博 士 （ 環 境 科 学 ） 青 柳 一 彦

博 士 （ 環 境 科 学 ） 青 柳 一 彦

学 位 論 文 題 名

Expression of cherry salmon insulin‑like growth factor I       in Escherichia coli

（ 大 腸 菌 内 に お け る サ ク ラ マ ス ・ イ ン ス リ ン 様 成 長 因 子I型 の 発 現 ）

学 位 論 文 内 容 の 要 旨

  外 洋 に お け る サ ケ 、 マ ス の 捕 獲 は 資 源 量 保 護 の 観 点 か ら 年 々 厳 し く 制 限 さ れ つ っ あ り 、 現 在 、 日 本 近 海 の 在 来 サ ケ 、 マ ス 種 は そ の 資 源 量 拡 大 が 望 ま れ て い る 。 な か で も 、 高 級 魚 で あ る サ ク ラ マ ス は 最 も 資 源 量 拡 大 が 望 ま れ て い る 魚 種 で あ る 。 し か し な が ら 、 サ ク ラ マ ス は 稚 魚 生 産 の 効 率 が 悪 く 、 こ れ が 資 源 量 拡 大 の 妨 げ と な っ て い る 。   サ ク ラ マ ス 稚 魚 生 産 低 効 率 の 主 な 原 因 と し て 、稚 魚の 成長 不良 によ る死 亡が あげ られ る。

本 研 究 で は 、 こ の 問 題 の 解 決 に 成 長 促 進 作 用 を も つ 物 質 の 利 用 を 考 え 、 そ の 効 果 が 期 待 さ れ る 物 質 と し て イ ン ス リ ン 様 成 長 因 子I型 （ IGFーI） に 着 目 し た 。IGFーIは 成 長 ホ ル モ ン （GH） の セ カ ン ド メ ッ セ ン ジ ャ ー と し て 高 い 成 長 促 進 作 用 を 持 つ こ と で 知 ら れ る 低 分 子 量 蛋 白 質 で あ る 。 そ し て 、 現 在 ま で の 研 究 に お い て 、IGFーIはGHの 関 与 が な い 発 生 初 期 に も 存 在 し 、 そ の 時 期 の 成 長 を 促 進 て い る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 発 生 初 期 よ り 生 体 に 存 在 し 、 高 い 成 長 促 進 作 用 を も つIGFーIは サ ク ラ マ ス 稚 魚 の 成 長 を 効 率 よ く 促 進 す る も の と 考 え ら れ る が 、 サ ク ラ マ スIGFーIは 今 の と こ ろ 得 ら れ て お ら ず 、 こ の 試 み は な さ れ て い な い 。

  IGFーIを サ ク ラ マ ス 稚 魚 生 産 ヘ 応 用 す る た め の 研 究 は 多 量 の サ ク ラ マ スIGFーI を 必 要 と す る こ と が 予 測 さ れ る 。 と こ ろ が 、IGFーIは 生 体 に お け る 含 量 が 少 な く 、 研 究 に 十 分 な 量 の サ ク ラ マ スIGFーIを 得 る た め に は 遺 伝 子 工 学 的 手 法 を 用 い た 生 産 が 必 要 で あ る と 考 え ら れ る 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、 サ ク ラ マ ス 稚 魚 生 産 にIGFーIを 応 用 す る た め 、 サ ク ラ マ スIGFーIcDNAの ク ロ ー ニ ン グ と そ の 構 造 解 析 を 行 い 、 こ れ を も と に サ ク ラ マ スIGFーIの 大 腸 菌 内 で の 発 現 条 件 を 検 討 し た 。 ゛

  は じ め に 、 サ ク ラ マ スIGFーIcDNAの ク ロ ー ニ ン グ を 行 っ た 。 ま ず 、 サ ク ラ マ ス 肝 臓 よ り 精 製 し たmRNAよ り 、cDNAラ イ ブ ラ リ ー を 作 成 し た 。 次 に 、 他 の 生 物 のI GFー IcDNAを 参 考 に 合 成 し た オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と 、mRNAか ら 逆 転 写 酵 素 に よ り 作 成 し た 一 本 鎖DNAを 用 い た ポ リ メ ラ ー ゼ 、 チ ェ ー ン 、 リ ア ク シ ョ ン 法 （PCR法 ） に よ ル プ ロ ー ブ を 作 成 し た 。 そ し て 、 こ れ ら を 用 い て ス ク リ ー ニ ン グ を 行 っ た と こ ろ 、 長 さ4kbp前 後 の cDNAを8つ 得 た ． 8つ の cDNAは 制 限 酵 素 地 図 の 分 析 、 部 分 的 な 塩 基 配 列 の 決 定 よ り 、 同 一mRNA由 来 で あ る こ と が 判 明 し た 。 そ こ で 、 得 ら れ たcDN A中 一 番 長 い も の に つ い て 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 翻 訳 領 域 の 検 索 を 行 っ た と こ ろ 、 サ ク ラ マ スIGFーI前 駆 体 の ア ミ ノ 酸 配 列 と 思 わ れ る 176ア ミ ノ 酸 配 列 を 翻 訳 す る528塩

‑ 61ー

基が見いだされた。このアミノ酸配列とヒト

IGF

ーI 前駆体のアミノ酸配列の比較を行 っ た と こ ろ 、 ヒ ト

IGF

ー

I

前 駆 体 の ア ミ ノ 酸 配列 中 の

IGF

ー

I

部 分 と 約

80

％ の相 同 性 を示す

70

ア ミノ 酸配列 が見 いだ さー れ、得 られ たc DNA がサクラマスIGF ー

I

前駆 体のc DNA であることが示された。

  

次 に 、 得ら れた サク ラマ ス

IGF

ー

IcDNA

を 大腸菌 に導 入す るこ とによ り、 サク ラ マ ス

IGF

ー

I

の 発現 を行 った 。大腸 菌発 現系 におい て、

IGF

ーI は 分子量 が小 さく 塩 基性を示すため、発現後菌体内で速やかに分解される可能性がある。そこで、菌体内での 安定化のため、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させるよう発現ベクターを作成する こ と が 必 要 で あ る 。 今 回 、 サ ク ラ マ ス

IGF

ー

I

は

rTNF

ー

STH

と の 融 合 蛋 白 質と し て 発 現 す る よ う プ ラ ス ミ ド を 構 築 し た 。

r TNF

ー

STH

は サ イ モ シ ン

p4

と

Tumor necrosis factor

の融合蛋白質であり、Tac プ口モーターにより大腸菌内で高発現すること が知られている。そして、これに反応するモノクローナル抗体がすでに作成されており、

発現の確認に有利である。作成した発現ベクターを大腸菌に形質転換した後IPTG 存在 下 で 培 養 し 、 集 菌し た 後 、

SDS

電 気 泳 動 分 析 、

rTNF

ー

STH

の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 およぴヒトIGF ーI のポリクローナル抗体を用いたウエスタン分析を行った。その結果、

発現ペクターにより形質転換された大腸菌は発現ベクターにより形質転換していない大腸 菌に存在しない分子量約

31kDa

の蛋白質が発現していることが確認された。この分子 量 約

31kDa

の 蛋 白 質 は

rTNF

ー

STH

の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 、 ヒ ト

IGF

ー

I

の ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 両 方 に 反 応 し た 。

rTNF

ー

STH

（

23kDa

） の 分 子 量 と 予 想さ れ る

IGF

ー

I

（

7.5 kDa

） の 分 子 量 の 和 が

30.5 kDa

で あ る こ と か ら 、 こ の 分 子 量 約

31kDa

の 蛋 白 質 は

rTNF

ー

ST H/IGF

ー

I

融 合 蛋 白 質 で あ る こ と が 示 唆 さ れた 。

  

次に、発現している分子量約31kDa の蛋白質を大腸菌から精製した。菌体内で発現 が確認された融合蛋白質はインクルージョンボデイーを形成しており、不溶性であった。

そこで、この大腸菌を超音波破砕し、遠心分離することにより不溶性画分を回収した。次 に、大腸菌の破砕残骸を除くため、回収した不溶性画分を蔗糖溶液に懸濁した後、遠心分 離によルペッレトを回収した。次に、回収したぺッレトから表面活性剤により膜蛋白質を 除 い た 。 そ し て 、こ の よ う に し て 精 製 さ れた

rTNF

ーSTHII GF ー

I

融合 蛋白 質の イ ン ク ル ー ジョ ンボ デイ ーを ウレア によ り可 溶化し た。 この 時点 でrTNF ーST H/IGF ー

I

融 合 蛋 白 質 の収 量 は

20g

の 大 腸 菌 か ら 約30mg で あっ た。こ のう ちサ クラマ スI

GF

ー

I

は

10mg

で あ る 。 次 に 、 精 製 し た

31kDa

の 蛋 白 質 が

rTNF

ー

STH/IG F

ーI 融合蛋白質であることを確認するため、可溶化した融合蛋白質をSDS 電気泳動と そこからのバンドの切り出し注出によりさらに精製し、アミノ酸分析を行った。結果とし て 、 こ の

31kDa

の 蛋 白 質 の ア ミ ノ 酸 組 成 は

rTNF

ー

STH/I GF

ー

I

融 合 蛋 白 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 反 映 し 、 精 製 し た

31kDa

の 蛋 白 質 が

rTNF

ー

STHIIGF

ー

I

融 合 蛋白質であることが確認された。

  

次 に 、 この 融合 蛋白 質か らサク ラマ スIGF ー

I

を 切り 出す こと を試み た。

rTNF

ー

STHII GF

ー

I

融 合蛋 白 質 は プ ロ テ ア ー ゼ

Factor Xa

が認 識する アミ ノ酸 配列が

rTN F

ー

STH

と

IGF

ー

I

の 間に 入る よう、 その 発現 プラス ミド 構築 のさ い考慮 して ある 。 そ こ で 、

Factor Xa

に よ り

rTNF

ー

STHII GF

ー

I

融 合 蛋 白 の 切 断 を 試 み た 。 結果 と し て 、 そ の 融 合 蛋 白 質 は

rTNF

ー

STH

抗 体 に 反 応 す る

23kDa

の 蛋 白 質 と

IGF

ー

I

抗 体 に 反 応 す る

lOkDa

に 分 か れ た 。 こ の う ちlOkDa の 蛋 白 質 は そ の 分 子 量と 、

IGF

ー

I

抗 体 へ の 反 応 か ら サ ク ラ マ ス

IGF

ー

I

で あ る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た 。

‐ ―62―

  

今回の研究によルサクラマスIGF ーI の組変え蛋白質を得ることができた。今後、こ

の組変え蛋白質はサクラマス稚魚生産の効率を上げるために貢献するものと思われる。

学 位 論 文 審 査 の 要 旨 主査   教授，小島   豊

副査   教授   角皆静男

副査   教授   実吉峯郎（西東京科学大学）

学 位 ゜ 論 文 題 名

Expression of cherry salmon insulin‑like growth factor I       in Escherichia coli

（大腸 菌内 にお ける サク ラマ ス・ イン スリ ン様 成長 因子1型の 発現）

  外洋 におけるサケ、マスの捕獲は資源量保護の観点から年々厳しく制限されつっあり、

現 在、 日本近海の在来サケ、マス種はその資源量拡大が望まれている。なかでも、高級魚 で ある サクラマスは最も資源量拡大が望まれている魚種である。しかしながら、サクラマ ス は稚 魚生産の効率が悪く、これが資源量拡大の妨げとなっている。サクラマス稚魚生産 低 効率 の主な原因として、稚魚の成長不良による死亡があげられる。申請者はこの問題の 解 決に 成長促進作用をもっ物質の利用が有効であると考え、その効果が期待される物質と し てイ ンス リン 様成 長因子I型 （IGFーI）に 着目 した。

  IGFーIは 成 長 ホ ルモ ン （GH） の セ カ ン ド メ ッ セ ン ジ ャ ー と し て 高 い 成 長 促進 作 用 を 持 っ こ とで 知られ るポ リペ プチ ドで ある 。そ して 、現 在ま での 研究 におい て、IGFー IはGHの関 与が ない 発生 初期 にも 存在 し、 その時 期の 成長 を促 進て いる こと が報 告さ れ て い る 。 発 生 初 期 よ り 生 体 に 存 在 し 、高 い成長 促進 作用 をも つIGFーIはサ クラ マス 稚 魚 の 成 長 を 効 率 よ く 促 進 す る も の と 考え られる が、 サク ラマ スIGFーIは今 のと ころ 得 ら れて おら ず、 この 試みは なさ れて いな い。

  IGFーIを サ ク ラ マ ス 稚 魚 生 産 ヘ 応 用 す る た め の 研 究 は 多 量 の サ ク ラ マ スIGFーI を 必 要 と す る こ と が 予 測 さ れ る 。 と ころ が、IGFーIは生 体に おけ る含 量が 少な く、 研 究 に 十 分 な 量 の サ ク ラ マ スIGFーIを 得る ために は遺 伝子 工学 的手 法を 用い た生 産が 必 要 で あ る と 考 え ら れ る 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、 サ ク ラ マ スIGFーIcDNAの ク 口 ー ニ ン グ と そ の 構 造 解 析 を 行 い 、 こ れ を もと にサク ラマ スIGFーIの大 腸菌 内で の発 現条 件 を 検討 した 。

  は じ め に 、 サ ク ラ マ スIGFーIc DNAの ク 口 ー ニ ン グ を 行 っ た 。 他 生 物 のIGFー

Ic DNA

の 構 造を た より に サク ラ マス 肝 臓由 来

cDNA

ライ ブ ラリ ー のス ク リー ニ ング を 行 っ た と こ ろ 、

4089bp

の

cDNA

を 単 離 し た 。 そ の 全 塩 基 配 列 を 決 定し 、 翻 訳領 域 の検 索 を行 っ たと こ ろ、 サ クラ マ ス

IGF

ーI 前 駆体のア ミノ酸配列 と思われる

176

ア ミノ 酸 配列 を 翻訳 す る

528

塩 基 が 見い だ され た 。このアミ ノ酸配列と ヒト

IGF

ー

I

前駆体の アミノ酸配 列の比較を 行ったところ、ヒト

IGF

ーI 前駆体のアミノ酸配列中の

IGF

ー

I

部 分 と 約

80

％ の 相 同 性 を 示 す

70

ア ミ ノ 酸 配 列 が 見 い だ さ れ 、 得ら れ た

cD NA

がサクラマスIGF ーI 前駆体のcDNA であることが示された。

  

次 に 、得 ら れた

c DNA

を用 い て、 大 腸菌 内 にお ける サクラマス

IGF

ーI の発現を行 っ た 。 菌 体 内 に お け る

IGF

ー

I

の 安 定 化 の た め 、

rTNF

ー

STH

（ サ イ モ シ ン

p4

と

Tumor necrosis factor

の融合蛋白質）との融合蛋白質として発現するようプラスミドを構築 した。プ 口モーターとしてはTac プ口モーターを使用した。作成した発現プラスミドを 大 腸 菌 に 形 質 転 換 し た 後

IPTG

存 在 下 で 培 養 し 、

rTNF

ー

STH

の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体および ヒト

IGF

ー

I

のポ リクローナ ル抗体を用いたウエスタン分析を行った。その結 果 、

rTNF

ー

STH

の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 、 ヒ ト

IGF

ー

I

の ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 両 方 に 反 応 す る 分 子 量 約

31kDa

の 蛋 白 質 が 発 現 し て い る こ と が 確 認 さ れた 。

rTNF

ー

S TH

（

23kDa

） の 分 子 量 と 予 想 さ れ る サ ク ラ マ ス

IGF

ー

I

（

7.5 kDa

） の 分 子 量 よ り 、 こ の 約

31kDa

の 蛋 白 質 は

rTNF

ー

STHII GF

ー

I

融 合 蛋 白 質 で あ る こ と が 示唆され た。そこで 、この

31kDa

の蛋白質を 大腸菌から 精製し、ア ミノ酸分析を行つ た と こ ろ 、 そ の ア ミ ノ 酸 組 成 は

rTNF

ー

ST H/IGF

ー

I

融合 蛋 白 質の ア ミノ 酸 配列 を 反 映 し て お り 、 こ れ が

rTNF

ー

STHII GF

ー

I

融 合蛋 白 質で あ る こと が 確認 さ れた 。

rTNF

ー

STHIIGF

ー

I

融 合 蛋 白 質 は プ ロ テ ア ー ゼ

Factor Xa

が 認 識 す る ア ミ ノ 酸 配 列 が

rTNF

ー

STH

と

IGF

ー

I

の 間 に 入 る よ う 、 そ の 発 現 プ ラ ス ミ ド 構 築 の さ い 考 慮 し て あ る 。 そ こ で 、

Factor Xa

に よ り

rTNF

ー

STHII GF

ー

I

融 合 蛋 白の 切 断を 行 つ た とこ ろ 、切 断 に成 功 し、 サ クラ マ ス

IGF

ーI を 得ること ができた。 サクラマス

IGF

ーI の収量としては大腸菌20g から10mg 得ることができた。

  

以上のよ うに申請者 は、産業上 重要魚種で あるサクラ マスの

IGF

ーI の一次構造を

c DNA

より 決定したばかりか、このポリペプチドの大腸菌発現系による精製にも成功して いる。今 後、この研 究成果はサ クラマスの発生、成長におけるIGF ーI の機能の解明、

そして、それをもとにしたサクラマス増養殖技術発展に大きく貢献することが期待される。

  

審査員一同は、これらの成果を高く評価し、また研究者として誠実かつ熱心であり、大 学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（環境科学）の学位を受けるの に充分な資格を有するものと判定した。

ー 65ー