新リン酸定量法(Ohnishi法)によるミオシンATPase活性の測定

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(1)Title. 新リン酸定量法(Ohnishi法)によるミオシンATPase活性の測定. Author(s). 浅川, 哲弥; 上田, 敦子. Citation. 北海道教育大学紀要. 第二部. A, 数学・物理学・化学・工学編, 31(2) : 77-89. Issue Date. 1981-03. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/6066. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) . 北海道教育大学紀要（第２部Ａ）第３１巻第２号. Ｍ［８１ａｒｃｈ，１９昭和５６年３月. ｌｏｆＨｏｋｋａｉｄｏＵｎｉｉｉｔＳｅｉＪｏｕｒｎａｔＩＡ）Ｖｏｌｒｔｖｅｓｏｎ（ｃｏｎｌｙｏｆＥｄｕｃａ．３１．２，Ｎｏ. ｉｉ法）によるミオシン新リン酸定量法（ｏｈｎｓｈＡＴｐａｓｅ活性の測定. 浅. 川. 哲. 弥・上. 田. 敦. 子. 北海道教育大学旭川分校化学教室. ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏＭ［ｙｏｓｉｎＡＴｐａｓｉｖｉｔｙＭ【ｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＮｅｗｅＡｃｔｌｎｏｒｇａｎｉｃＰｈｏｓｐｈａｔｅＡｓｓａｙＭ【ｉｔｈｏｄｂｙｏｈｎｅｓｈｉｅｔａＩＴｅｔｓｕｙａＡＳＡＫＡＷＡａｎｄＡｔｓｕｋｏＵＥＤＡＣｈｅｍｉｔｉｋａｗａＣｏｌｓｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｌｉｄｏＵｎｉｉｅｇｅｉｔｙｏｆＥｄｕｃａｔｖｅｒｓｏｎ，Ａｓａｈ，Ｈｏｋｋａ，Ａｓａｈｉｋａｗａ０７０. ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｎｏｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｉｏｎｒｅｐｏｒｔｅｒｍｉｌｉｔｅｄｂｙｏｈｎｉｔａｎａｔｐｈａｔｅｄｅｓｈｉｅｓａｄｖａｎｔａｇｅｏｕｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｇｍｙｏｓｉｎＡＴｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．. Ｔｈｅｍｏｓｔｉｉｎｉｌ１ゴーｐｏｒｔａｎｔａｄｖａｎｔａｇｅｏｆｔｈｉｉｏｎｓｍｅｔｈｏｄｉｓｔｈａｔｔｈｅｐｏｒｔｅｓｓｏｌｕｂｌｅｉｎｔｈｅｉｒｓｏｌｕｔｈａｔｔｈｅｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎｓｔｅｐｉｓｏｔｓｕｎｎｅｃｅｓｓａｒｙ．Ｈｏｗｅｖｅｒｉｄｉｔｙｂｙｔｈｉｅａｃｔｖｉｓｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｒｅｒｅｍａｉｎ，ｎｏｒｅｒｔｏｍｅａｓｕｒｅｍｙｏｓｉｎＡＴＰａｓｌｄｉｉｌｆｌｈｋｔｂｈｉｈｄｌｈｈｌｄｉｂｌｈｓｅｖｅｒａｃｏｎｏｎｓｗｃｓｏｕｅｃａｒｅｕｙｃｅｃｅ．ｎｔｓｐａｐｅｒ，ｗｅｅｓｔａｉｓｅｄｔｈｅｓｅｉｏｎｓｂｙｃｏｍｐａｒｉｎｇｔｔｈｅ。ｈｎｉｃｏｎｄｉｔｈｏｄｔｈｏｄｗｉｔｈｔｈｅＦｉｓｋｅ－ＳｕｂｂａＲｏｗｍｅｓｈｉｍｅ. ．. Ｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．. ｉｍｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｏｌｏｒｃｈａｎｇｅｏｆＣｓｏｌｉｏｎｕｓ１）ＴｈｅｔｉｎｇｔｈｅｏｈｎｉｉｍｅｔｈｏｄｄｉｄｎｏｔａｆｆｅｃｕｔｔｓｈｌｈｔｅｓｏｐｅｏｆＰｉｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ．ｉｉｉｍｅｗａｓｎｏｔｎｅｃｅｓｓａｒｙ．ｔ２）ＡＰｒｅｃｉｓｅｗａｎｇｔｌ３）Ｔｈｅｃｏｌｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｒ・］ーｏｌｙｂｄａｔｅｂｔｈｏｄｓｈｏｗｅｄａｓｔａｂｌｕｅｂｙｔｈｉｓｍｅｅｐｌａｔｅａｕｆｒｏｍ８ｔｏ１６ｍｉｎｕｔｅｓｌｔｓ．Ｆｒｏｍｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌ，ｗｅｓｅｔｔｅｄｏｎ１５ｍｉｎｕｔｅｓｆｏｒｔｈｅｃｏｌｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．. ｔｙｏｆｔｈｅｏｈｎｉ４）Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｉｍｅｓｈ６ｔｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅＦｉｓｈｉｍｅｔｈｏｄｗａｓｌｓｋｅ－，. ＳｕｂｂａＲｏｗｍｅｔｈｏｄ．. ５）ＴｈｅｒａｔｅｏｆｔｈｅｎｏｎｅｎｚｙｍａｉｔｉｉｏｎｏｆＡＴＰｂｙｔｈｅｒｅａｇｅｎｔｓｏｆｔｈｅｏｈｎｉｔｃｄｅｃｏｍｐｏｓｓｈｉｔｈｏｄｗａｓｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅＦｉｍｅｓｋｅ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗｍｅｔｈｏｄ．ｔｈｏｕｇｈｔｈｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆｍｏｌ６）Ａ１ｔｅｂｌｉｆｅｃｔｅｄｂｙｕｅｂｙｔｈｅｏｈｎｓｈｉｍｅｔｈｏｄｗａｓａｆｙｂｄａ. ｉｏｕｓｒｅａｇｅｎｔｓｔｉｎｅａｒｉｔｙｏｆｔｈｅＰｉｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｗａｓｍａｉｎｔａｉｎｅｄ，Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｗｅｈａｄｖａｒ，ｈｅｌ. ｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｐｉｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｆｏｒｅａｃｈｃｏｎｄｉｉｏｎｔ．. （）７７.

(3) . 浅川哲弥・上田敦子ｔｈｏｄｉｏｎｗｈｉｓｈｉｍｅｉｎＡＴｐａｓｅｒｅａｃｔｃｈＷｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｄｂｙｔｈｅｏｈｎｉ７）ＴｈｅｒａｔｅｓｏｆｍーｙｏｓｈｈｄｌｔｔｂｈＦｉｋＳｂｂＲｉｉｔｗｅｒｅｓｍａｒｏｏｓｅｙｔｅｓｅ ‐ ｕａｏｗｍｅｏ．ｉｏｎｍｅｔｈｏｄｌｄｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｏｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｔｅｒｎｉｎａｔｉｂＦｒｏｍｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓ，ｔｍａｙｅｃｏｎｃｕｅ. ｔｙ．ｌｉｉｃａｂｌｅｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｍーｙｏｓｉｎＡＴＰａｓｅａｃｔｉｖｉｒｅｐｏｒｔｅｄｂｙｏｈｎｓａｐｐｓｈｉｅｔａｌｉ. ｓｅ反応において放出されるＨ十やリン酸などを定量ｅ活性の測定方法には，ＡＴＰａミオシンＡＴｐａｓする方法があるが，現在，これらの中で，最も多く用いられている方法は，放出されるリン酸の定量による方法である．リン酸の定量には，主に３種の方法が用いられている．１）リンモリブデン酸錯体の還元により生じるリンモリブデンブルーの比色定量．. ２）リンパナドモリブデン酸錯体の黄色の比色定量．２Ｐｉ３３２Ｐ］ＡＴＰを基質として生成するリン酸（）の定量．３）［γ－，これらの方法の主なものを，表１に示した．２Ｐの定量は高感度を持ち酵素が微量でも測定ができるなどの利点の為，最近，その利用が増３，，えており，定量法にも改良が加えられている．しかし，一般に最も多く用いられているリン酸定量. ）に代表されるリンモリブデンブルーの比色量である．このＦｉ ‐ ｓｋｅ法は，Ｆｉ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法２ｓｋｅ，. ＳｕｂｂａＲｏｗ法は，極めて有用な方法であるが欠点も少なくない．そこで，表１に示された様に，多２）発色の安定性と感度１）発色を支配する要因としての酸度，温度，発色時間．（くの研究者が，（ＴＰ，クレアチ４）共存する不安定リン酸化合物３）発色阻害物質の種類とその対策．（の増大．（ンリン酸など）の分解，などの問題点について検討を加え，様々な改良法が発表されている．（表１）ｅ活性測定法は，総じて酵素反応を酸で終止し，除タンこれらの従来のリン酸定量によるＡＴＰａｓパク質操作を行ない，リンモリブデン酸錯体を形成後，還元剤を加え発色させるという一連の操作１）などではさらに有機溶媒によるリンモリブデン酸錯体の抽出操作がｉｎ‐Ｄｏｔｙ法１からなる．Ｍａｒｔ，. 加わる．従って，操作が複雑であり熟練が必要である．この複雑な操作を簡単化する試みは，６）１）Ｌｉ彼らの方法は酵素反応をＳＤＳの添加によってｌ２Ｍ行なわれた，ｌＤｕｌｅｙ２．，ｎ＆ｏｒａｅｓらによって終止し，同時にタンパク質を可溶化し，除タンパク質操作を省くというものであった．しかし，Ｓ十錯体をＤＳは，０．１～０．２Ｍ以上の濃度の一価陽イオン（Ｋ十，Ｎａなど）が存在する場合，それらと２６）形成し，沈殿を生じる．その場合，除タンパク質操作に代って除沈殿操作を必要とする．従って，ｓｅ反応の測定には利用できるが，高イオン強度低イオン強度で行なわれるアクトミオシンＡＴＰａｓｅ反応ではその利点を生かす事ができない．でのミオシンＡＴｐａｏｈｎｉ９７５年，除タンパク質操作を必要とせず，有機溶媒による抽出操作を行なわずとｓｈｉらは，１３）最近更にその方法を詳しく検討していも，高感度の測定が行なえる新リン酸定量法を発表し２，７）その中で彼らは検量線の直線性，測定用の試薬の最適濃度の決定，ＥＤＴＡの発色阻害にる２，，．対する対策，クレアチンリン酸の分解をおさえる条件の決定，阻害剤（シュウ酸ナトリウム，クエン酸ナトリウム，酒石酸ナトリウム）の阻害の様子などについて調べ，試薬濃度の異なる標準法と高感度法を挙げている．しかし，ミオシンＡＴＰａｅ反応に用いられる試薬類については全く検討されていないため，このｓｓｅ反応の活性測定に応用する為に報告では，彼らの高感度法を基に，この方法をミオシンＡＴＰａ. Ｆｉｋｅ－ＳｕｂｂａＲｏｗ法を対照に用いて，必要とされる検討を行なった．）（７８.

(4) . 新リン酸定量法によるミオシンＡＴｐａｓｅ活性の測定. 表１主なリン酸定量法略号：ＰＣＡＴＣＡＰＭＢＰＶＭＡＮＳＡ. 文献. （年）. ）ｌｉ１９２０ｌ）１Ｂｅ ‐Ｄｏｓｙ（）１９２５Ｆｉ）２ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ（ｓｋｅ３）ＫｕｔＣｈ１ｔｎｅｒ－ｏｅｎ（９２７）. ）Ｙｏｕｎｇｂｕ１９３０）４ｒｇ－Ｙｏｕｎｇｂｕｒｇ（）Ｋｉ１９３２）５ｎｇ（. ）Ｂｅｌｉ１９３８）６ｒｅｎｂｕｍ‐Ｃｈａｎ（｝ＡＩ１１９４０）７ｅｎ（）ｉ（Ｇｏｍｏ１９４２）８ｒ）Ｋｏｅｎｉ１９４２）９ｇ（. ｏ）Ｌｏｗｒｙ‐Ｌｏｐｅｚ（１９４２）ｌ１）Ｍａｉｔ１９４９）１ｒｎ－Ｄｏｔｙ（. ２）Ｔａｋａｈａｓｈｉ（１９５５）１）Ｂｅｎ１９５６ｊ）潟ａｍｉｎｓｅｎ（４）ｌＷａ１９６６ｔ（）１ａｃｈ‐Ｋａｍａｌ１５）Ｃｈｉｌｌ１９）ｇｎｅ（６６. ６）Ｌｅｃｏｃｑ‐ｈｉ（１９６６）１１ｅｓ７）Ｐｏｓ１９６７ｔ－Ｓｅｎ（）１８）ｉｉＢａｇ１９６７（ｎｓｋ）１）９Ｕｅｄａ‐Ｗａｄａ（１９７０）１２０）Ｒｏｕｆｇａｉｌ１９７１）ｓ（. １）Ｄｕｌｌ１９７５）２ｅｙ（２２｝Ｂａｉ１９７５（）ｓｏｈｎｉｉ（１９７５）凝）ｓｈ. ４）Ｃａｓｌ（１９７５）２ｓｅ５）ＬｅＤｅａｕ１９７６ｔ（）２６）Ｌｉｌ１９７７）２ｎ‐Ｍｏｒａｅｓ（. ７）１９７８ｉｏｈｎｉ（）２ｓｈ２８）Ｓｅａｌ１９７８（）ｓ. ：過塩素酸：トリクロル酢酸：リンモリブデンブルー法：リンパナドモリブデン酸錯体法：１‐アミノー２‐ナフトール‐４－スルフォン酸. 分離操作. 反応終止. Ｈ２Ｓ０４Ｈ２Ｓ０４Ｈ２Ｓ０４ＨＣＩ０４. インブタノール抽出. Ｈ２Ｓ０４ＰＣＡ. ＴＣＡ. （ヒドロキノン）ＡＮＳＡ）（. ＰＭＢ. ＳｎＣ１（）２ＳｎＣ１（）２. ＰＭＢ. （ＡＮＳＡ）. ＰＭＢ. ＳｎＣ１）（２. ＰＭＢＰＭＢ. （アミドール）（エロン）. ＰＶＭベンセン，インブタ. ノール抽出インブタノール抽出. ＰＣＡ. （還元剤）. ＰＭＢＰＭＢＰＭＢ. Ｈｃｌ。４. Ｏ酢酸ｐＨ４．. 定量法. ＴＣＡインブタノール抽出. ＰＭＢ. （アスコルビン酸）. ＰＭＢ. ＳｎＣ１（）２. ＰＭＢ. （アスコルビン酸）. ＰＶＭＰＭＢ３２Ｐ. （ＡＮＳＡ）. ＰＶＭ. ＰＣＡＰＣＡ. 酢酸ブチル抽出. ＴＣＡ. ＰＭＢ. （ＡＮＳＡ）. ＰＭＢ. （アスコルビン酸）. ＰＶＭＰＭＢＰＭＢ. （ＡＮＳＡ）（ＡＮＳＡ）. ＴＣＡＰＣＡシリコタングステン酸ＳＤＳ. クロロホルム抽出. ＰＣＡ. 活性炭吸着. ２Ｐ３. Ｈ２Ｓ０４ＳＤＳ. ＰＭＢ３２Ｐ. （塩酸ヒドロキシルアミン）. 活性炭吸着. ＴＣＡ. ＰＭＢ. ＳＤＳ. （ヒドロキノン）. ＰＶＭ. Ｈ２Ｓ０４ＳＤＳ. キシレン・インブタ. ノール抽出. ＰＭＢ３２Ｐ. （塩酸ヒドロキシルアミン）. 試薬及び実験方法［１］Ｆｉｓｋｅ－ＳｕｂｂａＲｏｗ法. 原理：ＴＣＡによりタンパク質を変性させて反応を終止させ，除タンパク質操作を行なった後，酸性条件下で，リンモリブデン酸錯体を作り，ＡＮＳＡによってそれを還元し，発色するリンモリブデンブルーを比色定量する．. 試薬：１）ＴＣＡ溶液：１０％ＴＣＡ. ）モリブデン酸アンモニウム溶液２０．７５％モリブデン酸アンモニウム（）７９.

(5) . 浅川哲弥・上田敦子. １．５Ｎ硫酸ＡＮＳＡ溶液３）：ＡＮＳＡＯ．２ｇ，亜硫酸ナトリウム１．２ｇ，亜硫酸ナトリウム１．２ｇを乳鉢で混合. 後，０．２５ｇずつ分包し，その１包を１ｏｍｌの水に溶解してＡＮＳＡ溶液とする．こ. の溶液は，令暗所に保存すると約２週間還元力を保持する．操作：試験管にＴＣＡ溶液をｌｍｌずつ取っておく．反応混液にミオシンを加え，反応を開始した後，一定時間間隔で反応液を２ｍｌずつ取り，ＴＣＡの入った試験管に加え反応を終止させる．生じた変生タンパク質の沈殿を，東洋漉紙Ｎｏ．５Ａ，中＝５．５ｃｍで除き，漉液よ０．ｌり２ｍｌを取ってモリブデン酸アンモニウム液ｌｍ１と混合する．これにＡＮＳＡ溶液，６０１０分後，６ｍｌを添加し１１ｍの波長で吸光度を測定する．操作は室温で行なう. ，. ．. ｉ［２］ｏｈｎｓｈｉ法ｅ反応を止め，同時にＰＶＰの触媒原理：硫酸酸性下（ＰＨ約２）で酵素を変性させてＡＴＰａｓ作用によってリンモリブデン酸錯体を生成させる．次に水酸化ナトリウム溶液（発色剤）. を加える事によって，アルカリ性で還元剤として作用する塩酸ヒドロキシルアミンを活性化じ，リンモリブデンブルーを発色させると同時に，変性タンパク質を可溶化させる．なおアルカリ性では，リンモリブデン酸錯体は形成されないので，発色剤添加後にＡＴＰが分解しても，そのリン酸は測定にかからない．. 試薬：１）Ａ液. ：４．４％モリブデン酸アンモニウム，Ｎａ２ＥＤＴＡＮａＯＨでｐＨを６．５に調製．. １３．３ｍＭ. ２）Ｂ液. ３００ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン. ２４０ｍＭ硫酸８％ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）３）発色剤１．７３Ｍ水酸化ナトリウムｅ反応操作：同体積のＡ及びＢ液を混合しＣ液を調製する．反応混液にミオシンを加えＡＴＰａｓ. を開始した後，一定時間間隔で反応液ｌｍｌを取り，Ｃ液ｌｍｌの入った試験管に加て反応を終止させる．発色剤０，５ｍｌを加えて１５分後に７２０１１ｍの波長で吸光度を測定する．操作は室温で行なう．なお，試薬の濃度に関して，原法を少し修正した．. ０９））により調製した濃度はビウレット法３ミオシンは，ホタテ貝閉殻筋より，浅川，矢沢，東の方法２．で求めた．試薬類としては，塩酸，尿素，エチルアルコール，ｎ ‐ブチルアルコールが和光特級，ＰＶＰが半井一級，硫酸アンモニウム，ＳＤＳが半井特製試薬，それ以外は，半井特級を用いた．. 実験結果及び考察ｉｉ法試薬（Ｃ液）調製後の時間の経過と測定値．ｏｈｎｓｈｏｈｎｉｈｉｓ法におけるＣ液（Ａ液とＢ液を等量ずつ混合して調製）は調製直後は，黄色透明な液であ. るが，室温で放置しておくと，時間経過とともに，緑色となり，１日をすぎると暗緑色となった．（）８０.

(6) . 新リン酸定量法によるミオシンＡＴｐａｓｅ活性の測定. このＣ液の呈色の時間変化はきわだっているが，原法ではあまりふれていない．そこで，このＣ液の呈色の時間変化が，ｏｈｎｉｉ法の発色に影響するか否かを調べる為リン酸の検量線をＣ液調整ｓｈ，４Ｍリン酸あたりの吸光度の変化量（△ Ａ）を求めた後，経時的に求め，１０－，図１に示した様に，Ｃ液調製直後では， △ Ａ＝０．２５７であったが調製後１２時間のうちにムＡがわずかに減少しそ，，，，の後２日ほどは一定であった従ってＣ液の時間経過による呈色は検量線の傾きにほとんど影．，，響しない事がわかった．しかし図１に示される様に定濃度のリン酸の実測値はＣ液調製後の時，，間経過とともに，上昇した為，Ｃ液の時間経過による呈色は実測値の上昇と相関すると考えられ，る。. . ＾１１０１．｝. ４０，. . ｎｗ. . ０. ０２，. １. ｄａｙ. ２. Ｉ０，. ム. ０. ２ｏｎｍの時間変図ＩＣ液調製後の △ Ａ及びＡ７. 化４Ｍリン酸あたりの検量線の１０－０：△ Ａ（傾き）５ ◎：Ａ７２ｍｍ（４×１０－Ｍリン酸の実測値）. ◎鞠◎＝◎噸』. ◎ 幽 ◎鞭. ２０. 図２. 待ち時間２分，発色時間１５分. ４０. ６０ｍｌｎ．. ＢＯ. ＩＯＯ. １２０. 発色と待ち時間の関係４Ｍリン酸の実測値０：１０－５Ｍリン酸の実測値 ◎：１０‐. 発色時間１５分. ｉ法における待ち時間と発色ｏｈｎｉｓｈ反応液とＣ液の混合によってリンモリブデン酸錯体の形成がおこるが，その為の待ち時間が必要. ３）しかしある程度多数のＡＴＰａｓｅｔ法で２分間，ＬＡＰ法で３０秒間である２である。原法では，Ｋｉ，．. 反応を同時に測定する場合，待ち時間がこの様に短いと非常に不便である．そこで待ち時間を変え５Ｍと１０４Ｍリン酸の吸光度を測定した．図２に示された様に，吸光度は，待ち時間が１２０て，１０－分以内であれば，一定であった．即ち，リンモリブデン酸錯体の生成は，直ちにおこり，その錯体２０分間は安定に存在した．そこで，厳密な待ち時間の設定は行なわなかった．は少なくとも１（８１）.

(7) . 浅川哲弥・上田敦子. 発色の時間変化ｏｈｎｉｓｈｉ法及びＦｉ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法における，発色剤又は還元剤添加後のリンモリデンブルーのｓｋｅ. ４Ｍリン酸の発色は発色剤 ‐ 発色の時間変化を調べた．図３に示された様に，ｏｈｎｉｉ法の場合，１０ｓｈ，添加後６分までは急速に増大し，．８－１６分の安定なプラトーの後，わずかずつ吸光度が減少して５Ｍ）のリ ‐ いった．さらに半日を経ると吸光度は最高時の半分近くまで減少したより低濃度（１０．ン酸では，早くプラトーに達し，安定な呈色を示す時間が長かった．以上の結果から，発色剤添加ｉ後１５分を測定時刻と定めた．ＦＳｕｂｂａＲｏｗ法では，還元剤添加後，２０分までは吸光度が増大しｓｋｅ ‐ ，その後１００分までは一定であった．巨富含. ３０，. 鯛（ーｑｏ十土Ｕ. ＥＣＯのゆく. ＾１１０１）ｎ２Ｕ. Ｑ. ０Ｉ，. ０. 図３. ｌｏ. ２０. ｍｉｎ，. ３ｏ. 発色の時間変化４Ｍリン酸の実測値０：１０‐ ‐ △：１０５Ｍリン酸の実測値４Ｍリン酸の実測値 ◎：１０‐ ＳｕｂｂａＲｏｗ法）. ４ｏ. ５０. ０. ｏ. ｉｉ法）（ｏｈｎｓｈｉｉ法）（ｏｈｎｓｈ（Ｆｉ ‐ ｓｋｅ. 図４. ２. ４. 削ふ. 叩き－. ｌｏ. ｏ. リン酸の検量線ｉｉ法 ○：ｏｈｎｓｈ ◎ ：Ｆｉｓｋｅ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法. リン酸の検量線４Ｍ）の検量線を示した両方とも図４に，ｏｈｎｉｓｈｉ法とＦｉｓｋｅ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法のリン酸（０－１０－，．. ４Ｍリン酸あたりの吸光度（△ Ａ）はｏｈｎ－ｉｈｉ法で， △ Ａ７直線性を示した．１０ｓ２。＝０．２５２であり，. Ｆｉｓｋｅ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法では △ Ａ６ｓｈｉ法の方が１．６倍ほど感度が良かった．。＝０．１５５であった．ｏｈｎｉ６. ＡＴＰの非酵素的分解実際のＡＴＰａｓｅ活性の測定では，反応液中に未分解の基質，ＡＴＰを含んでいる．このＡＴＰは酸，. モリブデン酸塩及び高温度によって加水分解される為，リン酸定量用の試薬類により非酵素的に分２）（８.

(8) . 新リン酸定量法によるミオシンＡＴｐａｓｅ活性の測定. ‐ＡＴｐａｓｅなどの解される．この為，ミオシンＭｇ. １′′. 低活性の酵素反応を長時間（３０～６０分）行なって. ○. 反応速度を求めようとする時，反応初期の測定点は，酵素反応により生じたリン酸以外に，試薬類によって非酵素的に分解されたリン酸を含むため誤差を生む要因となる．そこで，リン酸定量用の試薬によるＡＴＰの非酵素的分解の速度を調べ. △. ておく事は重要である．Ｆｉ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法でｓｋｅ. は，反応終止段階のＴＣＡ存在下と，発色前のＴＣＡとモリブデン酸アンモニウム存在下の２状ｉｉ法では，発色剤添加前の状態で，ｌ態で，ｏｈｎｓｈｍＭＡＴＰの非酵素的分解速度の温度依存性を調べた．図５に示される様に，ｏｈｎｉｓｈｉ法は，室温に. おいて，Ｆｉ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法のＴＣＡ十モリブデｓｋｅ. ン酸アンモニウム存在下より，ＡＴＰの分解速度がおそかったが，ＴＣＡ存在下よりは速かった．又，ＡＴＰの非酵素的分解速度は温度に依存し，００ｏＣで７Ｍｐｉ／ｍｉｎ以下であたが３０Ｃでは，１０－っ，. は，１０倍近くに増加した。この事から特に長時間反応を継続する場合には，反応終止の状態で氷冷しておくの事が適当である．. ｏｃ. 図５. 種々の試薬の発色に及ぼす影響ミオシンＡＴｐａｓｅ反応の反応混液は，数種の試. 薬を含んでおり，目的により他の試薬がさらに加わる事が考えられている．そこで，以下に記した. Ｔａｍｐ. ＡＴＰの非酵素的分解速度の湿度依存性ｉｉ法 △ ：ｏｈｎｓｈ. ０：Ｆｉ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法（発色前の段階）ｓｋｅ. ◎：Ｆｉｓｋｅ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法′ （反応終止段階）ｌｍＭＡＴＰ. 化合物について，それらの化合物の存在下で，ｏｈｎｉ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法の発色がどの様にｓｈｉ法とＦｉｓｋｅ. 影響されるかを調べた．一定濃度のリン酸の発色の共存する試薬の濃度依存性は，図６ａ．ｂ，ｃ．ｄ．ｅに示した調べた試薬と濃度範囲は表２に示した．。ＦｉＳｕｂｂａＲｏｗ法では，ほとんどの試薬は，発色に影響を与えなかった．（図６）－ｓｋｅ，例外的な試ＥＤＴＡ６６ｄＥＤＴＡＭ）薬は，（図，ｃ及び尿素（図，）であった。は，その濃度が１ｏｍ以上で，尿素. は，４Ｍ以上の濃度で発色を阻害した。ｉ一方，ｏｈｎ（図１，ａ），エチルｓｈｉ法では，逆に，ほとんど全ての試薬が発色に影響を与えた．ＫＣ１. ’ ｄ）は，その濃度増加に比例して，発色を増大させた．ＭｇＣ１１アルコール（図６）ｅ２２，，，尿素（図６，ＣａＣプチ６６）は，その濃度増加にともない，双曲線的に発色が増大した．（図，）ルアルコール（図，ｅａ，ｎ－Ｔｒｉｓ０（図６ｂ－ｍａｌｅａｔｅｐＨ７），，. ｉは，その濃度増加に比例して，わずかに吸光度が減少し，Ｔｒ ‐ＨＣ１ｓｂ０（図６）は，３０ｍＭ以上の濃度で吸光度が減少した．ＥＤＴＡ，ＥＧＴＡ（図６）グリセリンｃｐＨ８．，，ｄｂ６（図６）は発色をおさえたその濃度増加に伴いサ）カロース（図では２，，，，，０ｍＭまでは。ッ吸光度が減少するが，それ以上，８０ｍＭまで，吸光度は一定であった．ＳＤＳ（図６）では，発色ｃ，６～は，０２０３％に極大を持つ凸型の濃度依存性を示し硫酸アンモニウム（）では図ｅ．，，，，４％に極小を持つ濃度依存性を示した．（８３）.

(9) . 浅川哲弥・上田敦子表２. 試薬の種類と濃度範囲ｌｉｌｌｙｃｏｂｌ（：Ｅｔｈｙ ‐ ｓａｍｉｎｏｅｔｈｙｅｎｅｇ β ’ ｉｔｔＮｈＮＮＮｔ；ｅｒａａｃｅｃ） ‐ ｅｅｒ. 略号：ＥＧＴＡ. ，，. ＢＤＴＡ．. ＳＤＳｎ－ＢｔＯＨＥｔＯＨ. ｉｄａｃ．ｉｉＥｔｈｙｌｅｎｅｄａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｃｉｄａｃ．. 流酸ナトリウム：ラウリル萄：ｎ‐ブチルアルコール：エチルアルコールＡｍ．Ｓｕｌｆａｔｅ：硫し酸アンモニウム. 試. 濃度範囲. 薬. ＫＣＩ. ０－ＩＭ. ～［１ｇＣ２ＣａＣ１２. ０－ｌｏｍＭ. ＥＤＴＡ. ０－２０ｍＭ. ＥＧＴＡ. ０－２０ｍＭ. ０－ｌｏｍＭ. ＴｒｉｌＯｔ ‐ｍａｓｅａｅｐＨ７．ＴｒｉＯ ‐ＨＣ１ｐＨ８ｓ．. ０－５０ｍＭ ○ －５０ｍＭ. ＵｒｅａＳＤＳ. ０－７Ｍ０－０，５％０－６％. ｎ‐ＢｔＯＨＥｔＯＨＳｕｃｒｏｓｅＡｍ．ｓｕｌｆｔａｅ. ０－２５％０－ｌｏｏｍＭ０－５％. ｉＧ１ｒｎｙｃｅ. ０. ＩＫＣ０５，. ，. ０－１０％. １Ｍ. . 露ｑ. 一１三＝二孝０．１５. 鯛にｕヘー. ロ・Ｅ・ｑｏー，ｖ附ｎＵ. ／／ｏ・／／. ０ｌｏ．. 図６. 各試薬の発色に及ぼす影響ｉ法 ○， △， □ ：ｏｈｎｉｓｈ. ◎，. 畠，圃：Ｆｉ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法ｓｋｅ. ※対照は蒸留水を用いた．ａ（） ○， ◎：ＫＣＩ５Ｍ９Ｃ１１ａＣｒＣ２ｏ２. １０ｏ５．１０ｍＭ. ）（８４. △，畠：Ｍ【ｇＣ１２ □，圏：ＣａＣ１２.

(10) . . ｅ活性の測定新リン酸定量法によるミオシンＡＴＰａｓ. ｓＣｕｒＯ葛ｅ５０. ０ . ｒ. . Ｑ . 愈ー禽一＠－』. Ｌ二。。ー、. . △. ０５ツ，ｏ. ＥＣＯのめｑ. ０１５，. ＾ー・口ｑｏ“. ＳＯＳ０２５．. ０. ｏｏｍ闘ｌ. 馨. （ｌ. ー. Ａ. 、ムｏ０ｌ，. ｏ０ｌ，. １００５，５ｏｍＭ. １１０４０１０３０２０ＴｉｌｔＨ７ｏｉ１ｐＨ８「ｓ‐ｍａａｅｅｐｒ－ＨＣｓ「Ｔ. ０５０，０. Ｏ５Ｏ ‐ ｏ. △，盛：ＥＤＴＡ. ｉ △，金：Ｔｒｓ－ＨＣ１ｐＨ８，０Ｓ口，圃：ｕｃｒｏｓｅ２. . ４. ６. ８. □，圏：ＥＧＴＡｏ. １０. . ４ ◎ ーｖ鯛. フ. 」. ００５，. ２. ず＼. －ｏ．２. ，，. ４６Ｇ１ｉｎ「ｃａｙ. Ｈ. ｚ５ｏｏ。．. ４０．. Ａ. 感. Ａ戯ムーヂ一壱′ ｆ. 〆０′ ｙ″ ．ｒ. 』〆 △′. ＼ノ. ０．ｌ. ｒ８. 四ぬぬ虚心. ０ｌも．. . ／. ｈＥｈｌｔｌｌｏａｃｏｙ２０３０．１. ？０ ’. 。. . ５２ｏ．博. ，５，ｏＥＤＴＡ０ＴＡｒＥＧ. ｃ（） ○， ◎：ＳＤＳ. ｂ ‐ｍａｌｅａｔｅｐＨ７．０（） ○， ◎ ：Ｔｒｉｓ. . ５. １０ｌｏｌｙｏ. １２３４５ｈｌｌｏｎｔｌーＢ径に面０ｆｕｔｒＡｍＳｕｅａｙ，. ６. （ｅ） ○， ◎：エチルアルコール △，金：ｎ ‐プチルアルコール □，園：硫酸アンモニウム. ） ○， ◎ ：Ｕｒｅａ（ｄ. ｉｎ △，畠：Ｇ１ｙｃｅｒ. ）（８５. 。.

(11) . 浅川哲弥・上田敦子ｉｉ法の発色に及ぼす各試薬の影響表３０ｈｎｓｈ４ △ Ａ７２。：１０－Ｍリン酸あたりの検量線の傾き ※相関係数（ｒ）は，回帰計算で得られた直線と測定値の相関を示し，ｒ；１の場合，測定値は全て直線上にある。相関係数. 試薬（濃度）. （ｒ）. Ｂ１ｌｋａ１. ０，９９５６０．９９９８. １（凪のＫＣＭｇＣ１２（１ｏｍＭ）ＣａＣ１２（１ｏｍＭ）. ０．９９９９１，００００. ｉＴｒｌ０（５０ｍＭ）ｔｓ‐ｍａｅａｅｐＨ７．Ｔｒｉ１ｐＨ８０（５０ｍＭ）ｓ－ＨＣ．. ０，９９９９０．９９８７. ＥＤＴＡ（２０ｍＭ）. １．００００９９９６０，０．９９８９. ＥＧＴＡ（２０ｍＭ）Ｕｒｅａ（３Ｍ）. ＳＤＳ（５％）６％）ＢｔＯＨ（ ‐ ｎＥｔＯＨ（２５％）. ０，９９６００，９９９６. Ｓｕｃｒｏｓｅ（ｌｏｏｍＭ）Ａｍ．Ｓｕｌｆｔａｅ（５％）. ０．９９６００，９９９９. ０．９９９８. ｉＧ１ｒｎ（１０％）ｙｃｅ. ０，９９９８. ４Ａ７２。０，２４５. ０．２５００．２６１. ０．２３３０．２１００．２２５. ０．２０９０．２２５０．１７８０．２３９０．２５６０．２５４. ０．２１５０．１５１０．２３２. ｉｈｉ法では，その発色が，種々の試薬によって影響をうける為，次にそれぞれの試この様に，ｏｈｎｓ４Ｍリン酸あたりの傾き（△ Ａ）を調べた－薬の存在下にリン酸の検量線を求め，その直線性と，１０．. （表３）. 表３に示される様に，直線回帰計算によると各々の試薬の存在下で得られた測定値の相関係数は，１に非常に近い値であった．従って，これらの試薬の存在によって，検量線の直線性が失なわれる事はないと認められる．しかし，表３に示される様に，各試薬の存在下で求められた △ Ａは対照と. 較べてそれぞれ変化していた．特に，尿素や硫酸アンモニウムは，検量線の傾きを大きく減少させていた．. ｉｈｉ法では，その発色が様々な試薬によって影響をうけるという事がわかっ以上の結果から，ｏｈｎｓた．そこでこれらの試薬による影響を充分に考慮して検量線を作る事が必要となった．Ｆｉｓｋｅ ‐. ＳｕｂｂａＲｏｗ法では，一つの検量線を多くの条件下で使えるが，ｏｈｎｉｓｈｉ法では，それができない．そ. ｉこで，ｏｈｎｓｈｉ法では，ＡＴＰを含まない反応液と同組成の溶液を用いてリン酸の検量線を作る事に. した．この場合，たとえば，ミオシンＡＴｐａｓｅ活性のＥＤＴＡ濃度依存性を測定する為には，異なっｉｈｉ法の操作は簡単であるのたＥＤＡＴ濃度の為の検量線がそれぞれ必要になるわけであるが，ｏｈｎｓで，容易にできうる．. ミオシンＡＴｐａｓｅ活性の測定図７に，ホタテ貝閉殻筋ミオシンのカルシウムイオン感受性を測定する為に行ったミオシンＡＴｐａｓｅ反応のリン酸放出の時間変化を示した．反応の測定は，ミオシンを加えて反応を開始し，同一の反応液から一定時間間隔で，Ｆｉ１と０ｈｎｉｓｋｅ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法用，２ｈｓｈｉ法用，ｌｍｌの分画を交Ｉ. 互に取り出して行なった．従って，全く同一の反応を，両法で測定した事になる．図７の直線から（）８６.

(12) . 新リン酸定量法によるミオシンＡＴＰａｓｅ活性の測定. 得られたミオシンＡＴｐａｓｅ活性の速度は，表４に示された様に一致した．ｉｉ法は，その特微として，タンパク質を可溶化するので，除タンパク質操作を必要とせず，ｏｈｎｓｈ. －段階の操作でリン酸定量ができるという利点を持っている．さらに，その感度，再現性も良く，ＡＴＰの非酵素的分解速度もＦＳｕｂｂａＲｏｗ法と較べて速くはない，しかし検量線の傾きが， ‐ ｓｋｅ，ｉ. 様々な試薬によって影響をうける．従って，ＡＴｐａｓｅ反応の条件が異なる場合，そのつど異なった組成で，リン酸の検量線を作る必要がある．この朝こ関しては，一つの検量線が，多くの条件下でｉＳｕｂｂａＲｏｗ法の方が便利である，しかし，同一組成で反応を行なう場合は，使用できるＦ ‐ ｓｋｅ. ｏｈｎｉｓｈｉ法の方が遥かに迅速な測定が行なえる．結論として，ｏｈｎｉｓｈｉ法は，充分，ミオシンＡＴｐａｓｅ. 反応の測定に利用できる事が認められた．. ＥＥＯ鞍ＷｎＪＵ＾１．喝 ◎ １，｝. 図７. ミオシンＡＴｐａｓｅ反応の時間経過十ｏｈｎｉ ○ ：＋Ｃａ２ｓｈｉ法，，２十 ◎ ：＋Ｃａ，Ｆｉｓｋｅ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法２十ｏｈｎｉ △ ：－Ｃａｓｈｉ法，，Ｆｉｋ金：－Ｃａ２十ｓｅ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法，. 反応条件：０．ｌｍｇ／ｍｌ. ホタテ閉殻筋ミ. １オシン，０．５ＭＫＣ，２０ｍＭＴｒｉｓ ‐ｍａｌｅａｔｅｐＨ７．０，ｌｍＭＭｇＣ１Ｍ２，０．ｌｍＥＧＴＡ，ｌｍＭＤＡＴＰ土０２ｍＭＣａＣ１２，．，２５Ｃ. Ｔｉｍｅ. 表４. Ｚ十感受性ミオシンＡＴｐａｓｅ活性とＣａ２２＋＋ＡＴｐ活性（十Ｃａ））－ＡＴｐａｓｅ活性（－Ｃａａｓｅ２十感受性（％）＝Ｃａ ×１０Ｏ２十ＡＴＰａｓｅ活性（十Ｃａ）４Ｍリン酸あたりの検量線の傾き（ ※１０－ △Ａ）ｉｉ法）＝０．２６０ △Ａ７ｓｈ２ｍｍ（ｏｈｎ △Ａ６ｓｋｅ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法）＝０，１５５６ｍｍ（Ｆｉ. ◆ ｏｈｎｉｉ法ｓｈＦｉｓｋｅ－ＳｕｂｂａＲｏｗ法. ＡＴｐａｓｌｅ活性彰ｍｏ）ｅｍｇ／ｍｉｎ２＋＋Ｃａ０，０８５０，０８７. ）（８７. ２十感受性Ｃａ. ２＋－Ｃａ. （％）. ０，０６１０，０６１. ２８，２２９，９.

(13) . 浅川哲弥・上田敦子. 要. 約. ｉｉらによるリン酸定量法の新法は，操作が簡単であり高感度であるという最近発表されたｏｈｎｓｈ，. 利点を持つ．この新法をミオシンＡＴｐａｓｅ活性の測定に利用する為に，Ｆｉｓｋｅ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法を対照. として，検討を加え．次の結果を得た．ｉｉ法のＣ液は，調製後，時間経過に伴って色が変化するがこの変色はリン酸の検量線１）ｏｈｎｓｈ，. の傾きに影響しなかった．. ．２時間以内であれば厳密に規２）反応液とＣ液の混合後，発色剤を添加するまでの待ち時間は，. 定する必要はない，３）発色剤添加後の発色の時間変化は，１０４Ｍリン酸で８～１５分にプラトーを示し，その後しだいに減少する為，発色後の測定時刻を１５分後と定めた．４）リン酸の検量線から，ｏｈｎｉｓｈｉ法はＦｉｓｋｅ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法より１．６倍高感度であった．. ５）定量用の試薬によるＡＴＰの非酵素的分解はＦｉ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法よりｏｈｎｉｓｋｅｓｈｉ法の方がその速度が遅かった．６）ＡＴｐａｉｉ法の発色に影響を与えたが，ｓｅ反応液に含まれる可能性がある様々な試薬は，ｏｈｎｓｈ検量線の直線性は変化しないので，各々の条件下で検量線を作製するとよい事がわかった．７）ｏｈｎｉｓｈｉ法による実際のミオシンＡＴｐａｓｅ反応の測定結果は，Ｆｉｓｋｅ ‐ＳｕｂｂａＲｏｗ法での測定. 値と一致した．. ｓｅ活性を測定する為に利用できる事がわ，ミオシンＡＴＰａ. 以上の結果から，ｏｈｎｉｓｈｉ法は充分に. 力１った．. 本研究の遂行にあたり御校閲を賜わった本学旭川分校，東尚巳教授に深く感謝します．. 文. 献. ｌｌａｎｄＥ．Ａ．Ｄｏｉ１９２０１）Ｒ，Ｄ．Ｂｅ）ｓｙ．，ヱ βメメ．Ｃ姦の勿．，４４，５５（. １９２５）２）Ｃ．Ｈ．ＦｉｓｋｅａｎｄＹ．ＳｕｂｂａＲｏｗ，ノ βメメ．Ｃゐのれ．．，６６，３７５（１９２７ｔｎｅｒａｎｄ日．Ｒ．Ｃｏｈｅｎ３）Ｔ．Ｋｕｔ）．Ｃ膨粥．．，′ βわＺ，７５，５１７（. １９２０）４）Ｇ．Ｅ・ＹｏｕｎｇｂｕｒｇａｎｄＭ．Ｖ・Ｙｏｕｎｇｂｕｒｇ，ｅｄ．．，ノ乙の． α勿．Ｚ，１６，１５８（１９３２）５）Ｅ．Ｊひじ角ｅｍ．ノ，．Ｋｉｎｇ．，ＢＺ，２６，２９２（. １９３８）ｕｍａｎｄＥ．Ｃｈａｉ６）１ｎｏｃたｇ７兜．エ，３２．Ｂｅｒｅｎｂｌ．，丑ｉ，２８６（１１９４０）７）Ｒ．１ｅｎｏｃ勿ｇ７れ．Ｌ．ＡＩ，ノ，，，βＺ，３８，８５８（ｉＬるＣＺＺｄ２７１９４２虜Ｚ９５８）Ｇ．Ｇｏｍｏｒ）ェ α． ” ．ｅ．．，，，５（. ｉｇａｎｄＣ１９４２）９）Ｒ．Ａ．Ｋｏｅｎ２ｇ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｏｎ．Ｃ庇粥．Ａれα′ ．Ｅｄ．．，Ｅ７，１４，１５５（ＡＺＬＢ〆Ｃ膨１６２４２１１４９６１０）０．日．ＬＯＷｒｙａｎｄＪ（）！Ｏｅｚ粥Ｐ．．．．．，，，ｉ１９４９ｔ１１）１）ｎａｎｄＤ．Ｍ．Ｄｏｔｙ．Ｂ．Ｍａｒ．，Ａ”〆．Ｃ姦ｅ粥．，２１，９６５（ｉａ左堰郷左” １９５５）１２）Ｙ．Ｔａｋａｈａｓｈ．，ｓｅ，２６，６９０（. １９５６ｊａｍｉ）ｎｓｅｎａｎｄ１１３）Ｊ．Ｊｅｎｓｅｎ．，．Ｂｅｎ，Ｃ姦の兜．Ａｂ立γ ，５０，３９５２ａ（ ”Ｍｅ ” ｌａｃｈａｎｄＶ．Ｂ．ＫａｍａｔｈｄｉＥｌｔ１４）Ｄ，Ｆ，ＷｒａｌｏｎｎｚｌｍｏｏｙｇｙＥ．Ｆ．，. ｌｌＮｅｕｆｅｄａｎｄＶ．Ｇｉｎｓｂｕｒｇｅｄｓ１７２ ‐ ｓｃｐｒｅｓ．ｖｏ．８，ｐｐ１６４，Ａｃａｄｅｍｉ，ＮｅｗＹｏｒｋ. ｌａｎｄＥ．Ｔｉ１９６６ｔ）１）Ｃ．Ｆ．Ｃｈｉｎｇｎｅｌｕｓひ′ ５．Ｃゐのれ．．，ノ βぜ，２４１，５０８３（ｉ１９６６）１６）Ｊ２ α′ ｏｃねｅ粥，，Ｂｉ，，ＬｅｃｏｃｑａｎｄＧ，ｌｎｅｓ，１５，１６０（，Ａ７. （ｔｔｈｏｄｉ ’ ’Ｒ ▽▽ ＥｓｔａｎｄＡ．Ｋ．Ｓｅｎ１７）Ｒ．Ｌ．ＰｏｓｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．．ｔａｂｒｏｏｋ，Ｍｅ. ）（８８.

(14) . 新リン酸定量法によるミオシンＡＴＰａｓｅ活性の測定ｌｍａｎｅｄｓｌａｎｄＭ．Ｅ．Ｐｕｌ ‐ ７６８ｃｐｒｅｓｓ，ｖｏ．１０，ｐｐ７６２，Ａｃａｄｅｍｉ，ＮｅｗＹｏｒｋ. ｉ１８）Ｅ．Ｓ．Ｂａｆ〆ｎｓｋｉ１９６７ ” ｃ加，１５），Ｐ．Ｐ．ＦｏａａｎｄＢ．Ｚａｋ，Ｃ廟粥．Ａ，Ｃ／ｒ，１５５（，. １９７０１９）１ｏｃ勿の呪．）２α／，ＵｅｄａａｎｄＴ．Ｗａｄａ，ＢＺ，Ａ７，３７，，１６９（ｌｉＡＢ命た２０）Ｂ，Ｄ，ＲｏｕｆｇａＺ４４３２１ｓ５（９１ ” ” じｅ肌７），．，，，．ｌｌ２１）Ｊ１９７５ｅｙ），Ｒ，Ｄｕ，Ａ”〆， βわじ膨朔，，，６７，９１（. ｉ２２）Ｒ，Ｂａｓ１９７５），Ａれの， βかじ膨朔，，６８，，２７１（ｉｉ）Ｔ．０ｈｎｌａｎｄＭ．Ｌ２３ｓｈ１９７５），Ｒ．Ｓ．Ｇａｌ．Ｍａｙｅｒ． βわ湧の明．，Ａ””／，６９，２６１（ｌａｎｄＺｌｉ２４）Ｄ，Ｃａｓｓｅｌｎｇｅｒ１９７６）．Ｓｅ，βズの廟伽． βＺゆ毎ｓ．Ａｃ加，４５２，５３８（，２５）Ｊ１９７６），Ｙ．ＬｅＤｅａｕｔａｎｄｐ．Ｍａｎｄｅｌ，βＺα 膨粥毎，５８，１３９７（，Ｌｉｄ２６）Ｔ，１ＭＦＭｌＡ〆 βわ湧ｎａｎ７７ｏｒａｅｓ１０（１９７７ ” の喝）．．，．，．．，，ｉｉａｎｄＲ，Ｓ２７）ＳＧｌｌＡ／ βわ膨ｓｈ８８３４ａ７（１９７２ α ７８じ朔）．Ｔ．０ｈｎ．．．，，，．２８）ＪＡ〆ＢＺゐ１９７８ ” α ）の呪．Ｒ．Ｓｅａｌｓ，Ｊ，Ｍ．ＭＣＤｏｎａｌｄａｎｄＤ．Ｂｒｕｎｓ，，，，，９０，７８５（２９）Ｔ，ＡｓａｋａｗａＳｉＡｆＥ物‘ ｔｃのわれ３０２４９１Ｉ９８０ｅｃｏｎｌ（），ノ鼠ｏをたのめび煽り．ｑ～，，，１３Ｏ）Ｊ１ｅｙｔｔｅ１９７８ひじ虎のれ），Ｗ．Ｐｅ１，Ｃ・Ｗ・ＧａｒｎｅｒａｎｄＧ．日・Ｌｉ，Ａ”〆， β省・，８６，３４１（，. ）（８９.

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