博 士 （ 理 学 ） 青 沼 仁 志
学 位 論 文 題 名
Neuronal IvIechanisms Underlying Synaptic Depression ofCrayflShNeurO―MuSCularSySten1
（ ザ リ ガ ニ 神 経 ― 筋 系 に お け る シ ナ プ ス 抑 圧 の 神 経 機 溝 に 関 す る 砌 ： 究 ）
学 位 論 文 内 容 の 要旨
動 物 は 周 囲 の 状 況 に 即 し た 行 動 を と る こ と で 環 境 に 適 応 し て い る 。 外 部 環 境 か ら の 様 々 な 信 号 は 刺 激 と い う 形 で 伝 え ら れ 、 動 物 は 特 定 の 感 覚 器 で そ れ ら を 受 容 し 、 中 枢 で の 情 報 処 理 統 合 を 経 て 、 適 切 な 行 動 バ タ ー ン が 形 成 さ れ る 。 こ の 際 、 莫 大 な 外 部 信 号 の 中 か ら 必 要 な 情 報 を 選 択 的 に 抽 出 し 、 不 要 な 信 号 を 排 除 す る 様 々 な 神 経 機 構 が 存 在 し て い る 。 馴 化 は こ の 不 要 な 信 号 を 排 除 す る 神 経 機 構 の ひ と つ で 、 シ ナ プ ス 抑 圧 と 連 鎖 し て 起 こ り 、 動 物 の 応 答 性 が 刺 激 の 繰 り 返 し に よ っ て 減 少 す る 現 象 で あ る 。 更 に 馴 化 は 記 憶 や 学 習 の 最 も 単 純 な 形 態 と 考 え ら れ て お り 、 シ ナ プ ス 抑 圧 の 神 経 機 構 を 明 ら か に す る こ と は 、 馴 化 成 立 の 際 の シ ナ プ ス 伝 達 の 可 塑 的 な 性 質 を 解 明 す る と 共 に 、 学 習 ・ 記 憶 と い っ た よ り 高 次 脳 機 能 の神経機構の 理解にっながる。
無 脊 椎 動 物 、 特 に 甲 殻 類 や 昆 虫 な ど の 節 足 動 物 は 個 々 の 神 経 細 胞 が 同 定 可 能 で 行 動 制 御 機 構 を 神 経 レ ペ ル で 解 析 す る 上 で 適 し た 実 験 材 料 で あ る 。 更 に 、 神経 一筋 標本 は特 定の 神 経 細 胞 と 筋 細 胞 の 活 動 を 同 時 に 観 察 で き 、 シ ナ プ ス 抑 圧 の 神 経 機 構 を 調 べ る 上 で 非 常 に 適 し た実験系であ る。
本研究は、 アヌリカザリガ二Pr ocam bar us clar kii (Girard)を実験材料に用い、腹部屈曲筋 と そ れ を 支 配 す る 運 動 神 経 間 の 神 経 筋 接 合 部 で 起 こ る シ ナ プ ス 抑 圧の 神経 機構 を解 析し た 。 ザ リ ガ ニ は 頭 部 ま た は 尾 部 へ の 強 い 刺 激 に 対 し 腹 部 を 屈 曲 さ せ 、 す ば や く 刺 激 源 か ら 遠 ざ か る逃 避行 動(tail‑flip）を示す。Tail‑flipは、司令神経として知られる巨大介 在神経(Lateral giant，Medial giant)の 発 火に より 、腹 部各 神経 節に1対ずつ存在する巨大運動神経motor giant (MoG)が 発 火 し て 一 群 の 腹 部 速 屈 曲 筋 が 収 縮 す る こ と で 起 こ る 。 屈 曲 筋 はMoGの 他 に non‑gant fast‑flexor運 動 神 経(FFMN)と 呼 ば れ る 運 動 神 経 に も 支 配 さ れ て い る が 、MoGは tail‑flipの と き だ け 発 火 す る 特 徴 的 な 運 動 神 経 で あ る 。MoGを 繰 り 返 し 電 気 刺 激 す る と 筋 細 胞 は シ ナ プ ス 抑 圧 を 示 し 、 筋 肉 の 応 答 は 減 少 す る 。 一 方 、 同 じ 筋 細 胞 を 支 配 す るFFMN を 繰 り 返 し 刺 激 す る と 筋 細 胞 は シ ナ プ ス 促 通 を 示 す 。 （1）MoGとFFMNの 電 気 刺 激 に 対 し て 、 同 一 筋 細 胞 が 全 く 異 な る シ ナ プ ス 応 答 を 示 す こ と 、 （2） こ れ ら 運 動 神 経 は 比 較 的 大 型 で 容 易 に 同 定 で き 、 選 択 的 に 刺 激 で き 、 長 時 間 に 渡 っ て 安 定し た記 録が 可能 であ る 、
（3） 神 経 一 筋 標 本 は 中 枢 に 比 べ 、 よ り 薬 理 学 的 実 験 に 適 し て い る こ と か ら 、 シ ナ プ ス 抑 圧 の 神 経 機 構 を 解 明 す る の に 最 適 の 実 験 系 と 考 え 、 電 気 生 理 学 ・ 神 経 薬 理 学 ・ 神 経 化 学 的 手 法を用いて解 析した。
MoGの 神 経 伝 達 物 質 は い ま だ 同 定 さ れ て お ら ず 、FFMNと 同 じ 伝 達 物 質 が 用 い ら れ て い
る のであれば 、何らかの 神経修飾作 用によって MoG とFFMN それぞれに対する筋細胞の 応答が逆転すると仮定した。そこで、 MoG の神経伝達物質をまず同定し（第1 ，2 章）、
一酸化窒素 (NO) が神経修飾物質としてシナプス抑圧に深く関与していることを明らかにし た（第3 、4 章）。
第 1 章： MoG の細胞体だけが選択的に青紫光照射により黄緑色の自家螢光を発することを 明らかにし、電気生理学的実験もしくは細胞内染色なしで MoG を容易に同定することが 叮能となった。
第 2 章： MoG を選択 的に電気刺 激して発火 させると、屈曲筋は興奮性接合部電位(EJP) で応答する。グルタミン酸を神経筋接合部に局所的微量投与すると、屈曲筋細胞は膜脱分 極し、すぐに脱感作した。膜脱分極はコンダクタンスの増加を伴い、逆転電位はO mV 付近 だった。MoG 刺激に伴う EJP 振幅は、グルタミン酸の灌流投与により可逆的に阻害された。
グルタミン酸拮抗剤ジョ口ウグモ毒 (JSTX) によりMoG のシナプス伝達は阻害された。従 って、 MoG の伝達物質はグルタミン酸であることが判明した。FFMN の伝達物質もグルタ ミン酸であることが知られてぃることから、筋細胞が示すシナプス抑圧及び促通が、単純 な伝達物質の違いなのではなく、運動神経側の伝達物質放出機構の違いによることが判明 した。
第 3 章：シナプス抑圧が神経伝達機構の修飾作用で起こると仮定すると、 MoG に対し抑制 性の修飾作用、 FFMN に対し興奮性の修飾作用を持つ物質があれば、それがシナプス抑圧 に関与している可能性が極めて高い。まず、高速液体ク口マトグラフイー法(HPLC 法）によ り MoG 細胞内含有アミノ酸を定性・定量的に解析した。神経修飾効果をもつことが知ら れている各種生体アミン・神経ペプチド及び、HPLC 法解析結果で得られたアミノ酸を灌 流 投与し、 MoG 及び FFMN の神 経伝達に対 する修飾作用を解析した結果、アミノ酸のー っアルギニンだけが、MoG に対しては抑制性、non ―giant に対しては興奮性の修飾作用をも つことが判明した。更に、アルギニンは筋細胞のグルタミン酸感受性を変ずに、運動神経 のグルタミン酸放出量を変えることも突き止めた。
第 4 章： アルギニン は NO 合成酵素 の基質であり、合成されたNO は伝達物質の放出を修 飾することでシナプスの可塑性に関与することが主に脊椎動物を使った実験から明らかに なりつっある。そこで、シナプス抑圧の神経機構にNO が関与している可能性について検 討 した。 MoG の発火に伴う EJP は、アルギニンを灌流投与すると可逆的に阻害され、 NO 発 生剤 NOC7 を灌流 投与するこ とで同様に 阻害された。一方、 NO 除去剤 Carboxy ‑PTIO を灌流投与すると、 EJP の振幅は可逆的に増大した。MoG を繰り返し刺激することで起こ る シナプス抑 圧は NOS 阻害剤 L‑NAME 灌流投 与により可逆的に阻害された。一方、 non‑
giant を同様に刺激し、L ―NAME を灌流投与するとそのEJP の振幅は逆に減少し元の灌流液 に 戻すことで回復した。バーオキシナイトライト (ONOO') 合成剤 SIN‑1 は NO と活性酸素 02 ．を同時に合成し、NO と 02 ・が反応することでONOO‑ を合成する。SIN‑1 を灌流投与す ると EJP の振幅は可逆的に増大し、シナプス抑圧は阻害された。一方、SIN ―1 とスーバー オキシドディスムターゼ(SOD) を同時に灌流投与するとEJP 振幅は殆ど変化が無く、シナ プス抑圧は阻害されなかった。
以上の結果から、（1 ）ザリガ二神経筋接合部におけるシナプス抑圧は、運動神経側の 伝達物質放出機構が修飾され、放出量が減少するために起こること、（ 2 ）ザリガ二末梢 神 経系に NO 合成系が存在し、NO がシナプス抑圧に重要な働きをしていることを初めて 明 らかにした。 MoG が発火すると、細胞内の NOS が活性化しアルギこンから NO を合成、
NO 濃度の増加で、グルタミン酸の放出量が抑えられる。中枢で見られる馴化成立過程に
おいても本研究で明らかにしたシナプス抑圧の神経機構がその基盤となっていることが十
分予想でき、本研究のさらなる展開によって記憶・学習といった高次脳機能の理解にひと
つの作業仮説を提出できると考える。
学 位 論 文 審 査 の 要 旨 主 査 教授 高畑雅一 副査 教 授 浦野明央 副査 助教授 鈴木教世 副査 助教授 長山俊樹
学位論文題名
Neuronal Mechanisms Underlying Synaptic Depression of Crayfish Neuro‑Muscular System
（ザリガニ神経―筋系 におけるシナプス抑圧の神経機溝に関する砌究）
近年 、ヒ 卜など高等脊椎動物を含 む動物の脳機能における記憶・学習等の可塑性の研究 が急速に伸展している。比較 的少数の辛19経細胞（ニューロン）によって遂行される無脊椎 動物の行動制御におぃても、 中枢ネlp経系機能の可塑性は、重要な働きを担っている。無脊 椎 動物 の神 経系は、個々の細胞を同 定することが可能であるという長所をもち、細胞・回 路 網 レ ベ ル で 可 塑 性 の 生 理 機 構 を 明 ら か に す る た め の 有 カ な 実 験 系 を 提 供 す る 。 本論文は、神経系機能の可塑性について、アメリカザリガニPrcロ腕みロ朋scぬ庇釘Girard の 神経 一筋 接合部を実験系として用 いて生理学的、解剖学的にそのシナプス抑圧の機序を 解 明す るこ とを目的として行われた 一連の研究結果をまとめたものである。ザリガニの腹 部 速 屈 筋は 、巨 大運 動神 経（MOG） およ び速 屈筋 運動 神経 （FF） によ り支 配さ れる 。運 動 神 経 の 活 動 電 位 に 対 し て 、 屈 筋 細胞 は脱 分極 性の 接合 部電 位 を発 生す る。 しか し、
MOGの 連 続活 動に 対し ては 接合 部電 位が 振幅 の減 少（ シナ プス 抑 圧） を示 すの に対 し、
FFの 連 続活 動に 対し ては 増加 （シ ナ プス 促通 ）を 示す 。本 論文 は、MOGの 用い る伝 達物 質 が 、FFと 同じ くグ ルタ ミン 酸で あ ると 同定 した 上で 、MOGか ら 屈筋 細胞 への 信号 伝達 に おけ るシ ナプス扛lJ圧に、一酸化 窒素（NO）が神経修飾物質として密接に関与すること を明らかにした。
実験 には 主に 腹音K単 離標 本 を用 い、 吸引 電極 を用 いてMOGを 選択的に刺激した。屈筋 細 胞の 接合 部電位は、ガラス管微小 電極による細胞内記録法により記録解析した。屈筋細 胞 の接 合部 電位 は、 グル タミ ン酸 の局 所投 与に よっ ても 引 き起 こすことができ、また、
MOGの 活動 に伴 う接 合音K電位 は、 グル タミ ン酸 の持 続投 与 によ る脱感作で減少し、さら に 、グ ルタ ミン 酸の 拮抗 薬（JTX） によ る阻 害を 受け るこ とな どか ら、MOGの伝達物質が グルタミン酸であることが実 験的に証明された。
次に、運動辛III経から述屈筋細胞へのシナプス伝述の修飾物質を探索した結果、各種アミ ノ 酸、 生体 アミン、辛IlI経ペプチドの中で、アルギニンのみがMOGから速屈筋細胞への伝 達 を抑 制し 、FFからの伝達を増強す ることが判馴した。また、ア´レギニン潅流時のグル タ ミン 酸局 所投与実験から、アルギ ニンは屈筋細胞のグルタミン酸応答性を変化させるの で は な く、MOGか らの 伝達 物質 放出 機構 に働 くこ とが 判明 した 。 アル ギニ ンは 、NO合成 酵 素の 基質 であ り、 合成 され たNOがシ ナプ ス可 塑性 に関 与 する ことが脊椎動物で報告さ れ て い る。 本研 究で は、NOが 、MOGから 屈筋 細胞 への 伝達 にお け るシ ナプ ス抑 圧に 及ば す 影 響 を調 査し た。 その 結果 、MOGの単 一活 動に とも なう シナ プ ス伝 達は 、ア ルギ ニン の ほ か 、NOの 発 生 剤 （NOC7） の 潅 流 投 与 に よ っ て も 阻 害 さ れ る こ と が 判 明 し た 。 ま ―71―
た、NOの 除去 剤で あるCarboxy‑PTIOを潅 流投与すると、シ ナプス伝達は可逆的に増強さ れ た 。 さ ら にNO合 成 酵 素 の 阻 害 剤 で あるL‑NAMEを 潅流 投与 する と、MoGの 繰り 返し 活 動に とも なう シナ プス 抑圧 は可 逆的 に阻 害された。一方、SIN‑1は、NOと活性酸索02‑を 同時に合成することが知られている。NOと02・は速 やかに反応して、パーオキシナイトラ イト （ONOO‑)が合 成さ れる 。SIN‑1の 潅流 投与 によ り、 シナ プス 抑圧 が阻害されること が確 認さ れた 。し かしSIN‑1を活 性酸 索の 除去剤であるSODと同時に投与すると、正常の シナ プス 抑圧 が観 察さ れた 。な お、FFの 連続活動にともな う屈筋細胞の接合部電位の増 強 は 、 L・ NAMEの 潅 流 投 与 に よ り 消 失 し 、 逆 に 減 少 が 観 察 さ れ た 。 以 上の 結果 は、MoGか ら屈 筋細 胞へ の伝 達に おけ るシ ナプ ス抑 圧に 、NOが密接に関与 する こと を示 して いる 。ザ リガ ニ腹 部神 経系 で 同定 され るMoGと 速屈 筋細胞との神経一 筋接 合部 での シナ プス 抑圧 は、MoGの 繰り 返し 活動 にと もな って 活性 化されるNO合成系 で作 られ るNOによって、MoG軸索末端からのグ´レタミン酸 放出量が減少することによっ て起こると結論される。
これを要するに、著者は、シナプス伝達におぃて 、前シナプス細胞の繰り返し活動に伴 うそ の抑 圧が 、前 シナ プス 細胞 の軸 索末 端に作用するNOを 介したメカニズムに基づくと いう 新知 見を 得た 。NOの生 理機 能を 、は じめて同定細胞レ ベルで具体的な行動制御に直 接関連づけて明らかにした本研究は、動物行動の神経機榊の解明を目指すネIIJ経行動学研究 の発展に貢献するところ大なるものがある。
よ って 著者 は、 北海 道大 学博 士（ 理学 ）の学位を授与さ れる資格あるものと認める。
