ ぞ れ 抵 抗 性 を 示 し た が ， こ れ ら の 細 胞 株 は ，cSBL に 対 し て 高 い 感 受 性 を 示 し た ．H28 に お け る 2 剤 併 用 効 果 に つ い て 検 討 し た と こ ろ ，pemetrexed + cSBL が 既 存 レ ジ メ ン と 同 等 以 上 の 抗 腫 瘍 作 用 お よ び 相 乗 効 果 を 示 し た ． 併 用 時 の 抗 腫 瘍 メ カ ニ ズ ム の 検 討 で は ， ア ポ ト ー シ ス マ ー カ ー の 増 減 に 有 意 差 は な く ， 一 方 で pemetrexed + cSBL で は 他 の 併 用 と 比 較 す る と 死 細 胞 数 が 顕 著 に 増 加 す る こ と が 明 ら か に な っ た ． そ こ で 細 胞 周 期 解 析 を 行 っ た と こ ろ ，pemetrexed お よ び cisplatin は 細 胞 周 期 を 停 止 さ せ ， 細 胞 増 殖 抑 制 的 に 作 用 す る の に 対 し ，cSBL は ア ポ ト ー シ ス に よ る 細 胞 死 を 誘 導 し て い る こ と が 示 さ れ た ． 併 用 時 に は こ の 作 用 は そ れ ぞ れ 独 立 し て 奏 効 し ， ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ る 解 析 か ら も pemetrexed の 持 つ cyclin A の 持 続 的 活 性 化 に よ る 細 胞 周 期 停 止 作 用 と cSBL の 持 つ caspase-3 の 活 性 化 を 介 し た ア ポ ト ー シ ス の 誘 導 作 用 が 協 働 し て い る こ と を 示 す 結 果 が 得 ら れ た ．
第 二 章 で は ， 異 種 移 植 可 能 な 2 種 の 悪 性 中 皮 腫 細 胞 株 (H2452，MSTO) を 用 い て 異 種 移 植 モ デ ル マ ウ ス を 作 成 し ，in vivo に お け る cSBL の 抗 腫 瘍 効 果 の 検 討 を 試 み た ． ま ず ，in vitro に お け る 抗 腫 瘍 メ カ ニ ズ ム 解 析 で は ， す で に cSBL の 作 用 機 序 が 明 ら か に な っ て い る H28 と 同 様 に ，caspase- 9，-8，-3 が 順 次 活 性 化 さ れ ， ア ポ ト ー シ ス が 内 在 性 経 路 に よ り 誘 導 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ た ．In vivo に お け る cSBL の 効 果 検 討 で は ， 通 常 動 物 実 験 に 用 い ら れ る 濃 度 の pemetrexed と 比 較 す る と ，cSBL 処 理 群 で よ り 早 期 に 腫 瘍 の 増 殖 抑 制 が 引 き 起 こ さ れ た (H2452 移 植 マ ウ ス ：pemetrexed，47 日 目 ；cSBL，36 日 目 ，MSTO 移 植 マ ウ ス ：pemetrexed， 有 意 な 変 化 な し ； cSBL，29 日 目)． 同 時 に 腫 瘍 増 殖 抑 制 が 観 察 さ れ る 濃 度 に お い て マ ウ ス の 有 意 な 体 重 変 化 は 見 ら れ ず ， 生 体 へ の 影 響 (有 害 作 用) は 小 さ い こ と が 示 唆
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さ れ た ． さ ら に ， こ れ ら の 細 胞 に お け る pemetrexed あ る い は cisplatin と の 相 乗 性 を 検 討 し た と こ ろ ， 第 一 章 と 同 様 に pemetrexed + cSBL の 併 用 が 強 い 抗 腫 瘍 作 用 お よ び 高 い 相 乗 効 果 な ら び に 薬 剤 用 量 減 少 効 果 (Dose Reduction Index，DRI) を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た ．
第 三 章 で は ， 悪 性 中 皮 腫 に 対 す る 効 果 が 報 告 さ れ て い る 腫 瘍 壊 死 因 子 関 連 ア ポ ト ー シ ス 誘 発 リ ガ ン ド (TRAIL) お よ び 上 皮 成 長 因 子 受 容 体 チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 阻 害 薬 (EGFR-TKIs) と ，cSBL と の 併 用 効 果 の 検 討 な ら び に 治 療 障 壁 の 一 つ と な っ て い る pemetrexed 耐 性 株 へ の 各 薬 剤 の 効 果 を 比 較 し た ． H28 お よ び H2452 に 対 す る 効 果 を 検 討 し た 結 果 ，pemetrexed お よ び
cisplatin と 比 較 し ，cSBL，TRAIL， お よ び EGFR-TKIs は い ず れ も 悪 性 中 皮 腫 細 胞 に 対 し て 高 い 選 択 性 を 示 し た ． ま た ，cSBL お よ び EGFR-TKIs は ， 細 胞 株 の 違 い に よ る 増 殖 抑 制 効 果 に ほ と ん ど 差 が な い こ と が 明 ら か と な っ た ．Pemetrexed 耐 性 株 に 対 し て 交 叉 耐 性 (H2452-PR に 対 す る cisplatin，
cSBL な ど) が 認 め ら れ た が ，H28-PR に 対 す る cisplatin お よ び cSBL， あ る い は H2452-PR に 対 す る TRAIL な ど ， 耐 性 株 に お い て よ り 強 い 細 胞 増 殖 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た ケ ー ス も あ り ， 耐 性 克 服 へ の 糸 口 が つ か め る 知 見 が 得 ら れ た ． ま た 併 用 効 果 の 検 討 で は ， 耐 性 細 胞 に お い て pemetrexed + cSBL が 既 存 レ ジ メ ン と 比 較 し pemetrexed の DRI が 2 倍 以 上 高 く ， 耐 性 細 胞 株 に 対 し て も 有 効 な レ ジ メ ン と な る 可 能 性 が 示 さ れ た ． ま た ，3 剤 併 用 で は ，Combination Index (CI, 薬 剤 併 用 効 果 の 指 標) お よ び DRI の 観 点 か ら ，pemetrexed + cisplatin + cSBL が 最 も 有 効 な 組 み 合 わ せ で あ る こ と が 示 さ れ た ． さ ら に ， 各 薬 剤 の 抗 腫 瘍 メ カ ニ ズ ム へ の 関 与 が 報 告 さ れ て い る タ ン パ ク 質 (p21，cyclin A，Bid， お よ び cleaved caspase 3) に つ い て ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ る 解 析 を 行 っ た と こ ろ ，pemetrexed + cSBL + TRAIL が ， そ れ ぞ れ の 薬 剤 の 抗 腫 瘍 メ カ ニ ズ ム が 相 反 す る こ と な く 作 用 し て い る こ と が 示 さ れ ， こ ち ら も 有 望 な 治 療 レ ジ メ ン と な り う る 可 能 性 が 示 さ れ た ．
本 研 究 で 用 い た cSBL が も つ 糖 鎖 結 合 能 と RNase 活 性 は ， 近 年 が ん の 細 胞 生 物 学 研 究 分 野 で 注 目 さ れ て い る 糖 鎖 を 介 し た 情 報 伝 達 制 御 お よ び が ん の 消 長 に 深 く 関 わ っ て い る こ と が 明 ら か と な っ て き た マ イ ク ロ RNA (miRNA) の 両 方 を 標 的 と し て 作 用 し 得 る 物 質 で あ り ， あ た ら し い 作 用 機 序
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を も つ 薬 剤 と し て 利 用 で き る の で は な い か と 著 者 は 考 え て い る ． こ れ ま で 明 ら か に な っ て い る cSBL の 高 い 悪 性 腫 瘍 選 択 性 が ， 細 胞 の が ん 化 に 伴 う 糖 鎖 末 端 の シ ア ル 酸 の 質 的 あ る い は 量 的 変 化 に よ る も の か 否 か ， ま た 通 常 エ ク ソ ソ ー ム と 呼 ば れ る 小 胞 に 内 包 さ れ 存 在 す る miRNA に 対 し て cSBL が 作 用 で き る か ， な ど 解 明 す べ き 点 は 数 多 く 残 さ れ て お り ， 今 後 cSBL の 臨 床 応 用 を 目 指 す 上 で の 課 題 に な る と 考 え ら れ る ．
本 研 究 に よ り ， 悪 性 中 皮 腫 株 お よ び pemetrexed 耐 性 株 に 対 す る cSBL と 既 存 薬 剤 と の 相 乗 的 抗 腫 瘍 作 用 が 示 唆 さ れ た ．cSBL の 抗 腫 瘍 メ カ ニ ズ ム の さ ら な る 解 明 を 通 し て レ ク チ ン 活 性 を 利 用 し た ド ラ ッ ク デ リ バ リ ー シ ス テ ム の 構 築 ，miRNA を 始 め と し た が ん 関 連 分 子 と の 相 互 作 用 を 利 用 し た ， 新 し い が ん 治 療 戦 略 へ の 取 り 組 み が 加 速 す る こ と を 期 待 す る ．
主 論 文 (原 著 論 文)
1. Toshiyuki Satoh, Takeo Tatsuta, Shigeki Sugawara, Akiyoshi Hara, Masahiro Hosono
Synergistic anti-tumor effect of bullfrog sialic acid-binding lectin and pemetrexed in malignant mesothelioma
Oncotarget, 2017, 8 (26), 42466-42477.
2. Takeo Tatsuta, Toshiyuki Satoh, Shigeki Sugawara, Akiyoshi Hara, Masahiro Hosono
Sialic acid-binding lectin from bullfrog eggs inhibits human malignant mesothelioma cell growth in vitro and in vivo
PloS One，2018, 13 (1), e0190653.
3. 佐 藤 稔 之 ， 立 田 岳 生 ， 菅 原 栄 紀 ， 原 明 義 ， 細 野 雅 祐
新 規 抗 が ん 剤 候 補 と し て の レ ク ザ イ ム を 用 い た 悪 性 中 皮 腫 細 胞 に 対 す る
多 剤 併 用 効 果 の 検 討
東 北 医 科 薬 科 大 学 研 究 誌 ，64， 印 刷 中
