乳酸脱 水素酵素活性測定 の精度管理
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(2) 2.3.ア. イ ソ ザ イ ム の分 析. 電 気 泳 動 法 に よ る分 析 は,パ マ ン 社,USA)の. ラ ゴ ン(ベ. ック. ア ガ ロ ー ス 泳 動 膜 を 用 い,. 100V,20分. 間 電 気 泳 動 を 行 い,Lー. 乳 酸 リチ ウ. ム を 基 質 と し て 試 薬 キ ッ トの 説 明 書 に し た が い. 3.結. 果. 3一1.各 種 酵 素 の 性 状 3.1.1.ア. イ ソ ザ イ ムの 分 析. RstearotmnnoPhim3,ヒ. ト赤 血 球,ラ. ッ ト心. 活性染色 を行 った。. 筋 のLD抽. 2.4.κm値. 電 気 泳 動 法 に よ る ア イ ソザ イ ム の分 析 を行 っ た 。. ピ ル ビ ン 酸 濃 度 を0.05,0.10,0.15,0.20, 0.30,0.60mmol/1と. そ の 結 果,RstearotmrmoPhil%sは. 変 化 さ せ 試 料 中 のLD活. 性 を測 定 し,Lineweaver‑Burkプ. LD2に. ロ ッ ト8)よ り. ピル ビ ン酸 基 質 に対 す る 塩. 値(×10‑4mol/1). 料 中 のLD活. 熱試験. と変 化 さ. 性 を 測 定 し,Arrhenius. ず れ も 最 終 濃 度2%ウ. を求 め た 。. LD活 性測定 法. JSCC常. イ ノ ス),イ. ア ト ロLQLDHレ. ー ト(ヤ. びWroblewski‑La. Due法. de. France. の イ ア トロLQLDHレ. ン),SSCC;Scandinavian Chemistry法 研 化 学)の. Society. of. の メ ル ク オ ー トLDH(関. 東 化 学),SFBC;Societe Clinique法. よ. イ プ ワ コ ー. 光 純 薬),GSCC;German. Clinical Chemistry法. ト ロ ン),. ノ テ ス ト)お のLタ. の エ ク デ イ アL"栄 各 試 薬 を使 用 し,自. Biologie トロ. of Clinical. 動 分 析 機 で測 定. トLD1,ラ. 性. Tanishimaら. 血 清 の 塩. 値 を 調 べ た 結 果,ラ. い た が,Rstearotんermψ. 3.1.4.活. ヒ ト. 値(0.57×10‑4mol/1)と. 近 似 して. んimsの1κm値(1.75×. は近似 性 を認 め なか っ た。. 性 化 エ ネル ギ ー. Rstearotmrmψhims,ヒ. トLD1,ラ. ブ ユ ニ ッ トを 阻 害 し て,LD総. 括 性. ,ラ. ッ トLD1の. ギ ー(28.4kJ/mol)は. 2.6‑3.LD活 JSCC(Japan. 性 の値 づ け Society of Clinical. 常 用 基 準 法1)に よ り,和 に依頼 した 。. ー(11. 活 性化 エ ネ ル. ヒ ト血 清(22.8kJ/mol). .OkJ/mol)は. 活 性 化 エ ネ ル ギ. ヒ ト血 清 やLD1な. Chemistry). どに比. 安 定性試験. B.stearotんerm,ophim,s,ヒ. 光純 薬株 式会社研究 所. 近似 して い. べ 小 さい 。 3.1.5熱. 測 定 法 に 準 じ測 定 し た 。. ッ トLD1. な ら び に 対 照 と して ヒ ト血 清 の 活 性 化 エ ネ ル ギ. た が,Rstearotmrmopんim3の. の 方 法10)に 従 い,1,6‑hexane‑. ッ トLD1,. ッ トLD1の1(m値(0.75×10‑4mol/1)は. お よ び ヒ トLD1(36.9kJ/mol)と. 2‑6.2.LD1活. 94. 残 存 活 性 を示 し た 。. 対 照 と し て ヒ ト血 清 の 臨. ー を調 べ た 結 果. 研"LDH‑S(栄. した。. diolでMサ. ッ ト心 筋 は92%の. ト赤 血 球 は. 3.1.3.κm値. 10上4mol/1)と. ー ト(ヤ Society. は100%,ヒ. B.stea,rotんermophilπs,ヒ. ク ア オ ー ト カ イ ノ スLDH‑J(カ. ク イ ッ ク オ ー トネ オLDJS(シ. LDH(和. コ ー. 間 加 温 後 直 に 氷 冷 し,. 性 を 測 定 し て 残 存 活 性 を 調 べ た 。B.. 50%,ラ. 用 基 準 法 と し て,LDHHRIIワ. よ び ヒ ト赤. シ ア ル ブ ミ ン を 添 加,. に10分. stea名othermopんil"sで. 活性. (和光 純 薬),ア. 精 製LDお. 血 球 溶 血 液 と ラ ッ ト心 筋 抽 出 液 の 精 製LD1(い. 375mosm)を56℃. 2.6.1.LD総. ッ ト心 筋 は 血 清 と 近. の バ ン ド を 認 め た 。(図1)。. の プ ロ ッ ト9)か ら 活 性 化 エ ネ ル ギ ー(kJ/mol). 2.6.LD活. ト赤 血 球,ラ. Rstearotmnnopんim3の. 測 定 温 度 を25,30,35,40,45℃ せ て,試. れ に対 し,ヒ. 3.1.2.耐. 性化 エネルギー. ヒ ト血 清 の. 近 い 位 置 に 単 一 の バ ン ドを 認 め た 。 こ. 似 した5本. を算 出 した 。 2.5.活. 出 液 に つ い て ヒ ト血 清 を 対 照 に し て. (い ず れ も 最 終 濃 度2%の 加,375mosm)を4℃ 6週 間 に わ た りLD活. トLD1,ラ. ッ トLD1. ウ シ ア ル ブ ミ ン を添 に 保 存 し,1週. 間 ご とに. 性 を 測 定 した。 い ず れ も.
(3) A. 図1LDア. B. イ ソ ザ イム の 電 気 泳 動 A:1ヒ. ト血 清,2ラ. B:1ラ. ッ ト心 筋LD1,2ヒ. 安 定 し た 活 性 を 示 し,ラ ヒ トLDI活. ト赤 血 球,3耐. ッ トLD1活. 性 は89%,. く平 均CVが37.7%で 性差. 測 定 で は乳 酸 基 質,ピ. 理 用 血 清 と して の コ ン ト ロ. ,2(和. 光 純 薬,ブ. ト 赤 血 球 由 来LD)に. Wroblewski‑La. 光. つ い てJSCC,. の 各 測 定 法 でLD総. 活 性 な ら び にLDI活. 性 を. 試 薬 間 に お け る 活 性 値 の 収 束 度 を調. べ た 。 ま た,ス 使 用 し,値. タ ン ダ ー ド と し て ラ ッ ト心 筋. ル ビ ン酸 基 質 の いず れ の. LD1活. 収 束 した(表1)。. 性 に つ い て み る と,フ. ァ ク タ ー測 定,. ス タ ン ダ ー ド測 定 にお いて,平 均CVが38.7% か ら9.7%に. Due法,GSCC,SFBC,SSCC. あ った。 ス タ ンダ ー ド. 試 薬 間 にお い て もば らつ きは 減 少 し,全 試 薬 問 差 は平 均CV10.4%に. タ 心 筋 由 来LD),. 酵 素 標 準 標 品 と し て の 酵 素 リ フ ァ レ ン ス(和. 測 定 し,各. ァクター測定 で は. の ば らつ きが 大 き く,全 試 薬 間 差 は さ らに 大 き. 患 者 血 清5例,管. 純 薬,ヒ. 活 性 に つ い て は,フ. 乳 酸 基 質 よ り ピル ビ ン酸 基 質 を用 い た試 薬 間 で. 種 試 薬 間 で のLD活. ー ル 血 清1. LD総. 存 活 性 を示 した 。. 度管 理への応用. 3.2.1.各. LD1を. 熱菌. 性 は94%,Rsteuotmrm伽m3LD. 活 性 は100%残 3.2.精. ッ ト心 筋. 収 束 し,LD総. が 認 め られ た が,LD総. 活性 と同様の傾 向. 活 性 に比 べ と くに ピ ル. ビ ン酸 基 質 の試 薬 間 で の ば らつ きが 顕 著 に減 少 した(表2)。. 付 け した 活 性 値 をパ ラ メ ー. タ ー に 組 み 入 れ 測 定 を 行 い,フ 収 束 度 の 比 較 も行 っ た。. ァ ク ター 測 定 と. 4‑考. 察. 乳 酸 脱 水 素 酵 素 は生 体 の ほ と ん どの組 織 に 存 臨床 化 学. 第27巻 第2号1998年6月. 95.
(4) 表1試. 薬 間 にお け るLD活 性 測定 値の変 動. n. W: Wroblewski-La. Due, G: GSCC, S: SSCC, F:. SFBC,. R=the. square. Σ √cv2/n root of i=1. 在 し,嫌 気 的 解 糖 系 の 最 終 段 階 に働 く酵 素 で あ. も 遜 色 な か っ た 。 ま た,と. る。H型. LaDue法,GSCC法,SFBC法,SSCC法. お よ びM型. の2種. ッ トよ りな る 四量 体 で,そ. の 異 な るサ ブ ユ ニ れ ぞ れ の組 み合 わ せ. か ら5種 類 の ア イ ソザ イ ム が 生 じて くる 。 これ らの ア イ ソ ザ イ ム は電 気 泳動 易 動 度,基 す る1(m値,阻. 質 に対. 害 剤 に対 す る挙 動 な ど につ い て. 異 な っ た 性 状 を示 す 。 物 理 化 学 的 に もH型. サ. ブユ ニ ッ トは高 温,低 温 に 対 す る安 定性 にす ぐ れ て い るが,M型. の サ ブ ユ ニ ッ トは低 温 に 不. く に,Wroblewski‑ な ど. の よ う に ピ ル ビ ン 酸 基 質 を 用 い,測 一 さ れ て い な い 試 薬 の 場 合 にLD1活. 定 条件 が 統 性 の ば ら. つ き の 収 束 が 著 し か っ た 。 ヒ ト血 清LDは ソ ザ イ ム の 構 成 に よ り,測 多 様 で あ る た め,そ. ア イ. 定 条 件 に よ る反 応 が. の 中 の 単 一 の ア イ ソザ イ ム. を測 定 した こ とに起 因す る も の と思 わ れ る。 し た が っ て,LD1活. 性 を指 標 と して測定 値 の施. 安定 で 耐 熱 性 に も欠 け て い る な どの 種 々 の 違 い. 設 問 差 や 試 薬 の 違 い,測. が み られ る11,12)。. す る こ との 妥 当性 が認 め ら れ た 。 と くに温 度 に. こ う した ア イ ソザ イ ムの 多 様 性 を考 慮 した 上. 不 安 定 なM型. 定 法 に よ る違 い を比 較. サ ブ ユ ニ ッ トの 含 有 量 の 多 い ア. で,酵 素 活 性 測 定 値 の 施 設 間 差 を少 な くす る 目. イ ソ ザ イ ムLD3,LD4,LD5の. 的 か ら,今. プ ル に お け る施 設 間 差 是 正 の 指 標 と して有 用 と. 回 は単 一 の ア イ ソザ イ ムLD1を. 測. 考 え る。. 定 す る こ と を試 み た。 ラ ッ ト心 筋 のLD1を 各 種 血 清 試 料 のLD総. ス タ ン ダ ー ドと して, 活 性,LD1活. 性 におけ る. と こ ろ で,LD1標. 準 物 質 と して は 温 度 に 安. 定 性 の 高 い酵 素 が 求 め られ て い る こ と は い. 試 薬 間 の 収 束 度 をみ る と,い ず れ も活 性 値 の ば. う ま で も な い 。Tanishimaら. らつ き は フ ァク ター測 定 よ り減 少 した 。 千 葉,. (Stnatimys kaponioa)のLDが. 山内 ら は ヒ ト酵 素 標 品 を用 い て,酵 素 活性 値 の. 電 気 泳 動 上 で は ヒ トLD1に. 施 設 問 是 正 を 報 告 して い る3'4)が,そ の 成 績 と. 値,活. 96. 比 率 が高いサ ン. は好 熱 性 幼 虫 耐 熱 性 を 備 え, 近 似 し て お り,.κm. 性 化 エ ネ ル ギ ー と も に ヒ ト血 清LD1に.
(5) 表2試. 薬間 にお け るLD1活. 性測 定 値の変 動. n. W:. Wroblewski-La. Due, G: GSCC, S: SSCC, F:. SFBC,. 近 い値 を示 す こ と を報 告 して い る13)。. 野 は,1)ヒ. と互 換 性 が あ る こ と,2)品. ト血 清 中 の 酵 素. 質 が 均 一 で あ る こ と,. 3)温 度 に 安 定 で あ る こ とな ど を あ げ て い る2)。 血 清 中 のLDは. 不 安 定 で 冷 蔵 保 存 で も 日々 活. 性 が 低 下 す る こ と,5種. root of Σ √cv2/n. square. i=1. LD活 性 の ば らつ きが 収 束 さ れ 施 設 問差 が 是 正. 正 確 な酵 素 活 性 値 を導 くた め の酵 素標 準 物 質 の 特 性 と して,中. R=the. の ア イ ソ ザ イ ム で構 成. され る こ とが 報 告 さ れ て い る3'5)が,中. ア イ ソザ イ ム の多 様 性 に よ り方 法 間 変換 係 数 を 用 い た と して も正 確 に変換 で きな い こ と を報 告 して い る6)。 また,小 川 らは 酵 素 標 準 物 質 中 の ア イ ソザ イ ム 構 成 比 に よ り活 性 値 に 差 が 生 ず る 問 題 点 を報 告 して お り14),ヒ ト由 来 の 酵 素 標. され て い る こ とに よ り,均 一 な 品 質 を保 持 す る. 準 物 質 を使 用 し た と して も,LD活. こ とが 困 難 で あ る 。 そ こで,ま. 差 是 正 は問 題 が 残 る こ と を指 摘 した 。. か ら耐 熱 菌,ヒ したLDを. ト赤 血 球,ラ. ず 耐 熱 性 の観 点 ッ ト心 筋 か ら抽 出. 比 較 した が,い ず れ も遜 色 は な か っ. た 。 しか し,ヒ. ト血 清 中 のLDと. う点 で は,電 気 泳 動 上,ラ. の 互換 性 とい. ッ トのLDが. ほ とん. 野 らは. 今 後,耐. 性 の施設 問. 熱 性 に優 れ るB.εtearotmrmψhims,. 好 熱 性 幼 虫 のLD,ラ. ッ トLD1な. どの 蛋 白構 造,. 遺 伝 子 配 列 の 検 索 を 進 め る と と も に,耐 熱 性 LDの 標 準 酵 素 と して の 有 用 性 を検 証 した い 。. ど同一 の ア イ ソザ イ ム パ タ ー ン を示 した。κm値, 活 性 化 エ ネ ル ギ ー につ い て も,ラ のLD1が 以 上,耐. ヒ ト血 清 のLD1と. ッ ト心 筋 か ら. 近 似 して い た 。. 乳 酸 脱 水 素 酵 素 活性 の値 づ け に ご協 力 い た だ き ま した和 光純 薬株 式 会社 に深謝 い た します。. 熱 性 で あ る こ と,単 一 の ア イ ソザ イ. ムで あ る こ と,酵 素 の性 状 が ヒ ト血 清 と近 似 し て い る こ と か ら ラ ッ ト心 筋 か ら のLD1を. 標準. 物 質 と した 。 一 方 ,ヒ ト由 来 酵 素 標 品 を用 い る こ とに よ り,. ■文 献 1) 日本 臨床 化 学 会: ヒ ト血 清 酵 素 活性 測 定 の 勧 告 法‑LD, 臨床 化学, 19: 228‑246, 1990. 2) 中野 尚美: 臨 床検 査 の標準 化, 医学検 査, 41: 1553‑1560, 1992. 臨床 化 学. 第27巻 第2号1998年6月. 97.
(6) 3) 山 内 昭 浩,. 青 木 哲 雄:. ヒ ト由 来 酵 素 標 品 に よ. る血 清 酵 素 活 性値 の 施設 間差 是 正 の実 践 的 評 価,. 医 学 検 査, 42: 38‑43,. 1993.. 別刷請 求先: 吉 国桂 子 浅 ノ川総合 病 院検 査部 〒920‑8621金 沢市 小坂 中83. 4) 千 葉 正 志: 東 京 都 立 関 連 施 設 に お け る 施 設 間 差 縮 小 の 試 み, 医 学 検 査, 46: 735‑743, 5) 丸 山 博 史,. 坂 口. 1997.. 司, 石 原 隆 一: 熊 本 県 に お. け る 施 設 間 是 正 の試 み, 医 学 検 査, 41: 983‑989, 1992. 6) 中 野 幸 弘,. 入 野 博 文,. 田 端 省 三, 太 子. 馨,. 吉 田 雅 明, 土 井 真 弓, 渡 辺 和 夫: 兵 庫 県 に お. け る 酵 素 活 性 測 定 値 統 一 化 へ の 試 み, 医 学 検 査, 42: 1898‑1905,. 1993.. 7) Hsu M, Kohler M, Barolia L, Bondar L: Separation of five isoenzyme of serum lactate dehydrogenase by discontinuous gradient elution from a miniature ion-exchange, Clin Chem, 25: 1453-1458, 1979. 8). 林. 典 夫,. 南 江 堂, 9). 廣 野 紀 子: 東 京,. シ ン プ ル 生 化 学,. 青 木 芳 和:. 酵 素 の 活 性 化 エ ネ ル ギ ー,. 技 術,. 216‑220,. 14:. p72,. 1994. 検 査 と. 1986.. 10) Tanishima K, Hayashi T, Matsushima M, Mochikawa Y: Activity of dehydrogenase isoenzymes LD1 and LD2 in serum as determined by using an inhahitor of the M-subunit, Clin Chem, 31: 1175-1277, 1985. 11) 中 村 郁 夫,. 阿 部 美 代 子, 星. 岩 雄,. 本 多 信 治: 保 存 温 度 に お け る 血 清LDH総. 富田. 博,. 活性. 値 及 び ア イ ソザ イ ム へ の 影 響 に つ い て の 検 討, 衛 生 検 査, 32: 1131‑1134,. 1983.. 12) 加 野 象 次 郎, 嵯 峨 実 枝 子: LDH, 25: 661‑667,. 臨 床 検 査,. 1981.. 13) Tanishima K, KojimaS, Li Y, Sakai A, Shimada K, Tabuchi N: Evalution of lactate dehydorogenase from the thermophilic Brachycera larva in a spa as a thermostable reference enzyme X VI Internat. Congr. Clin. Chem. 7-12 July, 1996 London, UK. 14) 小 川 善 資, 池 谷. 均,. 木 村 孝 司, 牧 瀬 淳 子, 須 郷 秋 恵,. 啓: 常 用 酵 素 標 準 物 質 41: 433‑440,. 1997.. 受 理 日:1997年10月21日 受 領 日:1998年3月17日. 98. 山 口 但 正,. 斉 藤 奈 々 子, (EMR),. 伊 藤. 臨 床 検 査,. LD1 Isoenzyme as a Marker of the Quality of Lactate Dehydrogenase Measurements Keiko Yoshikuni*, Kiyoh Tanishima**, Zou Hong**, Takayoshi Yamagishi** * Division of Clinical Laboratory , Asanogawa General Hospital, Kanazawa ** School of Health Science , Faculty of Medicine, Kanazawa University, Kanazawa Summary In order to reduce inter-assay variations in the measurement of the activities of lactate dehydrogenase (LD) in sera, we developed a technique to only measure isoenzyme LD1 in sample specimens using purified LD1 as an enzyme reference. We selected the rat LD1 isoenzyme as a reference enzyme after examing various thermostable enzymes, including those from tissue extracts of B. stearothermophilus, rat heart muscle, and human erythrocytes, and comparing their enzymic properties with human serum LD1. After measuring LD1 activities in 5 serum samples and 3 control sera using several commercially available LD assay systems as standards, we compared among the measured. the coefficient of variation activity values. When we. used LD assay systems with lactate as a substrate, we found that the inter-assay CV for the measurement of total LD and LD1 activities of these sera were 0.8-2.0% and 0.2-3.6%, respectivety. When we used pyruvate as the substrate, the CV were 5.3-7.8% and 0.7-6.3%, respectively. The interassay CV for the measurement of LD1 activities in sera were significantly smaller than that for the total LD activities in sera. Key words lactate dehydrogenase, thermostable enzyme, rat isoenzyme LD1, control survey.
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