東北薬科大学 審査学位論文（博士）

東北薬科大学

審査学位論文（博士）

氏名（本籍） ｸﾄﾞｳ ｱﾂｼ

工藤 敦（宮城県）

学位の種類 博士（薬科学）

学位記番号 博薬科第

1

号

学位授与の日付 平成

27

年

3

月

17

日

学位授与の要件 学位規則第４条１項該当

学位論文題名

Aspergillus

属菌の細胞壁ガラクトマンナンの構造及 び増殖条件によるその変化の解析

論文審査委員

主査 教 授 大久保 恭 仁

副査 教 授 山 下 幸 和

副査 教 授 柴 田 信 之

Aspergillus 属菌の細胞壁ガラクトマンナンの構造 及び増殖条件によるその変化の解析

東北薬科大学大学院薬学研究科 感染生体防御学教室

工 藤 敦

目

次

序

章………

1

第一章

異なる培地で培養した

Aspergillus fumigatus

の

O-

結合型オリゴ糖の構造解析 第一節 緒論……… 5

第二節 実験材料及び実験方法……… 7

第三節 結果………12

第四節 考察………20

第二章 異なる培地で培養した

Aspergillus fumigatus

の

N-

結合型ガラクトマンナンの構造解析 第一節 緒論………22

第二節 実験材料及び実験方法………24

第三節 結果………29

第四節 考察………44

第三章

Aspergillus niger

及び

Aspergillus terreus

の

N-

結合型ガラクトマンナンの構造解析 第一節 緒論………48

第二節 実験材料及び実験方法………50

第三節 結果………52

第四節 考察………60

総 括………62

論文目録………65

謝 辞………66

引用文献………67

序

章

我 々 人 類 は 細 菌 や 真 菌 と 密 接 に 関 わ っ て 生 活 し て い る ． 人 間 の 体 に は

100

兆 個 以 上 の 常 在 菌 が 生 息 し て お り ， 特 に 腸 内 細 菌 は 人 間 の 免 疫 の 調 節 に 関 与 し て い る と 言 わ れ て い る ^{1 )}． ま た ， 人 間 は 嗜 好 品 の 製 造 や 環 境 保 全 の た め に ， さ ら に バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー の 分 野 で も 細 菌 や 真 菌 を 利 用 し て き た ．一 方 で ，人 類 は 細 菌 類 に よ る 感 染 症 に 苦 し め ら れ ， 死 亡 原 因 の 大 半 が 感 染 症 と な っ て い た 時 代 も あ っ た ．

こ の 感 染 症 の 治 療 に 大 き く 貢 献 し た の が 抗 菌 薬 で あ る ． ペ ニ シ リ ン は 世 界 初 の 抗 菌 薬 と し て

1929

年 に 発 見 さ れ ，特 に 第 二 次 世 界 大 戦 の 際 に は 負 傷 後 の 破 傷 風 に よ る 感 染 症 に 広 く 使 わ れ た ． そ の 後 セ フ ェ ム 系 抗 菌 薬 の 発 見 や 全 合 成 に よ っ て 作 ら れ た ニ ュ ー キ ノ ロ ン 系 抗 菌 薬 な ど 多 く の 抗 菌 薬 が 作 ら れ ， 感 染 症 の 治 療 は 急 速 に 進 歩 し た ． 例 え ば ， 放 線 菌 か ら 発 見 さ れ た 抗 菌 薬 で あ る ス ト レ プ ト マ イ シ ン や 結 核 に 効 果 が あ る イ ソ ニ ア ジ ド ， ピ ラ ジ ナ ミ ド な ど の 抗 結 核 薬 の 発 見 は ， か つ て

1

位 で あ っ た 結 核 の 死 亡 率 を 現 在 で は

26

位 ま で 低 下 さ せ た ．

し か し 抗 菌 薬 の 開 発 の 一 方 で ， 細 菌 類 の 抗 菌 薬 に 対 す る 耐 性 化 が 問 題 と な っ て い る ． 例 え ば ペ ニ シ リ ン に 対 す る 耐 性 菌 は 実 用 化 か ら 間 も な い

1940

年 台 に 発 見 さ れ て い る ．ペ ニ シ リ ン の 作 用 機 序 は 細 菌 類 が 有 す る ペ ニ シ リ ン 結 合 タ ン パ ク 質 に 結 合 す る こ と に よ る 細 胞 壁 合 成 阻 害 だ が ， 耐 性 化 は そ の タ ン パ ク 質 に 変 異 が 起 こ り ペ ニ シ リ ン の 結 合 能 が 低 下 し た た め に 生 じ た ． 人 類 は こ の 耐 性 菌 に 対 抗 す る た め の 抗 菌 薬 と し て メ チ シ リ ン を 開 発 し た が ， 更 に メ チ シ リ ン に 耐 性 を 獲 得 し た

M e t h i c i l l i n - r e s i s t a n t S t a p h y l o c o c c u s a u re u s (MRSA)が 発 生 し た ．こ の MRSA

は 医 療 施 設 内 で の 院 内 感 染 だ け で は な く

community-acquired MRSA (CA-MRSA)と 言 わ れ る 市 中 感 染 型 の MRSA

の 増 加 ，治 療 薬 で あ る バ ン コ マ イ シ ン の 最 少 発 育 阻 止 濃 度 （

MIC

） が

2 µg/mL

の 株 の 出 現 に よ り 治 療 難 渋 例 が 増 え て い る ^{2 )}と い う 問 題 が あ り ， よ り 注 意 が 必 要 な 菌 種 で あ る ．

一 方 真 菌 症 に 着 目 す る と ， 近 年 増 加 傾 向 に あ る の は

Aspergillus

属 菌

1

が 原 因 で 生 じ る ア ス ペ ル ギ ル ス 症 で あ り ， 剖 検 例 中 の 内 臓 真 菌 症 （ 深 在 性 真 菌 症 ） と し て 検 出 さ れ る 頻 度 が 最 も 多 い 菌 種 で あ る ^{3 )}

(Fig. 1)．

以 前 は

Candida

属 菌 の 検 出 が 最 も 多 か っ た が ， 新 規 抗 真 菌 薬 の 登 場 に よ り カ ン ジ ダ 症 の 治 療 効 果 が 上 昇 し た こ と 及 び 易 感 染 性 の 病 態 で 患 者 が 長 期 生 存 可 能 に な り ，

Aspergillus

属 菌 の 感 染 を 受 け る 機 会 が 増 加 し た た め

Aspergillus

属 菌 の 検 出 頻 度 が 上 昇 し た と 考 察 さ れ て い る ^{4 )}． ア ス ペ ル ギ ル ス 症 の 代 表 的 な も の と し て は ，

Aspergillus

属 菌 が ア レ ル ギ ー 源 と な り 発 症 す る ア レ ル ギ ー 性 気 管 支 肺 ア ス ペ ル ギ ル ス 症

，

肺 あ る い は 気 管 支 に 器 質 的 な 病 変 が 存 在 す る 場 合 に 発 症 す る 肺 ア ス ペ ル ギ ロ ー マ

，

好 中 球 減 少 ， 強 力 な 免 疫 抑 制 薬 及 び 抗 が ん 剤 投 与 時 に 発 症 頻 度 が 高 い 侵 襲 性 ア ス ペ ル ギ ル ス 症 が あ る ． こ の 中 で も 侵 襲 性 ア ス ペ ル ギ ル ス 症 は 致 死 率 が

58

％ と 高 い 予 後 不 良 な 疾 患 で あ る ^{5 )}．

Fi g. 1 . わ が 国 の 病 理 剖 検 例 に お け る 内 臓 真 菌 症 の 年 次 別 発 生 頻 度 と 抗 真 菌 薬 の 上 市 年 ^{6 )}.

こ の

Aspergillus

属 菌 の 感 染 に は 胞 子 が 重 要 と さ れ て い る が ， 空 気 中 に も 多 く 存 在 し 無 意 識 に 一 日 数 百 個 を 吸 い こ ん で い る と 言 わ れ て い る

7 )．特 に 建 物 の 建 築 や 改 築 が 近 く で 行 わ れ て い た 場 合 に ア ス ペ ル ギ ル ス 症 の 発 症 率 が 上 が る た め ^{8 , 9 )}，病 院 内 の 空 調 設 備 の 清 掃 や

HEPA

フ ィ ル タ ー に よ る 管 理 が 重 要 と さ れ て い る 1 0 , 11 )．こ の 胞 子 は 健 常 人 で あ れ ば 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ や 好 中 球 な ど の 生 体 の 防 御 機 構 に よ り 排 除 す る こ

2

と が で き る が 1 2 , 1 3 )，免 疫 能 の 低 下 し た 患 者 で は 排 除 で き ず に 感 染 し て し ま い ^{1 4 )}，特 に 骨 髄 移 植 患 者 な ど の 好 中 球 減 少 患 者 は 発 症 の リ ス ク が 高 い と 言 わ れ て い る ^{1 5 -1 8 )}．

こ れ ら の 真 菌 症 に 対 す る 治 療 薬 で あ る 抗 真 菌 薬 と し て は ，

cytochrome P450

を 阻 害 し ，細 胞 膜 成 分 の エ ル ゴ ス テ ロ ー ル 合 成 を 阻 害 す る ア ゾ ー ル 系 ， エ ル ゴ ス テ ロ ー ル に 結 合 し 細 胞 膜 を 破 壊 す る ポ リ エ ン 系 が あ る が ，近 年 新 し く キ ャ ン デ ィ ン 系 抗 真 菌 薬 が 発 売 さ れ て い る ． こ れ は 新 規 作 用 部 位 と し て 細 胞 壁 に 存 在 す る

β-1,3-

グ ル カ ン 合 成 酵 素 阻 害 作 用 を 有 す る が ， 真 菌 特 異 的 な 作 用 部 位 の た め 副 作 用 が 少 な い と い う 利 点 が あ る ． 一 方 で 細 菌 と 同 様 に 真 菌 の 耐 性 化 の 問 題 が 危 惧 さ れ て お り ， イ ト ラ コ ナ ゾ ー ル や ボ リ コ ナ ゾ ー ル 耐 性 の

A. fumigatus

^{1 9 -2 2 )}， ア ム ホ テ リ シ ン

B

耐 性 の

Aspergillus terreus

^{2 3 )}な ど が 出 現 し て お り ， 今 後 の 耐 性 化 の 進 行 に 注 意 が 必 要 で あ る ． ま た

Aspergillus

属 菌 で は 未 だ 認 め ら れ て い な い が ，

Candida

属 菌 で は キ ャ ン デ ィ ン 系 抗 真 菌 薬 低 感 受 性 菌 の 存 在 が 報 告 さ れ て い る こ と か ら ^{2 4 -2 6 )}， 更 な る 耐 性 化 の 防 止 ， 新 規 抗 真 菌 薬 の 開 発 が 求 め ら れ て い る ．

こ れ ら の ア ス ペ ル ギ ル ス 症 の 治 療 に は 早 期 診 断 が 重 要 で あ り ， 診 断 法 と し て は 微 生 物 学 的 検 査 ， 病 理 組 織 学 的 検 査 ， 画 像 検 査 ， 真 菌 抗 原 検 査 ， 分 子 生 物 学 的 検 査 の 有 用 性 が 明 ら か と な っ て い る ． こ の う ち 確 定 診 断 は 培 養 検 査 ， 鏡 検 ， 病 理 組 織 学 的 検 査 で 行 え る が ， 状 態 不 良 の 患 者 に 侵 襲 的 検 査 は 行 え ず 明 確 な 結 果 が 得 ら れ な い 場 合 が あ り ， 補 助 診 断 法 と し て こ れ ら 以 外 の 診 断 法 も 用 い ら れ て い る ． そ の 中 で も 真 菌 抗 原 検 査 と し て ，菌 体 が 産 生 す る ガ ラ ク ト マ ン ナ ン 抗 原 を

ELISA

法 で 検 出 す る キ ッ ト

(Plateria Aspergillu s EIA)は 発 症 早 期 に 短 時 間 で 感 染 の

有 無 の 確 認 が で き る た め 頻 用 さ れ て い る ． こ れ は ガ ラ ク ト マ ン ナ ン に 含 ま れ る オ リ ゴ ガ ラ ク ト フ ラ ノ ー ス

(Galf )鎖 が 特 異 的 な 抗 原 性 を 有 す

る た め ， こ の 抗 原 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 診 断 に 応 用 し た も の で あ る ^{2 7 )}．

こ れ ま で に 真 菌 の 細 胞 壁 抗 原 多 糖 の 研 究 は 広 く 行 わ れ て い る ． 特 に

Candida

属 菌 の 細 胞 壁 の 最 外 層 に 存 在 す る マ ン ナ ン タ ン パ ク 質 複 合 体

3

2 8 )は ，宿 主 細 胞 へ の 付 着 2 9 , 3 0 )，マ ク ロ フ ァ ー ジ と の 相 互 作 用 3 1 , 3 2 )，細 胞 壁 の 構 築 3 3 , 3 4 )，病 原 性 へ の 関 与 ^{3 5 )}等 に 関 す る 解 析 が 進 め ら れ て い る ． 一 方 で 細 胞 壁 ガ ラ ク ト マ ン ナ ン に つ い て は ，こ れ ま で に

Penicillium

^{3 6 )}

, Malassezia

^{3 7 )}

, Trichophyton

^{3 8 )}で 構 造 解 析 の 報 告 が あ り ， ま た

Gal f

を 有 す る 菌 の 細 胞 壁 糖 鎖 構 造 と し て

Cladosporium

^{3 9 )}や

Lactobacillus

4 0 , 4 1 )，

Fusarium

^{4 2 )}が 近 年 報 告 さ れ て お り ， 自 然 界 で の

Galf

の 存 在 が 徐 々 に 明 ら か と な っ て い る ．こ の

Aspergillus

属 菌 が 有 す る

Galf

に つ い て は ，

A.

fumigatus

に お い て 病 原 性 へ の 関 与 4 3 , 4 4 )や

Aspergillus nidulans

に お い て 抗 真 菌 薬 に 対 す る 感 受 性 へ の 影 響 ^{4 5 )}と い っ た 報 告 が あ り ，ヒ ト が 有 し て い な い 糖 鎖 構 造 と い う 特 徴 を 利 用 し た

Galf

の 機 能 に 関 す る 研 究 の 進 展 が 期 待 さ れ て い る ．一 方 で ，近 年 遺 伝 子 欠 損 株 の 作 製 に よ る

Galf

の 機 能 解 析 は 盛 ん に 行 わ れ て い る も の の ，

Gal f

鎖 の 構 造 に 着 目 し た 研 究 は ほ と ん ど 行 わ れ て い な か っ た ．

現 在 臓 器 移 植 な ど の 医 療 技 術 の 進 歩 に 伴 う 真 菌 症 の 増 加 が 危 惧 さ れ て お り ^{4 6 )}，特 に 内 臓 真 菌 症 の 中 で 検 出 割 合 の 大 き い

Aspergillus

属 菌 は 今 後 更 に 増 加 す る 可 能 性 が あ る ． ま た 抗 真 菌 薬 は 細 菌 感 染 症 と 異 な り 治 療 薬 が 限 ら れ て い る こ と や 耐 性 化 の 懸 念 も あ る こ と か ら ，

Aspergillus

属 菌 の 性 質 及 び 病 原 性 に 関 す る 研 究 を 更 に 進 め る 必 要 が あ る ． そ こ で 本 研 究 で は ，ア ス ペ ル ギ ル ス 症 の 新 た な 診 断 法 や 治 療 薬 開 発 の た め に ， そ の 基 礎 と な る

Aspergillus

属 菌 の 細 胞 壁 構 造 の 理 解 を 目 的 と し ， 細 胞 壁 に 特 徴 的 に 存 在 す る ガ ラ ク ト マ ン ナ ン に 着 目 し 構 造 解 析 を 行 っ た ． そ の 結 果 ，培 養 条 件 ，菌 種 に よ り

Galf

側 鎖 の 長 さ が 大 き く 変 化 す る こ と ， 更 に 新 規 糖 鎖 構 造 の 存 在 す る こ と を 明 ら か に し た ．

第 一 章 で は 異 な る 培 地 で 培 養 し た

A. fumigatus

の

O-

結 合 型 オ リ ゴ 糖 の 構 造 の 変 化 ， 第 二 章 で は 異 な る 培 地 で 培 養 し た

A. fumigatus

の

N-

結 合 型 ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の 構 造 の 変 化 ， 第 三 章 で は

Aspergillus niger

及 び

A. terreus

の

N-

結 合 型 ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の 詳 細 な 構 造 に つ い て 解 析 し た 結 果 を 報 告 す る ．

4

第 一 章

異 な る 培 地 で 培 養 し た

Aspergillus fumigatus

の

O-

結 合 型 オ リ ゴ 糖 の 構 造 解 析

第 一 節 緒 論

糖 タ ン パ ク 質 と は タ ン パ ク 質 に 糖 鎖 が 結 合 し た も の で あ る が ， そ の 中 で も

O-結 合 型 糖 鎖 は セ リ ン ま た は ス レ オ ニ ン 残 基 に 結 合 し た も の を

指 す ． 人 類 が 有 す る

O-結 合 型 糖 鎖 と し て は 免 疫 グ ロ ブ リ ン

^{4 7 )}や ヒ ト 絨 毛 性 ゴ ナ ド ト ロ ピ ン^{4 8 )}の 構 造 が 解 析 さ れ て お り 、 特 に

α -ジ ス ト ロ グ リ

カ ン に つ い て は

Siaα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→2Man

と い う シ ア ル 酸 を 含 む 糖 鎖 を 初 め^{4 9 )}， 様 々 な 構 造 を 持 つ 一 連 の

O-

結 合 型 糖 鎖 構 造 が 報 告 さ れ て い る^{5 0 -5 3 )}．一 方 ，哺 乳 類 と は 異 な り

Saccharomyces cerevisiae

な ど の 真 菌 が 持 つ

O-

結 合 型 糖 鎖 は 全 て

O-mannose

型 糖 鎖 で あ る^{5 4 )}．パ ン 酵 母 は

α-1,2

結 合 及 び

α-1,3

結 合 の

mannoseが 1-5残 基 繋 が る 糖 鎖 を 有 し て お

り ，

O-

結 合 型 糖 鎖 は 酵 母 の 生 存 や 細 胞 壁 の 生 合 成 に 関 与 し て い る と 報 告 さ れ て い る^{5 5 )}．ま た

Candida albicansの 構 造 は S. cerevisiaeの 糖 鎖 と 類

似 し て お り

α-1,2

結 合 の

mannoseが 2-3残 基 結 合 し て い る が

^{5 6 )}，

Cryptococcus neoformans

で は

mannose

以 外 に

galactose

や

x ylose

を 有 す る 特 徴 的 な 構 造 で あ り^{5 7 )}， 真 菌 の

O-

結 合 型 糖 鎖 は 菌 種 に よ っ て 様 々 な 構 造 の 糖 鎖 を 有 す る こ と が 知 ら れ て い る ．一 方

Aspergillus属 菌 に つ い て の

構 造 解 析 で は ，

A. fumigatusの O-

結 合 型 糖 鎖 は

Glcp α1→6Man

，

Gal f β1→

6Manp α1→6Man

，

Galf β1→5Gal f β1→6Man p α1→6Man

，

Galf β1→5Gal f β1→

5Galf β1→5Gal f β1→6Man

を 有 す る こ と^{5 8 )}や ，

Aspergillus awamoriの glucoamylase I

は

mannose, α-1,2-mannotriose

を 有 す る と い う 報 告 が あ

る^{5 9 )}．ま た 近 年 タ ン パ ク 質 の セ リ ン あ る い は ス レ オ ニ ン 残 基 に

mannose

を 転 移 す る 酵 素 で あ る

protein O-mannosyltransferase

に 関 す る 研 究 も 行 わ れ て お り ，

A. fumigatusの AfPmt1p, AfPmt2p, AfPmt4p

6 0 , 6 1 )や ，

A.

nidulansの PmtA

^{6 2 )}の 欠 損 に よ り 細 胞 壁 構 築 に 影 響 が 生 じ る こ と か ら ，

5

Aspergillus属 菌 が 有 す る O-

結 合 型 糖 鎖 も 重 要 な 役 割 を 有 し て い る と 考 え ら れ て い る ． し か し ， 様 々 な 構 造 の 糖 鎖 の 存 在 理 由 や 遺 伝 子 欠 損 状 態 で の 糖 鎖 構 造 は 明 ら か に な っ て い な い ．

こ れ ま で に

C. albicans

を

yeast nitrogen base

培 地 で 培 養 し た 際 に

yeast extract-peptone-dextrose

培 地 で 培 養 し た 場 合 よ り も 細 胞 壁 表 面 の 疎 水 性 の 増 加 す る こ と が 報 告 さ れ て い る ^{6 3 )}．ま た 同 培 地 で 培 養 し た 際 の マ ン ナ ン 構 造 や 抗 原 性 に つ い て ， リ ン 酸 基 や

β-1,2

結 合

mannose

が 消 失 し ， 非 還 元 末 端

α-1,3

結 合 が 増 加 す る こ と や 抗 原 性 の 変 化 す る こ と が 報 告 さ れ て い る ^{6 4 )}．こ れ ら の 結 果 は

Aspergillus

属 菌 に お い て も 細 胞 壁 糖 鎖 の 構 造 が 変 化 す る 可 能 性 を 示 唆 し て い た ． そ こ で ， 本 章 で は

A. fumigatus

を

yeast nitrogen base

培 地 及 び

yeast extract-peptone-dextrose

培 地 で 培 養 を 行 い ，得 ら れ た

O-結 合 型 オ リ ゴ 糖 鎖 の 構 造 の 違 い に つ い

て 検 討 を 行 っ た ．

6

第 二 節 実 験 材 料 及 び 実 験 方 法

1． 使 用 菌 株

Aspergillus fumigatus var. fumigatus NBRC 33022

を 用 い た ． 菌 体 は 独 立 行 政 法 人 製 品 評 価 技 術 基 盤 機 構 バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー 本 部 よ り 入 手 し た ．

2． 菌 の 培 養

培 地 は yeast extract -peptone-dextrose 培 地

(0.5% yeast extract (透 析 後

の 透 析 外 液 を 使 用

)

，

1% peptone， 2% glucose) (以 下 YPD

培 地 と 略 す

)

は

500 mL

三 角 フ ラ ス コ に 分 注 し オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌 を 行 い 使 用 し た ．

yeast nitrogen base-galactose

培 地

(9% galactose

，

0.67% yeast nitrogen base (0.5% ammonium sulfate

， 少 量 の ア ミ ノ 酸 ， ミ ネ ラ ル ， ビ タ ミ ンを 含 む

) )

（ 以 下

YNB

培 地 と 略 す ） は ， ま ず

galactose

を 三 角 フ ラ ス コ に 分 注 し オ ー ト ク レ ー ブ を 行 い ，

YNB

は

0.22 µm

メ ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー を 用 い て 分 注 す る こ と に よ り 調 製 し た ．本 菌 は

2% agar

を 含 む

YPD

斜 面 寒 天 培 地 で 前 培 養 の 後 ， 上 記 の 培 地 に 適 量 移 植 し ，28℃ ，14 日 間 静 地 培 養 し た ．

3

． 培 養 濾 液 粗 画 分 の 調 製

培 養 後

formaldehyde

を 最 終 濃 度 が

1%に な る よ う 加 え 一 晩 静 置 し た

後 ，ろ 紙 を 用 い て 培 養 濾 液 と 菌 体 を 分 離 し た ．培 養 濾 液 は

30-40℃ で 減

圧 濃 縮 し ，

2-3

日 流 水 透 析 を 行 い ， 再 度 減 圧 濃 縮 し 凍 結 乾 燥 を 行 っ た ．

4． ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の 分 離

培 養 濾 液 粗 画 分 を 精 製 水 で 溶 解 後

3000 rpm，10

分 間 遠 心 分 離 し ，上 清 を

DEAE-Sepharose Fast Flow column (5×20 cm)

に か け 水 ，

0.1 M NaCl

，

1 M NaCl

で 溶 出 し た ． 溶 出 液 の 糖 含 量 を フ ェ ノ ー ル ・ 硫 酸 法 で 測 定 後 回 収 し ，減 圧 濃 縮 ，2-3 日 流 水 透 析 を 行 っ た 後 ，再 び 減 圧 濃 縮 し て 凍 結 乾 燥 し た ．

YPD

培 地 及 び

YNB

培 地 で 培 養 し て 得 ら れ た ガ ラ ク ト マ ン

7

ナ ン を 以 下 そ れ ぞ れ

P-GM

及 び

N-GM

と 略 す ．

5． 菌 体 か ら の オ ー ト ク レ ー ブ 粗 抽 出 物 の 調 製

菌 体 は ろ 紙 を 用 い て 分 離 し た 後 ，生 理 食 塩 水 で 洗 浄 し ，acetone を 加 え て 沈 積 し

4

℃ で 保 存 し た ．

acetone

脱 脂 し た 菌 体 を 濾 紙 濾 過 し ， 再 度

acetone

に 沈 積 し 濾 過 し た ．こ れ を

3

回 繰 り 返 し た 後 ，菌 体 を 室 温 で 乾 燥 さ せ 乳 鉢 中 で 粉 砕 し た ． 粉 砕 し た 菌 体 に 精 製 水 を 加 え ，

121

℃ ，

3

時 間 ， オ ー ト ク レ ー ブ に か け 熱 水 抽 出 を 行 っ た ． 冷 後 ，

3000 rpm， 20

分 間 遠 心 分 離 し 上 清 を

2-3

日 流 水 透 析 し た 後 ， 凍 結 乾 燥 を 行 っ た ．

6． Cetavlon

法 に よ る 粗 ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の 分 離

オ ー ト ク レ ー ブ 粗 抽 出 物 を

Cetavlon

法 に よ り 精 製 し た ^{6 5 )}．粗 抽 出 物

2 g

を 精 製 水

40 mL

に 溶 か し ，

9% Cetavlon (hexadecyl-trimethyl-ammo- nium bromide)

溶 液

20 mL

を 加 え 室 温 で

1

時 間 攪 拌 後 ，

3000 rpm

，

25

℃ で

30

分 間 遠 心 分 離 を 行 っ た ．得 ら れ た 上 清 に

1% boric acid 40 mL

を 加 え 撹 拌 し な が ら

1 M NaOH

溶 液 を 滴 下 し

pH 9.5

に 調 整 し た ． 生 じ た 沈 殿 を

3000 rpm， 10

分 間 遠 心 分 離 で 回 収 し ，

0.5% sodium acetate

溶 液

(pH 9.5) 100 mL

で 洗 浄 後 ，

2% acetic acid 2 mL

で 溶 か し ，

0.8% sodium acetate/ethanol

溶 液 に 少 量 ず つ 加 え た ．生 じ た 沈 殿 を

3000 rpm

で

10

分 間 遠 心 分 離 し ， 沈 殿 を

2% acetic acid/ethanol

溶 液 で 洗 浄 し 乾 燥 後 ， 適 量 の 水 に 溶 か し

2-3

日 流 水 透 析 し ， 回 収 後 凍 結 乾 燥 を 行 っ た ．

7． O-結 合 型 糖 鎖 の 分 離

O-

結 合 型 糖 鎖 は

2

種 の 条 件 で

β-elimination

に よ り 分 離 し た ． 還 元 条 件 下 で の オ リ ゴ 糖 調 製 は ， 粗 ガ ラ ク ト マ ン ナ ン

300 mg

に

0.5 M NaBH

4

/0.1 M NaOH 30 mL

を 加 え ， 室 温 で

24

時 間 反 応 さ せ る こ と に よ り 遊 離 さ せ た ^{6 6 )}．そ の 後

acetic acid

で 中 和 し ，

Amberlite IR-120 (H

^＋型

)

で 脱 イ オ ン し ， 生 成 物 を

Bio-Gel P-6 column（ 2.5×100 cm） に か け た ．

非 還 元 条 件 下 で の オ リ ゴ 糖 調 製 は ， 粗 ガ ラ ク ト マ ン ナ ン

300 mg

に

0.1 M NaOH 30 mL

を 加 え 室 温 で

24

時 間 反 応 さ せ る こ と に よ り 遊 離 さ せ た

8

6 7 )． そ の 後

1 M HCl 3 mL

で 中 和 し ，

Bio-Gel P-6 column（ 2.5×100 cm）

に か け た ． 両 溶 出 液 の 糖 含 量 を フ ェ ノ ー ル ・ 硫 酸 法 で 測 定 後 各 オ リ ゴ 糖 別 に 回 収 し ，更 に

Bio-Gel P-2 column（ 2.5×100 cm）又 は Bio-Gel P-4 column（ 2.5×200 cm） に か け ， 同 様 に 発 色 後 そ れ ぞ れ の オ リ ゴ 糖 を 回

収 し 凍 結 乾 燥 を 行 う こ と に よ り 精 製 し た ．溶 出 位 置 は

Candida

マ ン ナ ン の ア セ ト リ シ ス に よ り 得 ら れ た

2

糖 か ら

6

糖 ま で の オ リ ゴ 糖 ^{6 8 )}を 標 準 品 と し て 用 い た ．

8． メ チ ル 化 分 析

メ チ ル 化 分 析 は 多 糖 ， オ リ ゴ 糖 共 に

Ciucanu

ら の 方 法 ^{6 9 )}に 準 じ ， 次 の よ う に 行 っ た ． 試 料

1 mg

に

DMSO 1 mL

を 加 え ，

1

時 間 攪 拌 し 試 料 を 溶 解 し た ．次 に 多 糖 の 場 合 は 乳 鉢 で す り つ ぶ し た 粉 状 の

NaOH 50 mg

を 添 加 し ，

3

時 間 攪 拌 後

CH

3

I

を

500 µL

加 え ， 更 に

3

時 間 撹 拌 し た ． オ リ ゴ 糖 の 場 合 は 同 様 に 粉 状 の

NaOH

を

50 mg

添 加 し ，

30

分 攪 拌 後

CH

₃

I

を

500 µL

加 え ， 更 に

30

分 撹 拌 し た ． 反 応 液 に ， 水

1 mL

と

chloroform 1 mL

を 加 え 激 し く 振 り 混 ぜ て 抽 出 後 ，1500 rpm，

3

分 間 遠 心 分 離 を 行 い

chloroform

層 を 回 収 し ， 水 で

3

回 洗 浄 後

chloroform

層 に 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム を 適 量 加 え 脱 水 し メ チ ル 化 誘 導 体 を 得 た ．

続 い て ，得 ら れ た メ チ ル 化 誘 導 体 を

GC/MS

で 解 析 を 行 う た め に ，部 分 メ チ ル 化 ア ル ジ ト ー ル ア セ テ ー ト を 以 下 の よ う に 調 製 し た ． ま ず

2 M trifluoroacetic acid (TFA) 3 mL (TFA 450 µL

と 水

2.55 mL

を 混 和 し て 調 製 し た

)

を 加 え

110

℃ で

3

時 間 加 水 分 解 し ， 濃 縮 乾 固 し た ． そ の 後

2-propanol

を

2 mL

加 え

40

℃ で 濃 縮 乾 固 を

3

回 繰 り 返 し た ．次 に

NaBD

₄

15 mg， 水 1 mL

を 加 え 一 晩 放 置 し 還 元 し た ． そ の 後

acetic acid 50 µL

で 中 和 し 濃 縮 乾 固 の 後 ，

methanol

を

2 mL

加 え

40

℃ で 濃 縮 乾 固 を

3

回 繰 り 返 し た ．更 に

acetic anhydride

と

p yridine

の 混 合 溶 液

(1

：

1, v/v) 4 mL

を 加 え

100

℃ で

3

時 間 反 応 さ せ ア セ チ ル 化 を 行 っ た ． そ の 後 減 圧 乾 固 し ，更 に

toluene

を

2 mL

加 え

50℃ で 濃 縮 乾 固 を 3

回 繰 り 返 し た ．そ の 後

chloroform 1 mL

で 抽 出 し ，水 で

3

回 洗 浄 し

chloroform

層 を 濃 縮 乾 固 後 ，acetone 5 mLに 溶 解 し

GC/MS

で 解 析 し た ．GC/MS の 条 件 は 以 下 の

9

通 り で あ る ．

カ ラ ム 名 ：

DB-5

カ ラ ム サ イ ズ ：

0.32 mm × 30 m He

ガ ス ：

20.4 mL/min

カ ラ ム 充 填 剤 ： (5%-Phenyl)-methylpolysiloxane

昇 温 プ ロ グ ラ ム ：

100

℃

(10 min), 20

℃

/min (2.5 min)→5

℃

/min (18 min)→20

℃

/min (3 min)→300

℃

9． HPLC

に よ る

Galf

オ リ ゴ 糖 異 性 体 の 分 離

得 ら れ た オ リ ゴ 糖 を 精 製 水

100 µL

に 溶 解 し ，

50 µL

ず つ

TOSOH

製 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ 装 置

(PX-8010)

を 用 い 分 離 し エ ル マ 光 学 製 示 差 屈 折 計 で ピ ー ク を 検 出 し ， 各 ピ ー ク を 回 収 し た ． 回 収 し た ピ ー ク を 再 度

HPLC

で 分 離 し ， 異 性 体 の ピ ー ク を 除 去 し て オ リ ゴ 糖 を 精 製 し た ． 分 離 し た オ リ ゴ 糖 は 減 圧 濃 縮 後 凍 結 乾 燥 し た ．

HPLC

の 条 件 は 以 下 の 通 り で あ る ．

カ ラ ム 名 称 ：

YMC-PACK PA-25

カ ラ ム サ イ ズ ：

10×500 mm

移 動 相 ：

acetonitrile

：

H

2

O ( 63

：

37 )

10

． 核 磁 気 共 鳴 ス ペ ク ト ル 分 析

1

H-NMR

，^{1 3}

C-NMR

，

total correlation spectroscopy (TOCSY), 2D nuclear Overhauser enhancement spectroscopy (NOESY)の 測 定 は 日 本 電 子 核 磁 気

共 鳴 装 置

(JEOL JNM-LA600)

を 用 い て 行 っ た ．¹

H-NMR

の 測 定 は 試 料

1-10 mg

を 重 水

(D

2

O) 0.7 mL

に 溶 解 し ，

acetone

を 内 部 標 準 物 質

(

¹

H-NMR

は

2.225 ppm

，^{1 3}

C-NMR

は

31.07 ppm)

と し て 室 温 ，

45

℃ 又 は

70℃ で 行 っ た ．

10

11

． 糖 量 測 定

糖 量 は フ ェ ノ ー ル ・ 硫 酸 法 ^{7 0 )}に よ り 次 の よ う に 測 定 し た ． 試 料 を 試 験 管 に

20

，

50

又 は

100 µL

ず つ 取 り ，

5% phenol 100 µL， sulfuric acid 500 µL

を 加 え ，

37℃ ， 20

分 イ ン キ ュ ベ ー ト し ，

TOSOH

製 マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー

(MPR-A4)

で

492 nm

の 吸 光 度 を 測 定 し た ．

12

．

α-mannosidase

処 理

還 元 条 件 下 で 得 た 糖 ア ル コ ー ル 型 の 各 オ リ ゴ 糖

20 mg

を

50 mM borate buffer (pH 4.5) 1 mL

に 溶 解 し ，

Jack bean

由 来

α-mannosidase

を

5 unit

加 え ，

37

℃ で

24

時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た ^{7 1 )}． 次 に こ の

α-mannosidase

処 理 成 績 体 混 合 物 を

Bio-Gel P-2 column (2.5×100 cm)

に か け て 分 画 し ， そ れ ぞ れ の オ リ ゴ 糖 を 分 取 し た ．

11

第 三 節 結 果

O-

結 合 型 糖 鎖 に 及 ぼ す 培 地 の 影 響

2

種 の 異 な る 培 地 で 培 養 し た 菌 体 か ら 培 地 中 に 遊 離 し た 細 胞 壁 ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の

O-

結 合 型 糖 鎖 に つ い て 差 異 を 検 討 す る た め に ，

β-elimination

で 遊 離 し た オ リ ゴ 糖 を

Bio-Gel P-6 column

に か け て 多 糖 画 分 と オ リ ゴ 糖 画 分 に 大 き く 分 け て 分 取 し ， そ の 後 オ リ ゴ 糖 画 分 を 再 度

Bio-Gel P-2 column

も し く は

Bio-Gel P-4 column

に か け て 分 離 し た

(Fig.

1-1)．そ の 結 果 P-GM

は

4

糖 ま で の オ リ ゴ 糖 し か 得 ら れ な か っ た の に 対 し ，

N-GM

で は

10

糖 前 後 ま で の オ リ ゴ 糖 が 得 ら れ た ． こ の こ と か ら ， 培 地 の 変 化 は

O-結 合 型 糖 鎖 の Gal f

オ リ ゴ 糖 鎖 の 長 さ に 影 響 す る こ と が 明 ら か と な っ た ．

Fi g. 1 - 1. Co mp ar i s on o f t h e ch ain l en gt h o f O - li n ked ol i go s acch ar id es ob t ain ed fr o m A .

fu m ig at u s gr o wn u nd er d i s ti n ct cu l tu r e co nd i ti on s . C ul t ur es wer e gr o wn i n YP D o r Y N B med iu m;

gal act o man n an s wer e i s o l at ed b y D E AE - S eph ar o s e co l u mn ch ro mat o gr aph y; an d t h e r es ul t in g P - GM an d N - GM ( r es p ecti v el y) wer e s ub j ect ed to β-elimination under non-reducing conditions ( s ee M at er i al s and met h od s fo r fu l l d es cr ip t ion . ) Th e O- li n ked ol i go s acch ari d es r el eas ed fr o m P - GM wer e s ep ar at ed b y a col u mn (2 .5 × 10 0 c m) o f B io - Gel P -2 ( A) and fr o m N - GM b y a col u mn (2 .5 × 20 0 c m) o f B io - Gel P -4 ( B) . Th e carbo h yd r at e con t en t i n each fr act ion was d et er mi n ed b y t h e p h en ol / s ul fu r i c acid met ho d. Th e n u mb er s fr o m 1 to 6 ind i cat e th e elu t ion po s it io n o f mann o s e and manno ol i go s acch ari d es fr o m bio s e to h exao s e ob t ain ed f ro m C a nd id a man n an b y acet o l ys i s .

12

新 規

O-

結 合 型 糖 鎖 の 構 造 解 析

こ れ ら

O-結 合 型 糖 鎖 の 構 造 を NMR

及 び メ チ ル 化 分 析 に よ り 解 析 し た ．菌 体 抽 出 物 か ら 得 た ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の

O-

結 合 型 糖 鎖 は 培 養 上 清 か ら 回 収 し た ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の

O-

結 合 型 糖 鎖 と 同 じ 構 造 で あ っ た た ． オ リ ゴ 糖 は 非 還 元 条 件 下 で

β-elimination

す る こ と に よ り 得 ら れ た 還 元 末 端 が ア ノ マ ー 異 性 体

(α

体 及 び

β

体

)

の 平 衡 状 態 の も の と ，還 元 条 件 下 で

β-elimination

す る こ と に よ り 得 ら れ た 還 元 末 端 糖 残 基 が 糖 ア ル コ ー ル 型 の も の の

2

種 類 を 用 い て 解 析 し た ． メ チ ル 化 分 析 の 結 果

（

Table 1-1）， 2

糖 は

Man p α1→2Man p

で あ る こ と が 明 ら か と な り ， ま た

3

糖 以 上 で は 糖 ア ル コ ー ル 型 の オ リ ゴ 糖 の 還 元 末 端 が

2,6-di-O-substituted mannitol (2,6-Man-ol)

と

6-O -substituted mannitol (6-Man-ol)

の

2

種 類 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た ． こ の

2,6-Man-ol

残 基 の メ チ ル 化 で 得 ら れ た

2,6-di- O-acetyl-1,3,4,5-tetra- O-methyl mannitol (2,6-Man-ol) (Fig. 1-2B)

は 非 還 元 末 端 の

mannose

残 基 由 来 の

1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra- O-methyl mannitol (t-Manp) (Fig. 1-2A)

の

180

° 回 転 対 称 体 で あ る た め ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で は 同 じ ピ ー ク と し て 検 出 さ れ 区 別 で き な か っ た ． そ こ で 還 元 条 件 下 ， 非 還 元 条 件 下 そ れ ぞ れ で

β-elimination

を 行 い 両 者 を 比 較 し た ． す な わ ち 非 還 元 条 件 下 で

β-elimination

を 行 っ た 際 に 得 ら れ た オ リ ゴ 糖 に つ い て

GC-MS

分 析 を 行 っ た と こ ろ ， 非 還 元 末 端

mannose

残 基

(t-Man p)

か ら は

m/z 102

，

m/z 118，m/z 162

の フ ラ グ メ ン ト イ オ ン が 現 れ る

(Fig. 1-2C)

の に 対 し ， 還 元 条 件 下 で 得 た オ リ ゴ 糖 を 同 様 に メ チ ル 化 分 析 す る と

m/z 101

と

m/z 102， m/z 117

と

m/z 118， m/z 161

の フ ラ グ メ ン ト イ オ ン が 強 く 現 れ

(Fig.

1-2D)， 2

種 の 部 分 メ チ ル 化 ア ル ジ ト ー ル ア セ テ ー ト が 確 認 で き た ． 従 っ て 還 元 条 件 下 で 得 た オ リ ゴ 糖 の メ チ ル 化 物 中 に

1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra- O-methyl mannitol (t-Man p)

及 び

2,6-di-O- acetyl-1,3,4,5-tetra-O-methyl mannitol (2,6-Man-ol)

が 含 ま れ て い る こ と ， す な わ ち

2,6-分 岐 マ ン ノ ー ス の 存 在 が 明 ら か と な っ た ． 以 上 の 結 果 は

結 合 様 式 が 異 な る

2

種 類 の オ リ ゴ 糖 の 存 在 を 示 し て お り ， そ の 構 造 は

3

糖 で は 分 岐 オ リ ゴ 糖 で あ る

Gal f β1→6(Man p α1→2)Man p

と 直 鎖 オ リ ゴ

13

糖 の

Galf β1→5Gal f β1→6Man p

で あ る こ と が 明 ら か と な っ た ．ま た

4

糖 以 上 の 構 造 は

3

糖 と 同 様 の

2

種 類 の 基 本 構 造 の 末 端 に

Galf

が

β-1,5

結 合 で 伸 長 し て お り ， 長 い オ リ ゴ 糖 で は

β-1,6

結 合 の 存 在 も 示 し て い た

(Table 1-1)．

T abl e 1 -1. GC – M S an al ys i s o f O- met h yl al d i to l acet at es d er i ved fr o m met h yl at i o n an al ys es o f O - li n ked ol i go s acch ari d es

R el eas ed o l i go s acch ar id es b y β-elimination in the presence (+) or the absence (−) of NaBH4 wer e s ep ar at ed u s in g B io - Gel P - 2 col u mn an d el u at es co r r es pond i n g t o bi o s e fr act io n to p ent ao s e fr act i on wer e an al yzed b y met h yl at io n an al ys i s .

aR et en t io n t i me r el at i ve to th at o f 1, 5 -d i -O- acet yl - 2 ,3 , 4,6 - t et r a-O- met h yl man ni t o l.

O-Methylalditol acetate Sugar linkage RRT^a

－ ＋ － ＋ － ＋ － ＋

2,3,4,6-Me₄-Man t-Manp 1.00 1.00 1.00 2.60 - 3.00 - 1.40 -

3,4,6-Me3-Man 2-Manp 1.08 0.80 - - - -

1,3,4,5,6-Me₅-Man 2-Man-ol 0.88 - 0.80 - - - -

2,3,4,6-Me₄-Man t-Manp

+ + 1.00 - - - 6.00 - 4.10 - 2.50

1,3,4,5-Me₄-Man 2,6-Man-ol

3,4-Me₂-Man 2,6-Manp 1.20 - - 2.10 - 3.40 - 1.40 -

2,3,4-Me3-Man 6-Manp 1.11 - - 1.00 - 1.00 - 1.00 -

1,2,3,4,5-Me₅-Man 6-Man-ol 0.90 - - - 1.00 - 1.00 - 1.00

2,3,5,6-Me₄-Gal t-Galf 1.01 - - 3.40 2.60 3.20 1.70 2.40 1.50

2,3,6-Me₃-Gal 5-Galf 1.09 - - 1.60 1.50 7.00 4.30 8.00 5.70

2,3,5-Me3-Gal 6-Galf 1.14 - - - - 0.10 0.10 0.50 0.30

Pentaose fraction

NaBH4 NaBH4 NaBH4

NaBH4

Biose fraction Triose fraction Tetraose fraction

14

Fi g. 1 - 2. M as s s p ect r a o f p ar ti al l y met h yl at ed al di t ol acet at e d er i ved fr o m O- l in ked ol i go s acch ar i d es. ( A) F r agmen t at io n s ch eme o f d eu t er iu m l ab el ed 1, 5- di -O- acet yl -2 ,3 ,4 ,6 - t etr a-O- met h yl man ni to l , w hi ch co rr es po nd s to a non - r edu cin g t er mi n al man no s e ( t -M anp).

( B ) F r agmen t at i on s ch e me o f r ever s ed 2, 6 -d i -O- acet yl -1 ,3 ,4 ,5 - t etr a-O- met h yl ma nni t ol , wh i ch cor r es po nd s t o 2, 6 -d i-O- s u bs t i tu t ed man n it ol (2 ,6 - M an- ol ) . ( C ) M as s fr ag men t io ns o f

d eu t eri u m- l ab el ed 1 ,5 - di -O- acet yl - 2 ,3 ,4 ,6 - t et r a-O- met h yl man n i to l ( t -M anp) as t h e s t and ar d.

( D ) M as s fr ag men t io n s o f a mi xt u r e o f d eut er iu m- l ab el ed 1 ,5 - di -O- acet yl - 2, 3, 4, 6- t et r a-O- met h yl mann i to l ( t -M anp) and 2, 6 -d i -O- acet yl - 1, 3, 4, 5 -t et r a-O- met h yl man n it ol (2 , 6- M an - ol ) obt ai n ed fr o m o l i go s acch ar id es lon ger th an b io s e fr act ion r el eas ed b y β-elimination under r ed u cin g cond i ti on s .

15

こ の 構 造 の 確 認 の た め に ¹

H-NMR

解 析 を 行 っ た 結 果 ， 還 元 末 端

mannose (5.35-5.37 ppm)，非 還 元 末 端 及 び 中 間 Gal f (5.19-5.22 ppm)

及 び

mannose

に 結 合 す る

Galf (5.02-5.05 ppm) の シ グ ナ ル が 得 ら れ た (Fig.

1-3A)．還 元 条 件 下 の β-elimination

で 得 た オ リ ゴ 糖

(2

糖

-5

糖 を そ れ ぞ れ

O2-O5

と 略 す

)

は 還 元 末 端 の

mannose (Man-A)

の シ グ ナ ル が 消 失 し ，こ れ に 隣 接 す る

α-1,2-

結 合

mannose (Man-B)

の シ グ ナ ル の 高 磁 場 シ フ ト が 観 測 さ れ た

(Fig. 1-3B)

． そ こ で 分 岐 オ リ ゴ 糖 の

α-1,2

結 合

mannose

を 除 去 し 構 造 解 析 を 進 め る た め に ， こ れ ら の オ リ ゴ 糖 に つ い て

α-mannosidase

処 理 を 行 い ， 再 度

Bio-Gel P-2 column

に か け

α-mannosidase

抵 抗 性 の 直 鎖 オ リ ゴ 糖

(n)

と 分 岐 オ リ ゴ 糖 由 来 の

α-mannosidase

分 解 成 績 体 で あ る 直 鎖 オ リ ゴ 糖

(n-1)

を 分 離 し

(Fig.

1-3E)， そ れ ぞ れ に つ い て

¹

H-NMR

解 析 を 行 っ た

(Fig. 1-3C,1-3D)． そ

の 結 果 ， オ リ ゴ 糖 異 性 体 混 合 物 中 の 直 鎖 オ リ ゴ 糖 と 分 岐 オ リ ゴ 糖 由 来 の オ リ ゴ 糖 が 区 別 で き ，主 鎖 の

mannose

に 結 合 す る 非 還 元 末 端

Gal f

は

5.045 ppm， mannose

に 結 合 す る

Galf

は

5.022 ppm， 1,5

結 合 中 間

Galf

は

5.195 ppm，非 還 元 末 端 Gal f

は

5.220 ppm

で あ る こ と が 明 ら か と な っ た ． ま た ，

mannose

に

Galf

が 直 鎖 状 に 繋 が る も の と ，

mannose

に

Galf

と

mannose

が 分 岐 状 に 繋 が る も の の 存 在 は

3

糖 の

α-mannosidase

抵 抗 性 直 鎖 オ リ ゴ 糖

(O3-3)と 4

糖 の 分 岐 オ リ ゴ 糖 由 来 の

α-mannosidase

分 解 成 績 体 で あ る 直 鎖 オ リ ゴ 糖 の

3

糖

(O4-3)

の ¹

H-NMR

シ グ ナ ル が 一 致 す る こ と ，さ ら に

4

糖 の

α-mannosidase

抵 抗 性 直 鎖 オ リ ゴ 糖

(O4-4)と 5

糖 の 分 岐 オ リ ゴ 糖 由 来 の

α-mannosidase

分 解 成 績 体 で あ る 直 鎖 オ リ ゴ 糖 の

4

糖

(O5-4)の

¹

H-NMR

シ グ ナ ル が 一 致 す る こ と か ら 確 認 で き た ． ま た こ れ ら の

O-結 合 型 糖 鎖 の

¹

H-NMR

の 化 学 シ フ ト 値 を

Table 1-2

に 示 し た ．

16

Fi g. 1 - 3. ¹H N M R s p ect r a o f O - l in ked o li go s acch ar id es . ( A) O l i go s acch ari d es ob t ain ed b y β-elimination under non-reducing conditions. (B) Oligosaccharides obtained by β-elimination und er r edu ci n g co nd it io n s . Th e b io s e fr act i on to p ent aos e fr act i on wer e d es i gn at ed as O2 to O5 , r esp ect i vel y. O3 to O5 wer e t r eat ed wi th α-mannosidase and downsized (n-1) oligosaccharides ( C ) and α-mannosidase resistant (n) oligosaccharides (D) were separated by Bio-Gel P-2 column chr o mat o gr aph y. (E ) Th e s ep ar at io n s ch eme o f α-mannosidase degradation products. For the s t ru ctu r e in t hi s fi gu r e, s ymb o l s

○

^and

□

in di cat e gal acto fu r ano s e ( Galf) and man no p yr an o s e (M an ) r es i du es , r es p ect i vel y. O 3 -3 an d O 3 -2 i nd i cat e α-mannosidase resistant triose and its d egr ad at io n pr od u ct , b io s e, r es p ect i vel y. O 4 -3 an d O 5 - 4 ind i cat e t ri o s e and t etr ao s e o bt ai n ed fr o m O 4 an d O 5, r es p ecti ve l y, b y α-mannosidase degradation.

17

T abl e 1 -2 . ¹H NM R ch e mi c al s h i ft s (δ) of O-linked oligosaccharides Sugar residue and structure

F E D C A F E D C A

B B

Biose fraction Manpα － 5.366

↑2

Manpα1 5.046

Mannitol ＋ -

↑2

Manpα1 5.003

Triose fraction Galfβ1→6Manpα － 5.046 5.352

↑2

Manpα1 5.056

Galfβ1→6Mannitol ＋ 5.05 -

↑2

Manpα1 5.003

Galfβ1→5Galfβ1→6Manpα － 5.192 5.028 5.056

Galfβ1→5Galfβ1→6Mannitol ＋ 5.22 5.023 -

Tetraose fraction Galfβ1→5Galfβ1→6Manpα － 5.222 5.019 5.352

↑2

Manpα1 5.053

Galfβ1→5Galfβ1→6Mannitol ＋ 5.222 5.025 -

↑2

Manpα1 5.002

Galfβ1→5Galfβ1→5Galfβ1→6Manpα － 5.222 5.194 5.019 5.053

Galfβ1→5Galfβ1→5Galfβ1→6Mannitol ＋ 5.222 5.195 5.025 -

Pentaose fraction Galfβ1→5Galfβ1→5Galfβ1→6Manpα － 5.221 5.195 5.024 5.352

↑2

Manpα1 5.048

Galfβ1→5Galfβ1→5Galfβ1→6Mannitol ＋ 5.221 5.197 5.025 -

↑2

Manpα1 5.003

Galfβ1→5Galfβ1→5Galfβ1→5Galfβ1→6Manpα － 5.221 5.195 5.195 5.024 5.048 Galfβ1→5Galfβ1→5Galfβ1→5Galfβ1→6Mannitol ＋ 5.221 5.197 5.197 5.025 -

Galfβ1→6Galfβ1→5Galfβ1→5Galfβ1→6Manpα － 5.048 5.23 5.195 5.024 5.048 Galfβ1→6Galfβ1→5Galfβ1→5Galfβ1→6Mannitol ＋ 5.048 5.232 5.197 5.025 -

Oligosaccharides Reduction

by NaBH₄

H-1 Chemical shift, δ (ppm)

18

O-

結 合 型 糖 鎖 の 全 体 構 造

こ れ ら の 結 果 か ら

2

種 の 異 な る 培 地 で 培 養 し 産 生 さ れ る ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の

O-結 合 型 糖 鎖 の 構 造 を Fig. 1-4

に 示 す ．

P-GM

か ら 得 た

O-

結 合 型 糖 鎖 は 直 鎖 状 及 び 分 岐 状 の も の が

4

糖 ま で し か 存 在 し て い な い の に 対 し ，N-GM か ら 得 た も の で は

Gal f

鎖 が 長 く ，10 糖 前 後 ま で の オ リ ゴ 糖 の 存 在 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た ．

Fi g. 1 - 4. P r opo s ed st r u ct u r es fo r P - GM ( A) and N- GM ( B ) . E ach o f th e s t ru ctu r es i s o n e o f th e po s s ib il i ti es ou t o f th e s t ati s ti cal en s emb l e. M an and G alf d eno t e D - man no p yr an o s e an d D - gal act o fu r ano s e r es id u es , r es p ect i vel y. Th e s i d e ch ai n s equ en ce i s n ot sp eci fi ed .

19

第 四 節

考 察

通 常 ，

O-

結 合 型 糖 鎖 の 解 析 の 際 に

β-elimination

を 行 う 場 合 に は ，

NaBH

4下 で の 還 元 を 行 い な が ら オ リ ゴ 糖 を 得 る ．こ れ は ，

β-elimination

の 際 に 遊 離 す る オ リ ゴ 糖 の 還 元 末 端 が 異 性 化 も し く は ピ ー リ ン グ 反 応 を 起 こ す 恐 れ が あ る た め で あ る ． ま た 還 元 末 端 を 糖 ア ル コ ー ル 型 と す る こ と で 異 性 体 の 存 在 が な く な る た め ，¹

H-NMR

シ グ ナ ル が 単 純 と な り 解 析 し や す い と い う 利 点 も あ る ． 一 方 で ， フ ェ ノ ー ル ・ 硫 酸 法 に よ る 発 色 の 際 に 通 常 単 糖 と し て 現 れ る 糖 が 糖 ア ル コ ー ル と な る た め 検 出 で き な い こ と や ， メ チ ル 化 分 析 を 行 っ た 際 に 還 元 末 端 の 糖 の ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ の ピ ー ク が 糖 ア ル コ ー ル の 場 合 異 な る 位 置 に 現 れ て し ま い 解 析 が 複 雑 に な る 場 合 が あ る ． そ こ で 今 回 は 還 元 条 件 下 及 び 非 還 元 条 件 下 で

β-elimination

を 行 い ， ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で

retention time

が 同 じ に な る

2

種 類 の オ リ ゴ 糖 を 区 別 し ，そ れ ぞ れ メ チ ル 化 分 析 ，

NMR

解 析 を 行 う こ と で 詳 細 な 解 析 を 行 っ た ．

こ れ ま で に も

A. fumigatus

の

O-

結 合 型 糖 鎖 の 構 造 は 報 告 さ れ て い る

が ^{5 8 )}， 今 回 同 様 の 構 造 が 確 認 で き た の は

5

糖 の み で あ り ， 新 た に 分 岐

状 の

Gal f β1→6(Man p α1→2)Man

と 直 鎖 状 の

Gal f β1→5Gal f β1→6Man

及 び 長 い

Gal f

鎖 の 中 に

β-1,6

結 合 を 有 し て い る 糖 鎖 の 存 在 を 明 ら か に し た ． 特 に

mannose

と

Gal f

の 分 岐 オ リ ゴ 糖 は 今 ま で 報 告 さ れ て い る

O-

結 合 型 糖 鎖 の 中 で も 珍 し く ，こ れ ま で の 報 告 で は

Fusarium

属 菌 に 関 す る 報 告

5 4 )の み で あ る ． 今 回

A. fumigatus

に 新 た な 構 造 の

O-

結 合 型 糖 鎖 を 発 見

し た が ，

A. niger

で は 糖 の 種 類 や 結 合 様 式 が 異 な る

5

種 類 の

O-

結 合 型 糖 鎖 の 存 在 が 報 告 さ れ て い る た め ^{7 2 )}， 菌 種 ， 菌 株 に よ り 存 在 す る オ リ ゴ 糖 の 構 造 が 僅 か に 異 な っ て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る ．ま た

O-

結 合 型 糖 鎖 の 役 割 と し て 細 胞 壁 の 形 成 や 維 持 へ の 関 与 が 報 告 さ れ て い る が ^{5 4 ,}

7 3 )， こ れ ら の 構 造 の 違 い が 与 え る 影 響 に つ い て は 未 解 明 で あ り 今 後 の

研 究 課 題 と な っ て い る ．

本 研 究 に よ り 培 地 成 分 の 違 い が ，O-結 合 型 糖 鎖 の

Galf

鎖 の 長 さ に 影 響 を 及 ぼ す こ と が 明 ら か と な っ た ．

Galf

鎖 の 生 合 成 に 関 与 す る 遺 伝 子

20

と し て は ，近 年

galactofuranosyltransferase (GfsA)

が 報 告 さ れ て い る^{7 4 )}． 今 回 解 析 し た

Gal f

鎖 は

β-1,5

結 合 及 び

β-1,6

結 合 が 共 存 し た 構 造 と な っ て い た が ，

GfsA

に よ り 合 成 さ れ る

Galf

鎖 の 結 合 様 式 に つ い て は 未 だ 明 ら か と な っ て い な い ．

Mycobacterium tuberculosis

が 有 す る

UDP-galacto- furanosyl transferase (UGT)

は

β-1,5

結 合

Galf

及 び

β-1,6

結 合

Galf

両 転 移 酵 素 活 性 を 有 す る た め ^{7 5 )}，

GfsA

も 同 様 の 活 性 を 有 す る 可 能 性 が あ り 今 後 検 討 す る 必 要 が あ る ．

Leitao

ら ^{5 8 )}は

A. fumigatus

の

O-

結 合 型 オ リ ゴ 糖 に 抗 原 活 性 が あ る こ と を 報 告 し て い る が ，今 回 解 析 し た 構 造 に も

Gal f

鎖 が 存 在 し て い る こ と か ら 同 様 に 抗 原 活 性 を 有 す る と 考 え ら れ る ．し か し

N-

結 合 型 ガ ラ ク ト マ ン ナ ン と 比 較 す る と 糖 鎖 の 長 さ が 短 い こ と か ら ，

O-

結 合 型 糖 鎖 は

N-結 合 型 ガ ラ ク ト マ ン ナ ン に 覆 わ れ て 存 在 し て い る 可 能 性 が あ る が そ

の 立 体 的 位 置 関 係 は 未 だ 明 ら か に な っ て い な い ． そ の た め ア ス ペ ル ギ ル ス 症 の 診 断 用 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の

O-

結 合 型 オ リ ゴ 糖 と の 反 応 性 の 程 度 は 不 明 で あ り ， 今 後 更 な る 解 析 が 求 め ら れ る ．

21

第 二 章

異 な る 培 地 で 培 養 し た

Aspergillus fumigatus

の

N-

結 合 型 ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の 構 造 解 析

第 一 節 緒 論

真 菌 類 や 細 菌 類 は 細 胞 壁 を 有 し て い る が ， 特 に 酵 母 は 細 胞 壁 に 特 徴 的 な

β-

グ ル カ ン と マ ン ナ ン の 存 在 が よ く 知 ら れ て い る ． そ の 構 造 は 属 や 種 に よ っ て 異 な っ て お り ， 当 研 究 室 で は

C. albicans

，

Candida tropicalis， Candida glabrata

な ど の 細 胞 壁 マ ン ナ ン 構 造 の 解 析 が 進 め ら れ て き た 6 8 , 7 6 - 8 3 )． こ れ ら の 構 造 は 代 表 的 な 酵 母 で あ る

S. cerevisiae

と 同 様 の 櫛 型 構 造 で あ る ． ヒ ト は こ れ ら の 糖 鎖 を 有 し て い な い た め ， 抗 体 を 用 い た 感 染 症 診 断 の た め の 抗 原 と し て 利 用 し て き た ． ま た グ ル カ ン に 対 し て は

β-1,3-

グ ル カ ン 合 成 酵 素 を タ ー ゲ ッ ト と し ， 副 作 用 の 少 な い 薬 が 開 発 さ れ 用 い ら れ て い る ．

一 方 で

A. fumigatus

の ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の 構 造 は こ れ ま で に も 解 析 さ れ て い る が ，部 分 的 に 異 な っ た 解 析 結 果 が 報 告 さ れ て い る 8 4 -8 8 )．そ の 原 因 と し て ， 解 析 に 用 い た 菌 種 が 異 な る こ と や ， 異 な る 培 養 条 件 で 培 養 を 行 っ て い る こ と が 考 え ら れ る ．

Latgé

ら ^{8 8 )}は ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の 構 造 を

α-1,2

結 合 の

mannotetraose

が

α-1,6

結 合 で 繋 が っ た 直 鎖 状 の 繰 り 返 し 構 造 を し て い る コ ア マ ン ナ ン に ， 側 鎖 と し て

4-5

残 基 か ら な る

β-1,5

結 合

Galf

オ リ ゴ 糖 側 鎖 が

mannose

の

C-3

位 又 は

C-6

位 に 結 合 し た 構 造 で あ る と 報 告 し て い る

(Fig. 2-1)．一 方 Van Bruggen-Van Der

Lugt

ら ^{8 9 )}は ガ ラ ク ト マ ン ナ ン の 構 造 の 中 に

β-1,6

結 合 が 存 在 し て い る

こ と を 示 し て お り ， こ れ は

Latgé

ら ^{8 8 )}の 報 告 に は 含 ま れ て い な い 結 合 様 式 で あ っ た ．

Latgé

ら ^{8 8 )}は

A. fumigatus

の 培 養 の 際 に

YPD

培 地 を 用 い て い た が ，

Van Bruggen-Van Der Lugt

ら ^{8 9 )}は

YNB

培 地 を 使 用 し て い た ．YNB 培 地 は 酵 母 や 真 菌 を 培 養 す る た め の 代 表 的 な 培 地 の

1

つ で あ り ， 窒 素 源 と し て

(NH

₄

)

₂

SO

₄を 含 み ，

pH

は 酵 母 や 真 菌 の 成 長 の た め

22