岡 山 医 誌 (1994) 106, 275∼285
ヒ ト骨髄 間質 細胞 に関 す る研 究
第2編
慢性骨髄性 白血病,骨 髄異形成症候群,再 生不良性貧血 におけ る
ヒ ト骨髄 間質細胞の増殖動 態並 びに細胞構成 の検討
岡 山大 学 医学 部 第 二 内科 学教 室(指 導:木 村 郁 郎教 授)
松﨑
敏
朗
(平成5年12月22日
受 稿)
Key words: Human bone marrow stromal cells, Long-term bone marrow culture, Chronic myelogenous leukemia, Myelodysplastic syndrome,
Anlastic anemia 緒 言 1961年Till, McCulloch1)は 脾 コ ロ ニ ー 形 成 法 に よ る 多 分 化 能 幹 細 胞 の 検 討 に 際 し,移 植 さ れ たCFU-Sが 骨 髄 と脾 臓 に 定 着 し,増 殖 す る こ と を 明 らか に し た が,こ の こ と は ま た 生 体 内 で, 造 血 細 胞 が 分 化 ・増 殖 す る の に 特 殊 な 環 境 を必 要 とす る こ と を示 す も の で もあ っ た.さ らに1968 年, Trentinら2)は 脾 コ ロ ニ ー 実 験 法 に お い て, 移 植 さ れ たCFU-Sが 骨 髄 で は顆 粒 球 系 細 胞 に, ま た脾 臓 で は 赤 血 球 系 細 胞 に分 化 しや す く,さ ら に 移 植 後18∼24時 間 後 に 骨 髄 細 胞 を 集 め 放 射 線 を照 射 した 他 の マ ウ ス に 再 移 植 した 場 合 で も, 形 成 され た コ ロ ニ ー は 骨 髄 で は 顆 粒 球 系 細 胞 優 位,脾 臓 で は 赤 血 球 系 細 胞 優 位 で あ る こ と を実 証 し た.ま た,遺 伝 的 に 造 血 支 持 能 に 欠 陥 が あ るsl/sld系 マ ウ ス の 存 在 が 報 告 さ れ た が3),こ れ ら 成 績 は,生 体 内 の 造 血 調 節 は,液 性 造 血 因 子 に よ っ て だ け で な く,造 血 支 持 組 織 に お け る細 胞 間 相 互 作 用 に よ っ て も な さ れ る と い う こ と を 支 持 す る も の で あ り,以 来,局 所 制 御 機 構 い わ ゆ る造 血 微 小 環 境 が 注 目 さ れ る に 至 っ た4,5).そ の 主 体 を な す もの は,ヒ トで は 骨 髄 間 質 細 胞 で あ り,線 維 芽 細 胞,内 皮 細 胞,マ ク ロ フ ァ ー ジ, 脂 肪 細 胞 な ど に よ り構 成 され るheterogenousな 細 胞 集 団 と さ れ6-8),こ れ ら細 胞 群 は,相 互 に ネ ッ トワ ー ク を形 成 し9,10),造血 細 胞 との 直 接 的 結 合11-13), Fibronectin, Proteoglycanな ど の 細 胞 外 基 質14-16)お よ びInterleukin-6(IL-6), Granulocyte-macrophage colony-stimulating
factor(GM-CSF), Granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF), Macrophage colony-stimulating factor(M-CSF)な ど の 造 血 因 子 の 産 生17-19)な ど に よ っ て,造 血 細 胞 の 維 持,増 殖,分 化 に 関 与 し て い る と考 え ら れ て い る20,21).また,骨 髄 間 質 細 胞 は,造 血 に 対 し促 進 的 の み な ら ず 抑 制 的 に も作 用 す る 多 彩 な 造 血 制 御 シ ス テ ム を有 し て い る と さ れ22),各 種 血 液 疾 患 に お け る そ の 量 的 あ る い は 質 的 変 調 が 病 因 ・病 態 論 的 関 与 とい っ た 意 味 で も注 目 さ れ よ う.実 際,貧 血 マ ウ ス で 造 血 幹 細 胞 側 に 障 害 が あ るw/ wvマ ウ ス で はW遺 伝 子 座 に あ るproto oncogeneのc-kitに コ ー ド さ れ たtyrosine kinase receptorに 異 常 が あ る と さ れ て い るが, 骨 髄 間 質 細 胞(造 血 微 小 環 境)側 に 障 害 の あ る sl/sldマ ウ ス で はsl遺 伝 子 座 に コ ー ド さ れ た tyrosine kinase receptor ligandの 一 つ と考 え られ て い るstem cell factorの 異 常 で あ る と さ れ23-25),再 生 不 良 性 貧 血 な ど一 部 の 病 態 に お け る 骨 髄 間 質 細 胞 と造 血 幹 細 胞 と の 相 互 関 係 が 解 明 さ れ つ つ あ る.し か し,再 生 不 良 性 貧 血 以 外 の 疾 患 に お い て は,骨 髄 間 質 細 胞 の 動 態 に つ い 275
て の 検 討 は 少 な く26),これ まで 各 種 ヒ ト血 液 疾 患 の 病 態 生 理 が 主 に 造 血 細 胞 側 か ら検 討 さ れ て き た こ とか ら考 え て も27-33),そ の 検 討 は,極 め て 重 要 な 情 報 を提 供 す る も の と考 え られ る. 今 回,著 者 は 以 上 の 観 点 に た ち,慢 性 骨 髄 性 白 血 病(CML),骨 髄 異 形 成 症 候 群(MDS),再 生 不 良 性 貧 血(AA)に お け る 骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 並 び に 細 胞 構 成 に つ い て 検 討 し,こ れ ら 疾 患 に お け る 造 血 ネ ッ トワ ー ク解 析 へ の 一 助 と せ ん と し た. 対 象 と 方 法 1.対 象 1988年3月 か ら1991年1月 ま で に 岡 山 大 学 医 学 部 第2内 科 に お いて 診 断 され た慢 性 期CML 6 例, MDS 4例[Primary aquired sideroblastic anemia(PASA)1例, Refractory anemia with excess of blasts(RAEB)1例, RAEB
in transformation(RAEB-t)2例], AA 4例 を対 象 と し た.な お,対 象 例 は 全 例 未 治 療 例 で あ り,正 常 健 康 人(NC)10例(骨 髄 間 質 細 胞 構 成 比: 8例)を も っ て コ ン ト ロー ル と し た. 2.方 法 1)骨 髄 血 骨 髄 血 は,イ ン フ ォ ー ム ド ・コ ン セ ン トを 得 た 後,患 者 な らび に 正 常 健 康 人 の 胸 骨 も し くは 腸 骨 よ り穿 刺 吸 引 法 に て 無 菌 的 に 採 取 し た. 2)骨 髄 間 質 細 胞 の 長 期 液 体 培 養 法 培 養 法 は, Dexter培 養 に 準 じ た 長 期 骨 髄 液 体 培 養 系 を 用 い た4,6).骨 髄 血 をFicoll-Hypaque (1.077g/cm3: HISTOPAQUE-1077; Sigma, St. Louis, MO)上 に 重 層 し,比 重 遠 心 法(450 g, 15分 間)に て 単 核 球 分 画 を分 離 し た.こ の 単 核 球 分 画 は, 1.0αMEM(alfa-minimal essen tial medium; GIBCO, Ontario, Canada)に て
2度 洗 浄 し た.そ の 後,得 ら れ た 骨 髄 単 核 球5× 106個 をT-25フ ラ ス コ(25cm2; Coster, Cambrid ge, MA)で, 37℃, 5%CO2の 条 件 下 で 液 体 培 養 し た.培 養 液 は, 1.0αMEMに15%牛 胎 児 血 清(FCS; Boehringer Mannheim, W. Ger many), 2×10-6M Methylprednisolone, 40U/ ml Penicillin, 40μg/ml Streptomycinを 加 え た もの で, 1フ ラ ス コ あ た り8ml使 用 し た.週 に 1回,非 付 着 性 細 胞 分 画 を 含 む 培 養 上 清 を 新 鮮 な 同 量 の 培 養 液 と 交 換 し な が ら,フ ラ ス コ底 に 形 成 さ れ た 付 着 性 細 胞(骨 髄 間 質 細 胞)の 培 養 を3∼4週 間 継 続 し た. 3)骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 骨 髄 間 質 細 胞 の 長 期 液 体 培 養 中,フ ラ ス コ底 に付 着 し た 骨 髄 間 質 細 胞 層 を倒 立 顕 微 鏡 に て 観 察 し た.倒 立 顕 微 鏡 の1視 野(倍 率: ×100)を 4分 割 し,合 計20視 野 で 平 均 し,骨 髄 間 質 細 胞 の フ ラ ス コ底 占 有 率(% confluence)を 半 定 量 した.培 養 第1週 か ら 第4週 ま で の 骨 髄 間 質 細 胞 の 「% confluence」 の 経 時 的 変 化 を増 殖 動 態 と し た. 4)骨 髄 間 質 細 胞 の 細 胞 構 成 前 述 の 長 期 骨 髄 液 体 培 養 法 に て 培 養 した 骨 髄 間 質 細 胞 が,フ ラ ス コ底 に ほ ぼ100% confluence に な る培 養 第3な い し第4週 の 時 点 で そ の 細 胞 構 成 を検 討 し た.フ ラ ス コ 内 の 培 養 上 清 を全 量 除 き, PBSに て 付 着 して い る骨 髄 間 質 細 胞 層 を 2回 洗 浄 し,培 養 上 清 を 充 分 取 り除 い た 後, 0.05% EDTA加0.25% Trypsinを5ml加 え充 分 に ピペ ッ テ ィ ン グ し骨 髄 間 質 細 胞 層 を個 々 に 剥 離 し た.剥 離 し た 骨 髄 間 質 細 胞 は, PBSに て 2回 洗 浄 した.そ の 後, Strobelら7)の 方 法 に 準 じ, 抗fibronectin抗 体,抗vWF抗 体,抗CD14 抗 体 抗CD7抗 体,抗CD4抗 体,抗CD8抗 体 の 各monoclonal抗 体 を 一 次 抗 体 と し,採 取 し た 骨 髄 間 質 細 胞 と30分 間 反 応 させ た 後 で, PBS に て3回 洗 浄 し,次 にFITC標 識2次 抗 体 を 反 応 させ る 間 接 螢 光 抗 体 法 を 用 い た. PBSに て3 回 洗 浄 し た 後,螢 光 顕 微 鏡 に て 各 々 のmono clonal抗 体 陽 性 の 細 胞 の 比 率 を 算 定 し た.ま た, 別 に,採 取 した 骨 髄 間 質 細 胞 の 一 部 に はGiemsa 後 染 色 を加 え たOil red O染 色 を施 し, Oio red O染 色 陽 性 細 胞 の 比 率 を 算 定 し た.抗fi
bronectin抗 体 はfibroblastoid cell/endoth elial cellを,抗vWF抗 体 はendothelial cell
を,抗CD14抗 体 はmonocyte/macrophageを, 抗CD7抗 体 はT lymphocyteを,抗CD4抗 体
はhelper/inducer T cellを,抗CD8抗 体 は suppressor/cytotoxic T cellを, Oil red O染
Studies on human bone marrow stromal cells 277
ら,剥 離 し た 付 着 細 胞 をfibroblastoid cell, endothelial cell, monocyte/macrophage, T lymphocyte, helper/inducer T cell, suppres
sor/cytotoxic T cell及 びfat cellに 分 類 し た.
結 果 1.骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 の 検 討 1)正 常 健 康 人(NC)に お け る検 討 NCに お け る骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 は,表 1,図1に 示 す ご と く,培 養 第1週 目 に お け る% confluenceは7±4%で あ っ た が,第2週 目 で は 82±13%,第3週 目 で は100%とexponentialに 増 殖 し,第4週 目 で も100% confluenceの 状 態 を持 続 し た.な お,第4週 目 ま で の 観 察 に お い て フ ラ ス コ底 か ら の 細 胞 剥 離 は 認 め られ な か っ た. 2) CMLに お け る検 討 CMLに お け る 骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 は,表 1,図1に 示 す ご と くで, % confluenceは 第1 週 目8±4%,第2週 目53±23%,第3週 目80± 13%,第4週 目91±8%とNCに 比 し細 胞 増 殖 表1 CML, MDS, AAに お け る骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態a) a): 増 殖 動 態 は 培 養 フ ラ ス コに お け る 「% confluence」 で 示 し た.
CML: chronic myelogenous leukemia
MDS: myelodysplastic syndrome, AA: aplastic anemia
が 不 良 で あ っ た.ま た,細 胞 は3週 目 よ り フ ラ ス コ 底 か ら一 部 剥 離 す る傾 向 を 示 し,培 養 第4 週 目 に100% confluenceに な っ た 症 例 は6例 中 2例 で あ っ た. 図1 慢 性 骨 髄 性 白血 病 に おけ る ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態
図2 骨髄異形性症候群 における ヒト骨髄間質細胞
の増殖動態
図3 再生不 良性 貧血におけ るヒ ト骨髄 間質細胞の
増殖動 態
3) MDSに お け る検 討 MDSに お け る骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 は 表 1,図2に 示 す ご と く で,第1週 目の% conflu enceは26±7%と, NCの7±4%に 比 し 高 く, 増 殖 は や や 亢 進 傾 向 に あ っ た が,第2週 目85± 9%,第3週 目98±5%,第4週 目100%と,第2 週 目以 降 はNCと 同様 の 増 殖 パ タ ー ン を 示 し, 細 胞 の 剥 離 傾 向 は 認 め ら れ な か っ た. 4) AAに お け る検 討 AAに お け る骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 は 表1, 図3に 示 す ご と くで,症 例4で 第1週 目 高 い% confluenceを 認 め た 以 外 特 異 的 所 見 は 認 め られ な か っ た.な お,症 例4は 後 述 す る よ う にfat cell が 高 比 率 に 認 め ら れ た 症 例 で,臨 床 的 に は 重 症 型 に 属 す る もの で あ っ た.ま た,培 養 期 間 を通 じ,細 胞 の 剥 離 傾 向 は 認 め られ な か っ た. 2.骨 髄 間 質 細 胞 構 成 比 の 検 討 1)正 常 健 康 人(NC)に お け る検 討 NCに お け る骨 髄 間 質 細 胞 構 成 比 は,表2,図 4に 示 す ご と くで, fibroblastoid cell[抗fi bronectin抗 体 陽 性 細 胞(fibroblastoid cell/en
dothelial cell)-抗vWF抗 体 陽 性 細 胞(en dothelial cell)] 64±4%, endothelial cell 15± 3%, monocyte/macrophage 9±4%, fat cell 3±2%, T lymphocyte 7±3%, helper/inducer T cell 4±1%, suppresser/cytotoxic T cell 4±
1%, CD4/CD8 1.0±0.4で,こ の 比 率 は 培 養 2∼4週 間 ほ ぼ 一 定 で あ っ た.
2) CMLに お け る 検 討
CMLに お け る 細 胞 構 成 比 は 表3,図4に 示 す ご と く で, fibroblastoid cell 58±4%, endoth elial cell 16±8%, monocyte/macrophage 5± 2%, fat cell 2±1%, T lymphocyte 8±3%, helper/inducer T cell 5±2%, suppressor/
cytotoxic T cell 5±1%, CD4/CD8 0.9±0.2 で, NCと の 間 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た.
図4 ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 構 成 の 検 討
表2 正常健康 人におけ る骨髄間質細胞構成
NC: 正 常 健 康 人
Studies on human bone marrow stromal cells 279 表3 CMLに お け る骨 髄 間 質 細 胞 構 成
CML: chronic myelogenous leukemia,
FN: fibronectin, vWF: von Willebrand factor, F-v: FN-vWF, ORO: oil red O, NT: not tested
表4 MDSに お け る骨 髄 間 質 細 胞構 成
MDS: myelodysplastic syndrome
FN: fibronectin, vWF: von Willebrand factor, F-v: FN-vWF, ORO: oil red O
表5 AAに お け る骨髄 間質 細 胞構 成
AA: aplastic anemia
FN: fibronectin, vWF: von Willebrand factor, F-v: FN-vWF, ORO: oil red O
3) MDSに お け る 検 討
MDSに お け る 細 胞 構 成 比 は 表4,図4に 示 す ご と く で, fibroblastoid cell 68±5%, endoth elial cell 13±6%, monocyte/macrophage 6± 3%, fat cell 3±1%, T lymphocyte 5±1%, helper/inducer T cell 2±1%, suppressor/ cytotoxic T cell 3±1%, CD4/CD8 1.0±0.7 で, NCと の 間 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 4) AAに お け る検 討 AAに お け る 細 胞 構 成 比 は 表5,図4に 示 す ご と く で,症 例4で はfat cellが 高 率 に 認 め ら れ た.ま た,症 例1, 2, 3で はendothelial cell が 各 々35%, 32%, 21%と, NC, CML, MDS に 比 し 高 率 で あ る 点 が 注 目 さ れ た.な お, T lymphocyte, helper/inducer T cell, suppres
は 認 め られ な か っ た.ま た,症 例1, 2, 3の fat cellは 正 常 範 囲 に あ っ た. 考 察 造 血 微 小 環 境 を 構 成 し,血 液 細 胞 の 分 化 と 増 殖 に 影 響 を 及 ぼ す 因 子 と し て,骨 髄 間 質 細 胞 と 造 血 細 胞 との 直 接 接 触10-12),骨 髄 間 質 細 胞 の 細 胞 外 基 質14-16)お よ び拡 散 性 造 血 因 子18,19)など が 考 え られ て い る.造 血 幹 細 胞 の 数 週 間 に わ た る 長 期 液 体 培 養 は, Dexterら5)が 考 案 し た 培 養 法 が 出 現 す る ま で は 極 め て 困 難 で あ っ た が,培 養 フ ラ ス コ 底 に 骨 髄 間 質 細 胞 の 付 着 細 胞 層 を も つ 培 養 法 の 開 発 に よ っ て 可 能 と な り,造 血 微 小 環 境 と して の 骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 支 持 能 が 注 目 さ れ る よ うに な っ た. Gordonら34)に よ る と,造 血 刺 激 因 子 の 一 つ で あ るGM-CSFは,一 部 が 骨 髄 間 質 細 胞 の 細 胞 外 基 質 に 結 合 し,同 じ く細 胞 外 基 質 に 結 合 して い る 造 血 細 胞 と 情 報 交 換 す る と さ れ て い る.ま た,最 近Mayani35)ら は,造 血 因 子 の 一 つ で あ るM-CSFが,骨 髄 間 質 細 胞 を介 し,長 期 骨 髄 液 体 培 養 造 血 系 を抑 制 す る 可 能 性 を 報 告 して い る. さ て, CML, MDS, AAは と も に 多 能 性 幹 細 胞 の 異 常 で あ る が,「造 血 幹 細 胞-造 血 微 小 環 境 -骨 髄 間 質 細 胞-造 血 因 子 」 とい う造 血 ネ ッ ト ワ ー クの 中 で こ れ ら疾 患 をみ る 時,骨 髄 間 質 細 胞 の 動 態 が 病 態 生 理 学 的 に も注 目 され る.今 回 著 者 は こ の よ う な 観 点 に た ち, CML, MDS, AA に お け る骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 と細 胞 構 成 に つ い て 検 討 し た わ け で あ るが,ま ず, CMLに お け る 骨 髄 間 質 細 胞 増 殖 動 態 に つ い て み る と, NC に 比 較 し低 下 傾 向 が 認 め られ た.た だ,今 回 の 実 験 系 で は フ ラ ス コ 底 に 占め る 骨 髄 間 質 細 胞 の 占拠 率 を もって 増 殖 動 態 を表 現 した 点,ま たCML に お い て はNC, MDS, AAに 認 め られ な か っ た 細 胞 剥 離 傾 向 が 第3週,第4週 に 認 め ら れ た 点,さ ら に 後 述 す る よ う に,慢 性 期CML骨 髄 間 質 細 胞 構 成 比 はNCと の 間 に 有 意 差 を認 め な か っ た 点 な どか ら,増 殖 動 態 が 不 良 と い う よ り は む し ろ微 小 環 境 構 築 に お け る脆 弱 性 を 一 つ に は 示 す の で は な い か と思 わ れ る.し か し,そ れ で は こ の 脆 弱 性 が い か な る こ と に 起 因 す る の か は 不 明 と言 わ ざ る を 得 な い.た だ, CMLは 病 態 生 理 学 的 に 幹 細 胞 プ ー ル が 腫 瘍 性 に 増 大 し た状 態 で あ り,こ の 増 大 した 幹 細 胞 プ ー ル が 造 血 支 持 機 構 を 担 う骨 髄 間 質 細 胞 に な ん らか の 影 響 を 与 え る 可 能 性 は 否 定 し得 ず, NC, MDS, AAに 認 め られ な い フ ラ ス コ 底 か らの 剥 離 傾 向 は そ の 一 部 を 表 現 し た もの で は な い か と も考 え ら れ る . こ れ ま でCMLに お け る骨 髄 間 質 細 胞 の 病 因 ・ 病 態 論 的 関 与 に つ い て の 検 討 は 少 な く, Wetzler ら36)は, CMLの 骨 髄 性 あ る い は分 類 不 能 型 急 転 例6例 の 骨 髄 間 質 細 胞 を培 養 し た 結 果, 5例 で IL-1β とIL-6のmRNAの 発 現 を認 め,こ の 発 現 は リ ンパ 性 急 転 例,増 悪 期 例,慢 性 期 例 で は 認 め ら れ な か っ た と し て い る.さ ら に 急 転 細 胞 と正 常 ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 との 混 合 培 養 でIL-1 β とIL-6のmRNA発 現 が 認 め ら れ た こ とか ら, トラ ン ス フ ォ ー ム し た 急 転 ク ロー ン が 骨 髄 間 質 細 胞 を 刺 激 す る こ と に よ つ て 各 種 造 血 因 子 が 産 生 さ れ,こ れ がCMLの 進 展 に 関 係 し て い る の で は な い か と推 定 し て い る が,今 後, CMLの み な らず 慢 性 骨 髄 増 殖 性 疾 患 の 病 像 移 行 な どに 対 す る 骨 髄 間 質 細 胞 の 関 与 が 形 態 と機 能 面 か ら明 らか に さ れ て い く も の と考 え ら れ る.つ ぎに, MDSの 骨 髄 間 質 細 胞 増 殖 動 態 につ いて 検 討 した が,培 養 第1週 目 で 「% confluence」 は26%と 増 殖 動 態 は や や 亢 進 し て い た もの の,以 後 はNC と ほ ぼ 同 じ増 殖 動 態 を示 し,培 養 第4週 目で は ほ ぼ100%で あ っ た. Coutinhoら26)は コ ン トロ ー ル の94% confluenceに 対 し, RAとRSAで は 平 均55%, RAEBとCMMLで は0%と 著 者 の 成 績 と相 反 し た成 績 を報 告 して い るがCoutin hoら は 培 養 液 を半 量 交 換 と し て い る た め,残 存 培 養 液 中 に はMDS造 血 細 胞 も残 存 し た ま ま に な っ て お り,そ れ が 骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 に 抑 制 的 に 作 用 した 可 能 性 も 否 定 で き ず,骨 髄 間 質 細 胞 そ の もの の 評 価 方 法 と し て 適 当 と は 言 い難 い 様 に 思 わ れ る. AAは 汎 血 球 減 少 と骨 髄 低 形 成 を 主 徴 とす る が,今 回AAに お け る骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 に つ い て 検 討 し た 結 果,症 例4を 除 き, NCと ほ ぼ 同 じ増 殖 動 態 が 示 さ れ た. ま た 今 回,著 者 は 骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 と 同 時 に 骨 髄 間 質 細 胞 構 成 比 率 に つ い て も検 討 し た が,ま ず, NCで はfibroblastoid cell
60-Studies on human bone marrow
stromal cells
281
69%(64±4%), endothelial cell 10-19%(15± 3%), monocyte/macrophage 3-15%(9± 4%), fat cell 1-5%(3±2%)と, Strobel7)ら の 報 告 とほ ぼ 同様 で あ っ た.つ い で, CML, MDS, AAに つ い て 検 討 し た 結 果, CML, MDSで は NCと の 間 に 有 意 差 は 認 め られ な か っ た が, AA で は, fat cell構 成 比 が 極 め て 高 い 症 例 を1例 に 認 め,残 り3例 で はNCに 比 しendothelial cell の 構 成 比 が 高 い 点 が 注 目 さ れ た.す で にendoth elial cellがGM-CSF, G-CSF, M-CSFな ど を産 生 す る こ と が 明 ら か に さ れ て い る が,汎 血 球 減 少 を主 徴 とす るAAに お い て は その 代 償 的 機 構 の 一 つ と し てendothelial cellの 量 的 増 加 が 存 在 す る の で は な い か と も考 え ら れ る.ま た, 1例 にfat cellの 著 明 な 増 加 を 認 め た が,本 例 は 重 篤 か つ 進 行 性 の 汎 血 球 減 少 を呈 し,極 め て 急 速 な 経 過 を と り死 亡 し た 症 例 で,剖 検 結 果 で も典 型 的 な 脂 肪 髄 が 認 め られ た, Nakamuraら37) は 前 脂 肪 細 胞 の 脂 肪 細 胞 化 に よ りサ イ トカ イ ン の 産 生 能 が 減 弱 し,ひ い て は 造 血 能 の 低 下 へ と い っ た 一 連 の 関 連 を 指 摘 し て い る が,本 例 で は in vivo, in vitroと もに 骨 髄 間 質 細 胞 がfat cell に 置 換 され て お り,造 血 能 低 下 へ のfat cellの 関 与 を 示 唆 す る症 例 と考 え ら れ る. AAの 成 因 に つ い て は こ れ ま で 造 血 幹 細 胞 と造 血 支 持 組 織 か ら の検 討 が な さ れ て い るが,骨 髄 移 植 成 功 例38,39) の 報 告 は 「造 血 幹 細 胞 不 全 」 を ま さ に 示 す も の で あ り,さ ら にT cell除 去 に よ るBFU-E形 成 能 の 回 復27),免 疫 抑 制 剤 に よ る骨 髄 増 殖 能 の 回 復40)な ど は 免 疫 担 当 細 胞 と造 血 幹 細 胞 と の 関 連 を 示 す もの で あ ろ う.一 方, W/Wvマ ウ ス とsl/ sldマ ウ ス の 異 常 をin vitroで 再 現 し た 報 告3), AAの 骨 髄 間 質 細 胞 のCFU-GM支 持 能 低 下 の 報 告41)は 「造 血 微 小 環 境 不 全 」の 関 与 を示 す も の と考 え られ る.今 回,著 者 はAAに お け る骨 髄 間 質 細 胞 構 成 比 の 検 討 でfat cellが 極 め て 高 率 で あ っ た 症 例 を認 め,他 の 症 例 で はendothelial cellの 増 多傾 向 を認 め た が,こ の こ と は 少 な く と もAAに お け る骨 髄 間 質 細 胞 の 変 調 を示 す も の で あ り,造 血 細 胞 自体 の 問 題 以 外 に 今 後 骨 髄 間 質 細 胞,細 胞 外 基 質 お よ び 造 血 因 子 の 局 在 性 な ど造 血 微 小 環 境 因 子 の 関 与 を 詳 細 に 検 討 し て ゆ く必 要 が あ る もの と 思 わ れ る.ま た,一 部AA で は そ の 成 因 に 免 疫 学 的 機 序 の 関 与 が 指 摘 さ れ て お り, Zoumbosら28)はAAの 末 梢 血 リン パ 球 に お い てCD4/CD8の 低 下 を 報 告 し て い る. 著 者 は こ の 点 に 関 し骨 髄 間 質 細 胞 を構 成 す る リ ン パ 球 サ ブ セ ッ トに つ い て も検 討 した が, AAに お け るCD4/CD8はNCに 比 し有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た. 以 上, CML, MDS, AAを 対 象 に 骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 能 お よ び 細 胞 構 成 比 に つ い て検 討 し た が, CMLで は 培 養 第3週 目 よ り細 胞 が フ ラ ス コ 底 よ り剥 離 す る傾 向 が 認 め ら れ,幹 細 胞 プ ー ル の 増 大 に よ る骨 髄 微 小 環 境 構 築 に お け る 間 質 細 胞 の 脆 弱 性 が 想 定 さ れ た.ま た,構 成 細 胞 に つ い て はCML, MDSで はNCと 有 意 差 は な く, AAで はfat cellの 構 成 比 が 高 率 な 症 例 とen
dothelial cellの 増 加 が 注 目 さ れ た.こ れ ら変 化 が 一 次 的 な も の か,あ る い は 二 次 的 な 変 化 な の か,一 層 の 検 討 を 要 す る と こ ろ で は あ る が,今 後,各 種 ヒ ト血 液 疾 患 の 病 因 あ る い は 病 態 生 理 学 的 解 析 は 「造 血 幹 細 胞-骨 髄 間 質 細 胞-造 血 因 子 」 と い う幅 広 い 造 血 ネ ッ トワ ー クの 中 で す す め ら れ て ゆ く必 要 が あ る も の と考 え ら れ る. 結 論 造 血 機 構 は,「 造 血 幹 細 胞-造 血 微 小 環 境(骨 髄 間 質 細 胞)-造 血 因 子 」に よ っ て 構 築 さ れ,ヒ ト血 液 疾 患 に お い て も 造 血 支 持 機 構 を 担 う骨 髄 間 質 細 胞 の 変 調 が 推 定 さ れ る.今 回 著 者 は,未 治 療 の 慢 性 期CML 6例, MDS 4例, AA 4 例 に お け る 骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態(% conflu ence)と 第4週 目 に お け る構 成 細 胞 比 率 に つ い て 検 討 し た.そ の 結 果, 1.正 常 健 康 人(NC)に お け る 増 殖 動 態 は,培 養 第1週 目7±4%,第2週 目82±13%,第3週 目 と第4週 目 は と も に100%で,細 胞 構 成 は, fibroblastoid cell 64±4%, endothelial cell 15±3%, monocyte/macrophage 9±4%, fat cell 3±2%, T lymphocyte 7±3%, helper/
inducer T cell 4±1%, suppressor/cytotoxic T cell 4±1%, CD 4/CD 81.0±0.4で あ っ た.
2. CMLに お け る 増 殖 動 態 は,第2週 以 降 は NCに 比 し低 下 傾 向 を示 し,第3週,第4週 に
は 細 胞 の 剥 離 傾 向 を認 め,第4週 で100% conflu enceと な っ た 症 例 は6例 中2例 で あ っ た.ま た, 細 胞 構 成 は, NCと の 間 に 有 意 差 は 認 め られ な か っ た. 3. MDSに お け る増 殖 動 態 並 び に 細 胞 構 成 は, NCと の 間 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た. 4. AAに お け る増 殖 動 態 は, 4例 中1例 を 除 きNCと の 間 に 有 意 差 は 認 め られ な か っ た.ま た,細 胞 構 成 の 検 討 で は, 4例 中1例 でfatcell の 著 明 な 増 加 を 認 め, 3例 のendothelial cellは 各 々35%, 32%, 21%とNCに 比 しendothelial cellの 増 加 が 認 め られ た.ま た, 4例 に お け る Tリ ン パ 球 と そ の サ ブ セ ッ トは, NCと の 間 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た.な お, fatcellの 著 増 を 認 め た1例 は 重 症 型 に 一 致 す る も の で 臨 床 像 と の 関 連 が 示 唆 さ れ た. 以 上 の 結 果 を 得 た が,今 後,各 種 ヒ ト血 液 疾 患 の 病 因 ・病 態 生 理 学 的 解 析 は,「 造 血 幹 細 胞-造 血 微 小 環 境(骨 髄 間 質 細 胞)-胞-造 血 因 子 」 と い う幅 広 い 造 血 ネ ッ トワ ー ク の 中 で す す め ら れ て ゆ く必 要 が あ る も の と考 え ら れ た. 稿 を終 え る に あ た り,御 指 導,御 校 閲 を賜 った木 村 郁 郎 教 授 な らび に御 指 導 をい ただ いた高 橋 功 講 師, 大 本 英 次 郎 助 手 お よび 頼敏 裕 先 生 に 深 甚 なる謝 意 を 表 し ます. なお,本 論 文 の 要 旨は 第30回 日本 血 液 学 会 中 国 四 国 地 方 会(徳 島)に お い て 発 表 した.
文
献
1) Till JE and McCulloch EA: A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone
marrow cells. Radiat Res (1961) 14, 213-222.
2) Wolf NS and Trentin JJ: Hemopoietic colony studies. V. Effects of hemopoietic organ stroma on
differentiation of pluripotent stem cells. J Exp Med (1968) 127, 205-214.
3) Dexter TM and Moore MAS: In vitro duplication and 'cure' of haemopoietic defects in genetically
anemic mice. Nature (1977) 269, 412-414.
4) Trentin JJ: Determination of bone marrow stem cell differentiation by stromal hemopoietic induc
tive microenvironment hemopoietic inductive microenvironment. Am J Pathol (1971) 65, 621-628.
5) Dexter TM, Allen TD and Lajtha LG: Conditions controlling the proliferation of hemopoietic stem
cels in vitro. J Cell Physiol (1977) 91, 335-344.
6) Gartner S and Kaplan HS: Long-term culture of human bone marrow cells. Proc Natl Acad Sci USA
(1980) 77, 4759-4765.
7) Strobel ES, Gay RE and Greenberg PL: Characterization of the in vitro stromal microenvironment
of human bone marrow. Int J Cell Cloning (1986) 4, 341-356.
8) Andreoni C, Moreau I and Rigal D: Long-term culture of human bone marrow. I. Characterization
of adherent cells in flow cytometmy. Exp Hematol (1990) 18, 431-437.
9) Lichtman MA: The ultrastructure of the hemopoietic environment of the marrow: a review. Exp
Hematol (1981) 9, 391-410.
10) Campbell F: Intercellular contacts between migrating blood cells and cells of the sinusoidal wall of
bone marrow. An ultrastructural study using tannic acid. Anat Rec (1982) 203, 365-374.
11) Gordon MY: Annotation: adhesive properties of haemopoietic stem cells. Br J Haematol (1988) 68,
149-151.
12) Gordon MY, Clarke D, Atkinson J and Greaves MF: Hemopoietic progenitor cell binding to the
stromal microenvironment in vitro. Exp Hematol (1990) 18, 837-842.
Studies
on human bone marrow
stromal
cells
283
erythroid and myeloid progenitors
to fibroblasts
and fibronectin.
Blood (1987) 69, 1587-1594.
14) Zuckerman
KS and Wicha MS: Extracellular
matrix production by the adherent cells of long-term
murine bone marow cultures.
Blood (1983) 61, 540-547.
15) Wight TN,
Kinsella MG, Keating A and Singer JW: Proteoglycans
in human long-term bone
marrow cultures:
Biochemical
and ultrastructural
analysis.
Blood (1986) 67, 1333-1343.
16) Gordon MY: Annotation:
Extracellular
matrix of the marrow microenvironment.
Br J Haematol
(1988) 70, 1-4.
17) Rennick D, Yang G, Gemmell and Lee F: Control of hemopoiesis by a bone marrow stromal cell
clone: lipopolysaccharide
and interleukin-1-inducible
production
of colony-stimulating
factors.
Blood (1987) 69, 682-691.
18) Kaushansky
K: Control of granulocyte-macrophage
colony-stimulating
factor production in normal
endothelial
cells by positive and negative regulatory elements.
J Immunol (1989) 143, 2525-2529.
19) Charbord P, Tamayo E, Saeland S, Duvert V, Poulet J, Gown AM and Herve P: Granulocyte
macrophage
colony-stimulating
factor
(GM-CSF) in human
long-term
bone marrow
cultures:
Endogeneous
production
in the
adherent
layer
and
effect
of exogeneous
GM-CSF
on
granulomonopoiesis.
Blood (1991) 78, 1230-1236.
20) Coulombel L, Eaves AC and Eaves CA: Enzymic treatment
of long term human marrow cultures
reveals the preferential
location of primitive hemopoietic
progenitors
in the adherent layer. Blood
(1983) 62, 291-297.
21) Cashman J, Eaves AC and Eaves CJ: Regulated proliferation
of primitive hematopoietic
progenitor
cells in long term marrow cultures.
Blood (1985) 66, 1002-1005.
22) Zipori D: Stromal
cells from the bone marrow:
Evidence for a restrictive
role in regulation
of
hemopoiesis.
Eur J Haematol
(198) 42, 225-232.
23) Chabot B, Stephenson DA and Chapman VA: The proto-oncogene
c-kit encoding a transmembrane
tyrosine kinases recepter maps to the mouse W locus. Nature
(1988) 335, 88-89.
24) Williams DE, Eisenman J, Barid A, Rauch C, Ness KV, Marsh CJ, Park LS, Martin U, Mochizuki
DY, Boswell HS, Burgess GS, Cosman D and Lyman SD: Identification
of ligand for the c-kit
proto-oncogene.
Cell (1990) 63, 167-174.
25) Zsebo KM, William DA, Geissler EN, Broudy VC, Martin FH, Atkins HL, Hsu RY, Birkett NC,
Okino KH, Murdock DC, Jacobsen FW, Langley KE, Smith KA, Takeishi T, Cattanach BM, Galli
SJ and Suggs SV: Stem cell factor is encoded at the S1 locus of the mouse and is the ligand of the
c-kit tyrosine kinase receptor.
Cell (1990) 63, 213-224.
26) Coutinho LH, Geary CG, Chang J, Harrison C and Testa NG: Functional studies of bone marrow
hematopoietic
and stromal cells in the myelodysplastic
syndrome (MDS). Br J Haematol
(1990) 75,
16-25.
27) Torok-Storb
B, Sieff C, Storb R, Adamson JA and Thomas ED: In vitro tests for distinguishing
possible immunemediated
aplastic anemia from transfusion
induced sensitization.
Blood (1980) 55,
211-215.
28) Zoumbos NL, Gascon BP, Djeu JT, Frost SR and Young NS: Circulating activated suppressor T
lymphocytes in aplastic anemia.
N Engl J Med (1985) 312, 257-265.
29) Viale M, Merli A and Bacigalupo A: Analysis at the clonal level of T cell phenotype and function
in severe aplastic anemia patients.
Blood (1991) 78, 1268-1274.
31) Daley GQ, Van Etten RA and Baltimore E: Induction of chronic myelogenous
leukemia in mice by
p210 bcr/abl gene of Philadelphia
chromosome.
Science (1990) 249, 824-829.
32) Munker R and Koeffler HP: Pathobiology
of the myeloproliferative
disorders;
in Hematology
Basic Principles and Practice,
Hoffman R, Benz EJ Jr and Shattil SJ eds, Churchil Livingston,
New
York (1990) pp 817-834.
33) Koeffler HP: Myelodysplastic
syndromes
(preleukemia).
Semin Hematol
(1986) 23, 284-289.
34) Gordon MY, Riley GP, Watt SM and Greaves MF: Compartmentalization
of a haemopoietic factor
(GM-CSF) by. glycosaminoglycans
in the bone marrow microenvironment.
Nature
(1987) 326, 403
-405 .
35) Mayani H, Guilbert LJ,
Clark SC and Janowska-Wieczorek
A: Inhibition
of hematopoiesis
in
normal human long-term marrow cultures treated
with recombinant
human macrophage
colony
stimulating
factor.
Blood (1991) 78, 651-657.
36) Wetzler M, Kurzlock R, Lowe DG, Kantarjian
H, Gutterman JU and Talpaz M: Alteration in bone
marrow adherent
layer growth
factor expression;
A novel mechanism
of chronic myelogenous
leukemia progression.
Blood (1991) 78, 2400-2406.
37) Nakamura
M, Harigaya K and Watanabe Y: Correlation between production of colony-stimulating
activity (CSA) and adipose conversion in murine marrow derived preadipocyte
line (H-1/A).
Proc
Soc Exp Biol Med (1985) 179, 283-287.
38) Appelbaum FR, Fefer A and Cheever M: Treatment
of aplastic anemia by bone marrow transplan
tation in identical twins.
Blood (1980) 55, 1033-1039.
39) Camitta BM, Storb R and Thomas ED: Aplastic anemia:
Pathogenesis,
diagnosis,
treatment and
prognosis.
N Engl J Med (1982) 306, 645-652.
40) Bacigalupo A, Podesta M and Van Lit MT: Serve aplastic anemia:
correlation
of in vitro tests with
clinical response to immunosuppression
in 20 patients.
Br J Haematol
(1981) 47, 423-433.
41) Hotta T, Kato T, Maeda H, Yamano H, Yamada H and Saito H: Functional changes in marrow
Studies on human bone marrow stromal cells 285
Studies on human bone marrow stromal cells
Part 2. Growth and composition
of human bone marrow stromal cells
in chronic myelogenous leukemia (CML), myelodysplastic
syndrome (MDS)
and aplastic anemia (AA)
Toshiaki MATSUZAKI
Second Department of Internal Medicine,
Okayama University Medical School,
Okayama 700, Japan
(Director: Prof. I. Kimura)
Growth and composition of human bone marrow stromal cells (HBMSC) in CML, MDS and AA were studied by using modified Dexter's culture system. Growth was expressed by the percent of HBMSC at the bottom of the culture dish (% confluence) at the 1st, 2nd, 3rd and 4th week. Cells, harvested at the 4th week, were identified by monoclonal antibodies (anti fibronectin, anti-vWF, anti-CD14, anti-CD7, anti-CD4 and anti-CD8 antibodies) and oil red 0 staining method.
In normal healthy individuals (NC), % confluence at the 1st, 2nd, 3rd and 4th week were 74•} 4%, 82•}13%, 100% and 100% respectively (n=10). HBMSC were composed of 64•}4% fibro blastoid cells, 15•}3% endothelial cells, 9•}4% monocyte/macrophage, 3•}2% fat cells, 7•}3% T lymphocyte, 4•}1% helper/inducer T cells and 4•}1% suppressor/cytotoxic T cells, respec tively (n=8). In CML (n=6), % confluence at each week were almost on the decrease in comparison with those in NC and the cells tended to be detached from the bottom at the 3rd and 4th weeks. The composition of the HBMSC were not different in comparison with those in NC. In MDS (n=4), % confluence at each week and composition of HBMSC were not different in comparison with those in NC. In 3 of the 4 AA, % confluence at each week were not different in comparison with those in NC. Fat cells were markedly increased in one of 4 cases, which clinically belonged to the severe type of AA. In the other 3 AA, the percentage
of endothelial cells was increased up to 35%, 32% and 21%, respectively. The CD4/CD8 ratios were not different from those in NC.
These findings indicate that the pathophysiological analysis of hematological disorders should be done not only on hematopoietic stem cells but also on the hematopoietic microenvi ronment including bone marrow stromal cells.
