ホルスタイン種乳牛における糖代謝関連生理活性物質の遺伝子発現の特性に関する研究

ホルスタイン種乳牛における糖代謝関連生理活性物

質の遺伝子発現の特性に関する研究

著者

小松 篤司

号

704

発行年

2005

URL

http://hdl.handle.net/10097/16257

氏 名(本 籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学 位授 与年 月 目 学位授 与 の要件,

目

題

文

論

位

学

員

委

査

審

文

論

こ ま つ と く し 小 松 篤 司 博 士(農 学) 農 第704号 平 _{成 .18年3,月2日} 学 位 規 則 第4条 第2項 該 当 ホル ス タイ ン種 乳 牛 に お け る糖 代 謝 関連 生 理活 性 物 質 の 遺伝 子発 現 の特性 に関す る研 究 (主 査)教 授:小 原 嘉 昭 (副 査)教 授 山 口 高 弘 助 教授 加 藤 和 雄 助 教授 豊 水 正 昭

論

文

内

容

要

旨

緒 論 グル コー ス はす べ て の動 物 の重 要 なエ ネ ル ギー 基 質 お よび 代 謝 基 質 で あ る。 動 物 は 、 グ ル コー ス の摂 取 ・利 用 に お け る大 き な変 動 に も関 わ らず 、血 中 グル コー ス濃 度 を一 定 範 囲 に保 つ グル コー ス ホ メオ ス タ シ ス を持 っ 。 加 え て 、誕 生 、成 長 、妊 娠 、泌 乳 な どのそ れ ぞ れ 異 な っ た 生 理 的 局 面 に対 応 す るた め に ホ メ オ ス タ シ ス 的代 謝 調 節 の設 定 点 を変 化 させ 、 比 較 的 長 期 間 に わ た っ て グル コー ス の変 化 を維 持 す る機 構(ホ メ オ レー シス)が 備 わ?て い る 。 反 甥動物 にお ける炭水化物代謝 の大 きな特徴 の1つ は、消化管 か らゲル コース の形 でほ とん ど吸 収 され な い 点 に あ る。 これ は飼 料 中 の炭 水 化 物 が第1胃 内 で微 生 物 に よ り揮 発 性 脂 肪 酸(SC:FA)に 発 酵 され るた め で あ る。一 方 で 泌 乳 時 の ミル ク基 質供 給 とい っ た エ ネ ル ギ ー供 給 の 面 で 反 籾 動 物 は非 反 鯛 動 物 に 匹敵 す る ほ どの グル コー ス を 消費 して お り_{、 内 因性} の グル コー ス は 主 と して 肝 臓 にお け る糖 新 生 に依 存 して い る。 この た め 、反 稠 動 物 の 各組 織 で は イ ンス リン に よる グル コー ス の取 り込 み を抑 制 す る、 い わ ゆ るイ ン ス リン抵抗 性 と い っ た グル コー ス 消 費 を節 約 す る仕 組 み が働 い て い る と考 え られ る。 そ の グ ル コ ー ス の 細 胞 内 へ の 取 り込 み は グ ル コ ー ス トラ ン ス ポ ー タ ー(Glucose Transport叫GLUT)を 介 す る機 構 に よ って行 わ れ る。GLUTに はイ ンス リン刺 激 の制 御 を 受 け な いGLUT1や 、イ ン ス リン の刺 激 に よ って 細胞 膜 表 面 に移 動 し作用 す るGLUT4な どが あ る。 反 鯛 動 物 の グル コー ス 代謝 や 糖 尿 病疾 患 の 特徴 で あ るイ ンス リン抵 抗 性 の充 進 とは 、脂 肪 や 筋 肉 な どのイ ンス リン感 受 性 組 織 に お い てGLUT4に よる グル コー ス取 り込 み を抑 制 させ る こ とに よ る もの で あ る。 しか しな が ら反 鯛 動 物 に お い て は イ ンス リン抵 抗 性 を は じめ とす るグル コー ス ホ メ オ ス タ シ スや ホ メ オ レー シ ス にっ い て は十 分 に は 解 明 さ れ て い ない 。 生体 の エ ネ ル ギー 代 謝 はエ ネ ル ギー 摂 取 量 と消 費 のバ ラ ンス に よ っ て成 り立 つ が 、 生 体 の エ ネル ギー ベ ラ ン ス を調 節 す る重 要 な シ グナ ル の1っ が 、 体脂 肪 の増 減 に あ る。 加 えて 脂 肪 組 織 は 多彩 な ホル モ ンや サ イ トカ イ ンな どの 生理 活 性 物 質(ア デ ィポ カ イ ン)を 分 泌 す る生 体 最 大 の 内分 泌 器 官 と言 え る もの で あ り、 アデ ィポ カ イ ンは エネ ル ギ ー バ ラ ン ス、

免疫及 びイ ンス リン感 受性 の変化 に関与 してい る と考 え られ てい る。 このた め、イ ンス リ ン抵抗性 の高い反 稠動物 で も脂肪組織 が内分泌器官 と して積極 的に関与 してい る可能性 が 考 え られ る。反鯛 動物の脂肪組織や 筋肉でのイ ンス リン応答性 の低 下 は、糖新生 に依存 し てい る貴重 な グル コース の利 用 を節約す るのに役立 っている。 その節約機構 を最大限 た発 揮 した ものが泌乳 である と考 え られ る。 泌乳 は、乳腺組織 において グル コー スをは じめ とした栄養素 の供給 をも とに、乳腺で乳 ・_{汁が合成 され分泌 され る とい う複雑 な生理現象 であ る。産乳 量を決 定す る重要 な因子 の1} つ は乳腺 にお け る乳糖合成 量で あるため乳糖構成成分 のグル コー スの乳腺への流入が重要 となって くる。代謝 の設 定点 を変更す るホメオ レー シスによって乳腺 への グル コース供 給 が多 くなるが、グル コー スの受 け手 となる乳腺側 のGLUT機 能 の変化 について は不明の点 が多い。 そ こで本研究で は、反稠動物 にお けるグル コー スホ メオス タシス及び ホメオ レー シスの 特異性は脂肪組 織 に依存 してい る との仮 説 を立て覧その一端 を解 明す る 目的 で、 レジスチ ンやアデ ィポネ クチ ンな どのイ ンス リン抵 抗性 に関与す るアデ ィポカイ ンやGLUTな ど の糖代謝 関連遺伝子 の発 現特異性 を追究 した。 第一章 では反鯛 家畜では未だ存在が 明 らか に され てい ない レジスチ ンの存在 を検 索 し、 更 に黒毛和種及び ホル スタイ ン種去勢牛 にお ける脂肪 中のTNF、GLUT1と いった糖代謝 に関連 した遺伝子 の発現調節 の特異性 を明 らかにす る。第二章で は泌乳最盛期 、後期 、乾 乳期 のホルス タイ ン種 の脂肪組織 においてアデ ィポネ クチ ンな ど糖代謝 に関連 した遺伝子 の発 現調節 を明 らか にす るこ とで栄養 素蓄積 としての脂肪 、内分泌組 織 として の脂肪 の特 徴:を明 らかにす る。 第三章で は節約 され たグル コー スの受 け手 となる乳腺組 織での糖代謝 に関連 した遺伝子 の発現調節 を明 らかにす るこ とで泌乳後期 に向かって減少す る泌 乳量調 節 のメカニズム を明 らか にす る。 これ らの研 究成果 か ら反稠動物 で あるホル スタイ ン種乳 牛の糖代謝 の特徴 を考察す る。

第1章 黒 毛 和 種 牛 とホル スタイン種 牛 のグル コース代 謝 制 御 システムの差 違 黒 毛 和 種 牛 とホル ス タイ ン種 牛 は 同 じ反 甥 動 物 種 で あ りな が ら育種 改 良 の結 果 、黒 毛 和 種 牛 は 肉 生 産 とい う同化 的 ホル モ ン の作 用 が 強 い 動 物 に 、 ホル ス タイ ン種 牛 は乳 生 産 とい う異 化 的 ホル モ ンの 作 用 が 強 い 品 種 に改 良 され て き た。 また 、黒 毛和 種 牛 は脂 肪 交雑 に優 れ て い る。 これ らの 品種 間差 に は イ ンス リン を は じめ とす る グル コー ス代 謝 に 関 連 したホ ル モ ンやG:LUTな どの生 理活 性 物 質 の特 性 が 関与 して い る と考 え られ る。特 に脂 肪 か ら分 泌 され る アデ ィ ポ カ イ ンは イ ンス リン感 受性 の 変 化 に深 く関 わ っ て い る こ とが指 摘 され て い る こ とか ら、 これ らホル モ ン に着 目 して研 究 を行 っ た。 レジ ス チ ン は筋 肉や 脂 肪 組 織 に 作 用 しイ ンス リン抵 抗 性 を充 進 させ る こ とが 報 告 され て い る。 ま た 、TNF一 αも 同様 に イ ン ス リン抵 抗 性 の尤 進 作 用 や 、 抗 炎 症 作用 な ど多様 な機 能 を有 して お り、反 編 動 物 にお い て イ ン ス リン抵 抗 性 を充 進 させ る こ と も指 摘 され て い る。 本 章 で は 肥 育 され て い る黒 毛 和 種 去 勢 牛 とホル ス タイ ン種 去 勢 牛 の 内臓 脂 肪 を採 取 し、 グル コー ス代 謝 に関 わ る これ ら因子 の発 現 量 の測 定 と血 漿 中 ホル モ ン 、及 び 代 謝 産 物 濃 度 の 測 定 を試 み た。25∼28カ 月齢 の 黒 毛 和 種 及 び ホル ス タイ ン種 去 勢 牛 そ れ ぞ れ5頭 を供試 し、腹 腔 内 よ り内臓 脂 肪 を採 取 し、 totalRNAを 抽 出 した。 ウシ レジ スチ ン と相 同性 の高 い遺 伝 子 を検 索す るた め に 、 ヒ トレジ スチ ン と相 同性 の 高 い ウシEST配 列 を検 索 し、得 られ た 配列 か らプ ライマ ー を設 計 し、RACE法 にて 配 列 を決 定 した。得 られ た ウシ レジ ス チ ン の配 列 は 、他 の動 物 と比 較 して70∼80%の 相 同 性 を示 し た(表1)。 レジ ス チ ン 、TNF一 α、G:LUT1、 及 びGH:RmRNAの 発 現 量 の 測 定 は それ ぞれ に対 す る プ ライ マ ー を設 計 して リアル タイ ムPCR法 に よ って行 っ た。レジ ス チ ンの 発 現 量 は黒 毛 和 種 牛 に 比 べ て ホル ス タイ ン種 で6倍 以 上 高 い 結 果 とな った(図1左)。 一方 でTN:F・ αの発 現 量 は 、黒 毛和 種 牛 の 方 が ホル ス タイ ン種 牛 に比 べ て有 意 な差 で は な か った もの の 高 い 傾 向 で あ った(図1右)。 ま た 、GLUT1の 発 現 量 は両 品種 間 で違 い は 見 られ な か っ た もの の 、 GHRの 発 現 量 は黒 毛和 種 牛 で2倍 以上 高 か っ た。 血 中代 謝 産 物 濃…度 はNEFA、 グル コー ス 、 と もに 両種 の 間 に明確 な違 い は 見 られ な か っ た(表2)。 ま た 、 血 漿 中 ホル モ ンで あ る

GH、 イ ン ス リン濃 度 に も明確 な違 い は見 られ なか っ た(表2)。 以 上 の結 果 は 黒 毛和 種 とホ ル ス タイ ン種 去 勢 牛 で は脂 肪 で合 成 され た レジス チ ンやTN:F一 αの発 現 の違 い が脂 肪 交 雑 を は じめ とす る グル コー ス代 謝 に変 化 を もた らす こ とを示 唆 す る もの で あ る。 第2章 泌 乳 牛 の脂 肪 組 織 にお けるグル コース代謝 制御 システムの特 徴 前 章 の結 果 よ り、 同 じ ウシ で あ って も同化 作 用 の強 い 黒 毛 和 種 牛 と異 化 作 用 の 強 い ホル .スタ イ ン種 牛 で は脂 肪 か ら分 泌 され る ホル モ ン の発 現 に違 い が あ る こ とが示 され た 。 この こ とは ホル ス タイ ン種 乳 牛 に お い て も、 泌 乳 に よ って 起 こ るイ ン ス リ ン抵 抗 性 の充 進 をは じめ とす る グル コー ス代 謝 の変 化(ホ メ オ レー シ ス)に 対 して もアデ ィ ポ カイ ンや 生理 活 性 物 質 の発 現 の 変 化 が 影 響 して い る可 能性 が 考 え られ る。 グル コー ス 代 謝 に影 響 の あ るア デ ィポ カ イ ン と して は イ ン ス リン抵 抗 性 を充 進 させ る レジ ス チ ン、 イ ン ス リン抵 抗 性 を低 下 させ るア デ ィポ ネ クチ ン 、摂 食 や エネ ル ギ ー代 謝 に 関 わ る レプ チ ン等 が 上 げ られ る。 ま た 、脂 肪 組 織 は栄 養 素 蓄 積 器 官 と して の機 能 を持 つ こ とか ら細 胞 内 に存 在 す るGLUT1や GLUT4な どの グル コー ス代 謝 に関連 した 物 質 もそ の発 現 や 機 能 が大 き く変 化 して い る こ とが予 想 され る。 そ こで 、本 章 で は ホル ス タイ ン種 乳 牛 の乳 量 の変 化 に は ア デ ィポ カ イ ン に よる 内分 泌 の 変 化 や グル コー ス代 謝 の 変 化 が 大 き く関 わ って い る との仮 説 を立 て た。 こ こで は泌 乳最 盛 期 、 泌 乳 後 期 、及 び 乾 乳期 の ホル ス タイ ン種 泌 乳 牛 を用 い 、 それ ぞれ の脂 肪 組 織 で レジ ス チ ン を は じめ とす るアデ ィポ カ イ ンや 、GLUT1を は じめ とす る細 胞 内生 理 活 性 物 質 の発 現 に どの よ うな変 化 が起 こっ て い る か を検 討 した。 ホル ス タイ ン種 乳 牛 、'泌乳 最 盛 期(分 娩 後8-11週)、 泌 乳 後 期(40・50週)、 乾 乳 期(乾 乳 後3-11週)を それ ぞ れ4頭 ず つ 供 試 し、腹 腔 内 内臓 脂 肪 を採 取 し、液 体 窒 素 に保 存 後total RNA及 び タ ンパ ク質 を抽 出 した。 ま た 、屠 殺 当 日の 朝 に採 血 を行 った。 レジス チ ン、ア デ ィ ポ ネ ク チ ン 、 レ プ チ ン 、G:LUT1、GLUT4、G:LUT12、PPARγ2、G且RのmRNA発 現 量 測 定 は それ ぞれ に 対す るプ ライ マ ー を設 計 し、リア ル タイ ムPCR法 にて 行 っ た。G:LUT1 タ ンパ ク質 発 現 量 は ウェ ス タ ンブ ロ ッ ト法 に て行 っ た。 ま た 、GH:及 び イ ン ス リン濃 度 の 測 定 はRIA法 に て行 っ た。

ウェス タ ンブ ロ ッ ト法 に よ る脂 肪 組 織 中のG1」UT1タ ンパ ク質発 現 量 は泌 乳最 盛 期 で は 発 現 が ほ とん ど見 られ な か っ た の に 対 し、泌 乳 後 期 及 び 乾 乳 期 で は 同程 度 の発 現 が確 認 で きた(図3上)。 ま た 、 リアル タイ ムPCR法 に よ る 皿RNA発 現 量解 析 で も、泌 乳 最盛 期 と 比較 して 泌 乳 後 期 及 び乾 乳 期 で有 意 に 高 い結 果 が得 られ た。 ま た、 泌 乳 後 期 と乾 乳 期 で は 有 意 な差 は 見 られ な か っ た(図3下)。 イ ンス リン依 存 性 のG:LUT4の 発 現 量 は3つ の試 験 区 で有 意 な差 は 見 られ な か っ た(図4左)。 同様 にイ ンス リン依 存 性G■UT12の 発 現 量 も有 意 な差 は 見 られ な か っ た(図4右)。 一 方 、 レジ ス チ ン のmRNA発 現 量 は泌 乳 最 盛 期 、泌 乳 後 期 で乾 乳 期 に比 べ て有 意 に高 い値 とな っ た(図5左 〉。 レジ ス チ ン とは異 な り、 アデ ィポ ネ クチ ン の発 現 量 は泌 乳 最 盛 期 、泌 乳 後 期で 乾 乳 期 に比 べ て有 意 に低 い 値 とな っ た(図5右)。 ま た、 レプチ ン(図6)及 びPPARγ2mRNA発 現 量 は 乾 乳;期に比 べ て泌 乳最 盛 期 で 有 意 に低 い値 とな った(図7右)。GHRの 発 現 に は違 い は見 られ な か っ た(図7左)。 血 漿 中ホル モ ン で あ るGHは 濃 度 に違 い は見 られ なか っ た が(図8右)、 イ ンス リンの濃 度 は 乾 乳期 に 有 意 に 高 い濃 度 にな った(図8左)。 以 上 の結 果 よ り、 ホル ス タイ ン種 乳 牛 で は泌 乳 期 に脂 肪 組 織 や イ ン ス リン感 受 性 組 織 で の グル コー ス利 用 を抑 制 す る た め にイ ン ス リン非 依 存 性 の G:LUT1は 発 現 量 に よ って 調 節 され 、イ ンス リン依 存 性 のGLUT4の 発 現 は変 化 せ ず 、 レ ジス チ ン 、 ア デ ィポ ネ クチ ン、 レプ チ ン を 中心 と した ア デ ィポ カ イ ンの分 泌 や イ ンス リン 濃 度 を変 化 させ る に よっ てイ ンス リン抵 抗性 を調 節 して い る可 能 性 が 示 唆 され た。 第3章 泌乳牛 の乳腺組織 におけるグル コース代謝制御システムの特徴 前 章では泌 乳牛の乳期が変 わる と脂肪組織 ではアデ ィポカイ ン、細胞 内生理活性物質 に 劇的 な変化 が起 こ り、グル コー ス代謝 を変化 させ て脂肪組織 や筋肉で グル コース利 用 を抑 制 してい ることを示 唆す る結果 を得 た。 一方で乳生産 量には脂肪や筋 肉で節約 され た グル コースの乳腺へ の供給量 が重要 であ るが、同時 に乳腺組織 はグル コー ス供給量 に見合 うだ けの生理機 能 を保持 し続 けなけれ ばな らない。 また、乳腺組 織 自体が レプチ ン等 のホルモ ンを産 生 してい るこ とも報告 されて い るが、 これ らの発 現動 態 と乳量の関係 は不明の まま である。 また、乳腺組織はイ ンス リン非感受性組織 と言 われ てい るが、乳腺 上皮細胞 の培

養 の際 に はイ ン ス リン は必 要 と され て い るが 乳腺 に お け るイ ンス リン とグル コー ス代 謝 と の 関連 は 明 らか に され て い な い。 これ ら問題 の解 決 の た め に 、 レジ ス チ ン及 び レプ チ ン等 の ホル モ ンやG:LUT1を は じめ とす る細 胞 内生 理 活 性 物 質 の発 現 量 を測 定 した。 ホル ス タ イ ン種 乳 牛 、泌 乳 最盛 期(分 娩 後8-11週)、 泌 乳 後期(40-50週)、 乾 乳 期(乾 乳 後3・11 週)を それ ぞ れ4頭 ず つ供 試 し、屠殺 後 直 ちに乳 腺 組 織 を採 取 し、液 体 窒 素 に保 存 後total RNA及 び タ ンパ ク質 を抽 出 した。 レジ ス チ ン 、 レプ チ ン、GL、UT1、GLUT12、PPA:Rγ2、 .GHRのmRNA発 現 量 測 定 は それ ぞれ に対 す るプ ライ マ ー を設 計 し、 リアル タイ ムPCR 法 に て行 っ た。G:LUT1タ ンパ ク質 発 現 量 は ウェス タ ン ブ ロ ッ ト法 に て 行 っ た。 乳 腺 組 織 中 のG:LUT1タ ンパ ク質 発 現 量 は脂 肪 組 織 とは 逆 に泌 乳 最 盛 期 と泌 乳 後 期 で 高 い値 を示 し、 乾 乳 牛 で 減 少 してい た(図9上)。 同様 にmRNAの 発 現 量 も乾 乳 期 に比 べ て泌 乳 最 盛 期 と 泌 乳 後 期 で 高 い 値 で あ った(図9下)。 ま た 、乳 腺 中 にG:LUT12の 発 現 を確 認 し、乾 乳 期 で 発 現 量 が3倍 以 上 高 い値 とな った(図10左)。 ま た 、脂 肪 組 織 と同様 に レジ スチ ン が発 現 して お り、泌 乳 期 に 比 べ 、 乾 乳 期で2倍 以 上 高 い 値 とな った(図12右)。 一 方 で レプチ ン (図12左)、PPA:Rγ2(図10右)、G且R(図11)の 発 現 量 に有 意 な差 は 見 られ な か った 。 以 上 の結 果 よ り泌 乳 期 で の 乳 腺 組 織 にお け るグル コー ス取 り込 み は 、 主 に イ ンス リン非感 受 性 のG:LUT1の 発 現 量 に よ っ て変 化 す る こ とが 示 唆 され た。 また 、 乾 乳 期 の 乳腺 組 織 で G:LUT12の 発 現 が増 大 し、更 に レジ スチ ン の発 現 の 変化 が 見 られ た こ とか らG:LUT4と は 異 な る新 規 の イ ンス リン に関係 した グル コー ス 取 り込 み 機 構 の存 在 が 示 唆 され た。 第 四章 総 括(図11参 照) 動 物 は血 中 グル コー ス濃 度 を一 定範 囲 に保 っ グル コー ス ホ メ オ ス タ シ ス に加 え、異 な っ た 生 理 的 局 面 に対 応 す る た め に ホ メ オ ス タ シス 的代 謝 調 節 の 設 定 点 を変 化 させ 維 持 す る機 構 ・ホ メ オ レー シ ス が 備 わ っ て い る 。 グ ル コー ス の 細 胞 内 へ の 取 り込 み はGLUTと イ ン ス リン感 受 性 の変 化 に よっ て 決 ま る。 反 鯛 動 物 は必 要 な グル コー ス の ほ とん ど を肝 臓 にお け る糖 新 生 で ま か な っ て い る とい う大 きな 特 徴 が あ り、'各組 織 で はイ ンス リン抵 抗 性 とい っ た グル コー ス の 消費 を節 約 す る仕 組 み が働 く。

脂 肪 組 織 は アデ ィ ポ カ イ ン を分 泌 す る内分 泌 器 官 で もあ り、 エ ネ ル ギー バ ラ ン ス 、免 疫 及 び イ ンス リン抵 抗 性 に 関 与 して い る と考 え られ て い る。体 研 究 で は、 反 稠 動 物 に 特 異 的 な グル コー ス ホ メオ ス タシ ス の 一 端 を解 明 す る 目的 で 、 レジ ス チ ン な どのイ ン ス リ ン抵 抗 性 に 関与 す る アデ ィ ポ カ イ ンやGLUTな どの糖 代 謝 関連 生 理 活 性 物 質 遺伝 子 の発 現 特 異性 を逼 究 した。 ホ ル ス タ イ ン種 と黒 毛 和 種 去 勢 牛 で は脂 肪 組 織 にお け る レジ ス チ ンの発 現 は ホ ル ス タイ ン種 牛 で 高 く、TNF一 αの発 現 は黒 毛 和 種 牛 で 高 か っ た。 これ は 異化 作 用 の 強 い ホ ル ス タイ ン種 牛 の グル コー ス 代 謝 に は レジ ス チ ンが 、 同 化 作 用 の 強 い 黒 毛 和 種 牛 の グル コー ス 代 謝 に はTN:F一 αが 関 与 して い る こ とを示 唆 す る もの で あ り、ま た 、 これ らの結 果 は反 鋼 動 物 の グル コー ス代 謝 に脂 肪 組 織 が 深 く関与 す る こ と を示す もの で あ る。 更 に 、泌 乳 最 盛 期 で の 脂 肪 組 織 で はG:LUT1の 発 現 量 が 減 少 す る結 果 を得 た 。 一 方 で泌 乳 最 盛 期 に レジ ス チ ンの 発 現 量 が 高 く、 アデ ィポ ネ クチ ンや レプ チ ン の発 現 量 が低 い結 果 とな った。 これ らは泌 乳 期 に お い て グル コー ス を乳腺 以外 の組 織 で 節 約 させ る た め に 、脂 肪 組 織 が 中心 とな っ てイ ン ス リン抵 抗性 を充 進 させ 、乳 腺 へ の グル コー ス 供 給 量 を増 加 させ て い る こ とを示 唆 す る も の で あ る。 ま た 、 泌 乳 期 に お い て グル コー ス利 用 の主 要 組 織 とな る乳腺 組 織 で も、 そ の機 能 に 大 き な 変 動 が 認 め られ た。GLUT1の 発 現 量 は泌 乳 最 盛 期 と泌 乳 後 期 で 高 か っ た が 乾 乳期 で は ほ とん ど発 現 が 見 られ な か った 。 一 方 でGLUT12の 発 現 量 は乾 乳 期 で高 い もの で あ っ た。 更 に 乳 腺 組 織 で の レジ ス チ ンの発 現 が確 認 され 、乾 乳 期 で高 い結 果 とな っ た。 これ らの結 果 は泌 乳 期 の 乳 腺 に お け る乳 生 産 の 能 力 がG】 」UT1を は じめ とす るイ ンス リン非 依 存 性 の グル コー ス 取 り込 み に左 右 され る と同 時 に 、乾 乳 期に お け るイ ン 冬 リン に 関係 した グル コ ー ス 取 り込 み 機 構 の存 在 を示 唆 す る もの で あ っ た_。 本 研 究 で 明 示 した ホ ル ス タ イ ン 種 去 勢 牛 及 び 泌 乳 牛 の グ ル コ ー ス 代 謝 に 関 す る 特 異 性 は 主 に脂 肪 に主 点 が お か れ た もの で あ り、 反 稠 家 畜 の糖 代 謝 の種 特 異 性 を解 明 す る上 で新 た な視 点 を加 え た こ とに な ろ う。 ま た 、 ホ ル ス タイ ン種 の糖 代 謝 は乳 生 産 に密 接 に 関連 す る もの で あ るた め乳 生産 性 の向上 を追 求 す る上 で極 めて重 要 な 情 報 を提 供 す る もの で あ る。

表1.ウ シ レジスチ ンmRNA及 び アミノ酸 配列 の他 動 物 との比 較 Ideo批y(%) ... DDBJ/E.M..BVGe..n.Ba.nl Nucleotide . Aminoacid Accessionnumber … Bovine一 ■ _AB117718 Porcine88.0

_う

80.2 AY488504 H㎜an・83。5 73.6 AF323U81 Mouse80.0 57.1 BCO51196 Rat73.3 58.1 AF378366 00 00 00 00 00 00 00 00 0 8 7 6 5 4 3 2 1 < Z に ∈ = O 匹 く O 、 < Z = ∈ C 逐 ω 2 ㈱ 切 伽 ⋮ ⋮ 80 60 40 20 < Z 匡 ∈ 工 O 低 く O 、 < Z 匡 ∈ F ↑ ⊃ ﹂ O 0 '喪 誤 r央 窄40 Qz120 E =100 0 瑳80 C7 ミ60歪 ⑳ E 20 Z ￣O JapaneseBlackHolsteinJapaneseBlackHolstein 図1。 黒 毛 和 種 及 び ホ ル ス タイン種 去 勢 牛 の 脂 肪 組 織 中 に お け るレジ ス チ ン(左)及 びTNF一 α(右)発 現 量 の 比 較 GAPDHに 対するそれぞれの発現量を示し、黒毛和種における値を董00としたときの ホルスタイン種の値を算出した。各値 は平均 値 ±標 準誤 差(n冒5)で表示 。 *:p<0.1,**:pく0.05で 有意 差があることを示 す。 需 索 40 20 00 80 60 40 20 1 1 1 < Z 匡 ∈ エ O α < O 、 < Z 匡 E に エ O 0 1 「 畳 一 一

JapaneseBlack Holstein Japanese副ack Holstein

図2.黒 毛 和 種 及 び ホル ス タイ ン種 去 勢 牛 の 脂 肪 組 織 中 に お け るGLUT1(左)及 びGHR(右)発 現 量 の 比 較

GAPDHに 対するそれぞれの発現量を示し、黒毛和種における値を100としたときの ホルスタイン種の値を算出した。各 値 は平均値 ±標 準誤差(n=5)で表示。 **:p〈0.05で 有意差 があることを示 す。

表2.黒 毛 和 種 及 び ホル スタイン種 去 勢 牛 にお け る血 漿 中 代 謝 産 物 及 び ホル モ ン濃 度 JapaneseBlack Holstein NEFA(mEq/L) 874.0ｱ279.3 896.3ｱ354.5 蓬 NS 博 Glucose(mg/dL) 100.7ｱ13.40 100.7ｱ12.0 NS GH(ng/mL) 2.075ｱ0.859 2.164ｱ0,45NS _一 一一㎜}一 巴 NS iInsulin(μU/mL・) 40.8肇 ± 霊9.03 32.92ｱ8.23 5 PeakLateNon-lactatinglactatinglactating 軽 ・ほ 馳嘗;・ ・   纏 、、ご乱 兼 隷 廊.噸42kDa Q 差100 ∈90 舌80 隻70 C760 50 歪40 E30 F20ヨ 10 0 図3.異 な る泌 乳 期 の 脂 肪 組 織 中 にお けるGLUT1タ ンパ ク質(上) 及 びmRNA(下)発 現 量 の 比 較 GAPDHに 対 す るそれ ぞ れの 発 現 量:を示 し、 泌 乳 最盛 期 にお ける値 を100としたときの それ ぞれ の 値を算 出した。各 値 は 平 均 値 ± 標 準 誤 差(n=4)で 表 示 。 a,b;異 な る文 字 は 有 意 差(pく0.05)が あることを 示 す 。 PeakLateNon-lactatinglactatinglactating 0 0 0 0 0 0 0 2 0 8 6 4 2 り り く Z 匡 ∈ エ O 氏 く O 、 < Z α E 寸 ﹂、 ヨ O 0 0 0 0 0 0 5 0 5 0 5 2 2 1 1 < Z 匡 Φ ∈ 8 B = 、 < Z 匡 ∈ 摯 ト ヨ O T 一

團1一

麟{灘 ㈱ll牒 輿羅 PeakLateNon-PeakLateNon-lactatinglactatinglactatinglactatinglactatinglactating 図4.異 な る泌 乳 期 の 脂 肪 組 織 中 に お け るGLUT4(左)及 びGLUT12(右)発 現 量 の 比 較 GAPDHま たはリボソームに対するそれぞれの発現量を示し、泌乳最盛期における値を100としたときの 'そ れぞれの値 を算:出した_{。各値 は 平均 値 ±標 準 誤 差(n=4)で表 示。}

20 00 80 60 40 20 0 り   < Z 匡 ε = O ﹂ < O 、 < Z に E ξ ω 葱 ﹂ a 一 a 一 蠣翻1棚鵬 ill.i酬.醐旭b ■隈.■.

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PeakLateNon-lactatinglactatinglactating 0 0 0 0 G O O O 5 0 5 C 5 ヨ   ク ロ り り く Z 匡 Φ E O 8 ￡ こ く Z 匡 ∈ ε ち Φ ⊆ O 書 PeakLateNon-lactatinglactatinglactating 図5.異 なる泌 乳 期 の脂 肪 組 織 中 にお けるレジスチ ン(左)及 び アデ ィポネクチン(右)発 現 量 の比較 }GAPDHま _{たはリボソームに対するそれぞれの発現量を示し} 、泌乳 最盛 期 にお ける値 を100としたときの それぞ れの値 を算 出した。各 値 は 平 均 値 ± 標 準 誤 差(n=4)で 表 示 。 a,b;異 な る文 字 は 有 意 差(p〈0.05)があ ることを示 す 。 1000Q z900 m800

0700

N___

600 ミ500 Q400 Z 〔と300 ∈200 §1・ ・ 鞘0 図6異 な る 泌 乳 期 の 脂 肪 組 織 中 に お け る レ プ チ ン 発 現 量 の 比 較 GAPDHに 対 するそれぞ れの発 現 量:を示 し、 泌乳 最盛 期 における値 を100としたときの それぞれ の値 を算 出した。 各 値 は 平 均 値 ±標 準 誤 差(n=4)で 表 示 。 a,b;異 な る文 字 は 有 意 差(p<0.05)が あることを示 す 。 PeakLateNon-lactatinglactatinglactating 20 00 80 60 40 刎 一 り り く Z 匡 ∈ = O ユ < O 、 < Z 匡 E に 工 O 0 PeakLateNon-lactatinglactatinglactating 0 0 0 0 0 0 5 0 5 0 5     り ヨ  < Z 配 Φ ∈ O の Q ￡ ﹂ 、 < Z に ∈ 魁 窪 く 巳 ユ PeakLateNon-lactatinglactatinglactating 図7異 な る泌 乳期 の脂 肪 緯 織 中 にお けるGHR(左)及 びPPARγ2(右)発 現 量 の比 較 GAPDHに 対 するそれぞ れの発現 量 を示 し、泌 乳最 盛 期 にお ける値を100とした ときの それぞれ の値 を算 出した。各 値 は 平 均 値 ± 標 準 誤 差(n盟4)で表 示 。 a,b;異 な る文 字 は 有 意 差(p<0.05)が あ ることを示 す 。

20 15 10 5 (唇 ∋ δ ≦ コ o ﹄ a 5 4 a a PeakLateNon-lacta"ng・la(畑 緬nglacta誓ng 宕3 琶奉 2 1 0 im PeakLateNon-lacb値ngla〔 泊 価nglacta価n9 図8異 な る泌 乳 期 の 血 漿 インス リン(左)及 びGH(右)濃 度 の 比 較 各値 は平 均値 ±標準誤 差(nr4)で表示。 a,b;異 なる文字は有意差(p<0.05)があることを示す。 PeakLateNon一 」旦幽 幽L」 幽

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20 00 80 60 40 20 0 1 1 < Z 匡 ∈ エ O 匹 く O 、 < Z 匡 ∈ 已 ヨ O a a T-i一 一 ■ 一 ; 胴 b 一 一 ■ T 一 一 一 ■ 一 PeakLateNon-1acta廿ng置ada廿nglac圃ng 図9.異 なる泌 乳期 の乳腺 組 織 中 にお けるGLUT1タ ンパ ク質(上) 及 び 血RNA(下)発 現 量 の比 較 GAPDHに 対 するそれぞれ の発 現量を示 し、 泌 乳最盛 期 にお ける値を100としたときの それぞれ の値 を算 出し嵐 各 値 は 平 均 値 ±標 準 誤 差(n=4)で 表 示 。 a,b;異 なる文 字 は 有 意 差(p<0.05)が あることを示 す 。 00 00 00 00 0 4 3 2 1 < Z 匡 Φ ∈ 8 B ミ < Z 匡 E N = .ヨ O b a a PeakLate laαa髄ng Non一 lacセ癒nglaC悟 廿ng 蔚 20 00 80 60 40 20 0 り コ り く Z 匡 Φ ∈ 8 8 ミ < Z 匡 ∈ N ト匡 く 珪 PeakLateNon-laCta暫nglaC圃nglaCta廿ng 図10.異 な る泌 乳 期 の 脂 肪 組 織 中 に お け るGLUT12(左)及 びPPARy2(右)発 現 量 の 比 較 リボソームに対 するそれぞれの発 現量 を示し、泌乳 最盛期 における値 を100としたときの それぞれ の値 を算 出し鳥 各 値 は 平 均 値 ±標 準 誤 差(n冨4)で表 示 。 a,b;異 なる文 字 は 有 意 差(Pく0.05)があることを示 す 。.

40 20 00 4i 1 1 80 60 40 20 0 < Z 匡 ε = O 色 く O 、 < Z 匡 ∈ 匡 工 O PeakLateNon-lactatinglactatinglactating 図11.具 なる泌乳期 の脂肪組織 中 におけるGHR発 現量の比較 GAPDHに 対 す るそ れぞ れ の発 現 量を示 し、 泌 乳 最 盛 期 にお け る値 を100とした ときの それ ぞ れ の 値 を算 出 した。 各 値 は 平 均 値 ± 標 準 誤 差(n=4)で 表 示 。 b 0 0 0 0 0 0 0 一 〇 〇 〇 8 6 4 2 0 8 6 4 2   り う   り く Z 匡 O ε O ω ε 旧こ く Z = ∈ ε 五 ﹄ 一 1 Peak lactating Late 1acta価ng Non-lactating 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 5 0 ﹁0 3 2 2 1 1 < Z 匡 E エ O 氏 く O 、 < Z 匡 E ε ω 旧器 ﹂ a _a PeakLateNon-lactatinglactatinglactating 図12.異 な る 泌 乳 期 の 乳 腺 組 織 中 に お け る レ プ チ ン(左)及 び レ ジ ス チ ン(右)発 現 量 の 比 較 GAPDHま たはリボソームに対するそれぞれ の発現量 を示し、泌 乳最盛期における値を100としたときの それ ぞれの値を算 出した。各 値 は 平均 値 ±標 準 誤 差(n=4)で 表 示。 a,b;異 な る文 宇 は有 意 差(p<0.05)が あることを示 す 。

図1L泌 乳 期 にお けるグ ル コー ス 代 謝 ・内分 泌 の 変 化 Bra血 レf・e曲g

命

鋤

竃

4

溺

㎜

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G蓋ucose Liver Insulinresistance Aδipo臓ec血 ⑦G胆 。ose

③

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ゆ

⑨M皿k

eptin 泌乳最盛期 脂肪組織 ① レジスチン増加 によるインスリン抵 抗 性 ② アデ ィポネクチン低下 によるインスリン抵 抗 ③ レプチン低 下 による採食量 増加 ④ インスリン分 泌の低 下 ⑤脂 肪組 織GエUTI低 下 ⑥PPARγ2低 下による脂 肪細胞 分化 抑制

聖e

乳腺組織 ⑧GLUTI増 加 によるグルコース取り込 み増 加

旦

⑨乳量増加 乾 乳 期 乳腺組織

↓

ロ

翻

-n

繍

G R 乳 腺発 育 時のインスリン関与 の グルコース取 り込 み の可能性

論 文 審 査 結 果 要 旨

反 甥 動 物 に お け る糖 代 謝 は,第 一 胃 に 由来 す る短 鎖 脂 肪 酸 が 大 き く関 与 す る た め に,複 雑 で あ る 。 しか も,泌 乳 牛 に お い て は,妊 娠,分 娩,泌 乳 な どの生 理 的変 動 を定 期 的 に 繰 り返 す た め に,そ れ ぞ れ の ス テ ー ジ に 合 致 した 代 謝 を短 期 間 に構 築 し,適 応 しな けれ ば な らない 。 こ の よ うな反 甥 家 畜 に お け る糖 代 謝 に は不 明 な点 が多 く残 され て い る。 本 研 究 は,反 鋼 動 物 に お け る グル コー ス ホ メオ ス タ シ ス お よび ホ メ オ レー シ ス の特 異 性 が脂 肪 組 織 に依 存 す る とい う仮 説 に基 づ き,そ の 一端 を解 明 す る 目的 で,レ ジ スチ ンや アデ ィ ポネ ク チ ンな どの イ ンス リン抵 抗 性 に 関 与 す る 因子 や グル コ ー ス トラ ンス ポ ー タ ー(GLUT)な どの糖 代 謝 関連 遺 伝 子 発 現 の種 特 異 性 を,各 泌 乳 ステ ー ジ で検 討 した。 まず,肉 用 牛 で あ る黒 毛 和 種 牛 と泌 乳 牛 で あ るホル ス タイ ン種 牛 にお け る グル コ ー ス代 謝 制 御 シ ス テ ム の差 異 に つ い て検 討 した結 果,ホ ル ス タイ ン種 の 内臓 脂 肪 にお け る レ ジス チ ンmRNA発 現 は黒 毛 和 種 牛 よ り6倍 も高 か っ た が,TNF一 α発 現 は黒 毛 和 種 牛 で 高 か った 。 レジ ス チ ンは イ ン ス リン抵 抗 性 に深 く関 わ るア デ ィポ カイ ン の一 つ で あ る こ とか ら,他 の 因子 の 発 現 に つ い て も,各 泌 乳 期 で検 討 した 。 そ の結 果 脂 肪 組 織 で のGLUT1発 現 は泌 乳期 で 低 下 し,逆 に レ ジ ス チ ンや レプ チ ン の発 現 は泌 乳 期 で増 大 して い た 。 乳 腺 に お け る乳 汁 生 成 は脂 肪 代 謝 と密 接 に関 係 す る こ とか ら,乳 腺 組 織 にお け る ア デ ィ ポ カ イ ンの 発 現 に つ い て,各 泌 乳 期 で 検 討 した 。 そ の結 果,GLUT1遺 伝 子 お よび タ ンパ ク質 の発 現 は,泌 乳期 で有 意 に 高 か っ た 。 ま た,乳 腺 細 胞 で はイ ン ス リン依 存 性 のGLUTは な い と考 え られ て い た が,実 際 に はGLUT12が 存 在 し,乾 乳 期 の発 現 量 が3倍 以 上 に増 大 す るこ とが 示 され た 。 ま た,脂 肪 細 胞 と同 様 に,乳 腺 細 胞 にお い て も レ ジス チ ンが 発 現 して お り,乾 乳 期 で2倍 以 上 に増 大 す る こ とが 示 され た 。 以 上 の よ うに,イ ンス リン抵 抗 性 の高 い ホル ス タイ ン種 牛 に お い て は,抵 抗 性 に 関与 す る レジ ス チ ン が脂 肪 組 織 の み な らず 乳 腺 組 織 にお い て も発 現 して い る こ とが 初 めて 示 され,し か も,そ の発 現 が 泌 乳 ス テ ー ジ に よっ て 精 密 に制 御 され て い る こ とが 明 らか に され た 。 これ らの成 果 は,反 甥 家 畜 の糖 代 謝 にお け る種 特 異 性 解 明 に新 規 な視 点 を加 え る もの で あ る 。 よ って,審 査 員 一 同 は,本 論 文 の 著者 が 博 士(農 学)の 学 位 を授 与 され るの に値 す る も の と判 定 した。