予 後 因子 意義 非 原発性 小細 胞 肺癌 け 蛋 白 蛋 白 発現

9 6 金沢 大 学 十 全 医 学 会 雑 誌 第^{1 0 6}巻 第¹ 号 ^{9 6}‑^{1 0 4} (19 9 7)

原 発 性非小 細胞肺 癌 ^におけ^{るB cト2} 蛋白お ^よ び_{p5 3} 蛋白発 現 ^の 予後因子 ^{と して の}意義^{に つ い て}

金沢 大 学 医 学 部 医 学 科 外 科 学 第 ^血講 座 ( 主 任^: 渡辺洋 字 教 授)

大 竹 由 美 子

原 発性 非 小 細 胞 肺 癌1 6 8例を対 象に Bcl^‑2 蛋 白お よ びp5 3蛋白^の発 現 を 免 疫 組 織 学 的^に評 価し, 肺 癌^の予 後 因 子^{と し ての} 意 義 を検 討し た^. Bcl^‑2 蛋 白 発 現^の陽性 率^は全 体^{2 9.8 %} , 組 織 型 別^{で は}扁 平^上皮 痛が 3 8^.4 % と腺 病2 3^.7 % に対し有 意に高かった (p^<0^.0 5)^. 病 期 別^の Bcl^‑2 蛋 白 発 現 陽 性 寧は Ⅰ期, Ⅲ期, Ⅲ期, Ⅳ期^の4 群 間^{で は}有 意 差^{は み ら れ}なか っ た が Ⅰ, Ⅲ期^{と Ⅲ},

Ⅳ期^の2 群 間^の検 討^{で は Ⅰ}, Ⅱ期^で有 意^に陽性 率^が高か ^った(p^<0.0 5) ^∴性別, 年齢, T国子, N因 子, M 国 子^の検 討でもBcl^‑2 蛋 白 発 現 陽 性 率に有 意差は認め ら れなか^っ た が, 生存率と^の相 関^{で は Bcl‑2} 蛋 白 発 現 陽 性 症 例^が陰性 症 例に対し有 意に良好 な 予 後^を示^{し た} b^{<0.0 5})^{. これ}を 組 織 型 別^{に み た}場 合, 腺 疇で は Bcl‑² 蛋 白 発 現 陽 性 例と陰 性 例で予 後^に差は認め ら れなか^った^･ 扁 平上皮 癌で は Bcl^‑2 蛋 白 発 現個 性 例は陰 性 例に対し有 意^に予 後^が良 好^であっ た(p^<0.0 5)^. p5 3蛋 白 発 現^のl劉 生率は全体で 6 2,5 %, 組 織 塑 別^{で は}扁 平^上皮痛で7 1.2 % と瞳 癌5 7^.0 % に対し高かった が, 有 意 差は認め ら れ な か^っ た^･ 性 別, 年 齢, 病 期, T 因 子, N 因子, M 因 子^の検 討でもp5 3蛋 白 発 現 陽 性 率^に有 意 差^は認^{め ら れ}なか ^っ た. 生 存 率^との相 関で は_p5 3蛋 白 発 現 陽 性 症例 が陰 性 症 例^に対し有 意に不 良な予 後を 示し た b ^{<0.0 5})^. Bcl^‑2 蛋 白 発 現とp5 3蛋 白 発 現^の予後因 子と し ての有 用 性 を 検 討^{し た と}

ころ全 体お よ び腺 病^{で は}p5 3蛋 白 発 現^{のみ が}有 用^であ り, 扁 平^上皮 癌で は Bcト2 蛋 白 発 現^のみ が有 用であ^った^･ 以 上の結 果か ら原 発 性 非 小 細 胞 肺 癌に おける Bcl^‑2 蛋 白 発 現は扁 平上皮 痛^に多 くみ ら れ, 原 発性 非 小 細 胞 肺 癌, こと に腺 病^{に お}けるp5 3蛋 白 発 現お よ び扁平上皮癌に おけ^{る Bcl‑2} 蛋 白 発 現^{は と}もに有 用^な予 後 国 子と なり うる と考 えら れ た^.

E ey ^{w o r}ds n o n^‑S m all c ell lu ng c a n c e r_,Bcl^‑2 _pr otein

,P5 3_pr otein,aP^Op t^{O S}is,P^{r O}g^{n O S}ticfa cto r

肺 癌 症 例で は臨 床 的に予 後が良 好と考 えら れ る群に お^いても 不 良 な 予 後 を 呈 す^るも^のが少 な^{か ら}ず 見 う け^{ら れ}, 臨 床 軋 病 理組 織 学 的 予 後 国子^のみ な らず, 細 胞生物 学 的 予 後 因 子が関与 し て^いる^{l }}. な か でも 頼 通 伝 子^{お よ び}癌抑 制 遺 伝 子^の閲う^･が さ ま ざ ま な研 究 者に よ って検 討さ れて いる^. Bcl^‑2 はヒト濾 胞 性 リン パ腫^で認^{め ら れ たt}(1 4 ; 1 8) (q 3 2 ;q2 1) ^の転 座 点 近 傍に存 在 する癌 遺 伝 子で, ア ポ ト ^ー シ^スを抑 制 す^{ること が}知^{ら れ てい} る^恥4). 他^の多 く^の癌 遺 伝 子^{と は}異 な り, 直 接 細 胞 増 殖に関 与 するので はな く, ア ポ ト^ー シスを 介し て細 胞 増 殖^に関 与 す^{る5 ).} またp5 3 は癌 抑 制 遺 伝 子^のひ とつである が, これ が欠 損 あ^るい は変 異 する と^アポ ト^ー シスが誘 導^{さ れ}ず, 損 傷^{D N A が}複 製^さ れ発 痛^{の 一}因となる^{即 ).}

本 研 究^{で はこ}れ ら^のア ポ ト ^ー シス制 御^に関^{わ る}痛 関 連 遺 伝 子

の発 現を免 疫 組織 学 的に評 価し, 肺 癌^の予 後 因子と し ての意 義 を検 討^{し た.}

対 象お よび方 法

Ⅰ^. 対 象

1 9 8 7年¹月か ら1 9 9 1年1 2月 ま^でに金 沢 大 学 医 学 部 第 ^一外 科 学 教 室で外 科 的 治 療 を 行っ た原 発性 非 小 細 胞 肺 痛 症 例^のう ち 病 院 病 理 部^に保 存^{さ れ ている1 6 8}症 例^{の パ}ラフ ィ ンブ^ロ ックを対 象 と し た^. 男性1 2 1例, 女 性^{4 7}例, であ り 年 齢^{は3 7}歳^{か ら8 4}歳 ( 平 均6 5.3歳) ^であっ た. 肺 癌 取 り 扱^い規 紆^】に よ る病 期 分 類^の内 訳

は

, Ⅰ期^{5 9}例, Ⅲ期^{2 9}イ札 ^ⅢA 期^{4 4}例, ⅢB期2 9例, n^r･期7例で

あり, 組 織 型 別で は腺 病9 5例, 扁 平上皮 癌7 3例であ^{っ た.} 1Ⅰ. 免疫 組 織 染 色 法

1^. Bcl^‑2

Bcl^‑2 に対 す^{るパラフ ィ ン}包捜さ れ た癌 組 織を4_′′∠m の厚さ に 薄 切し, シ ラ^{ンコ ー} ティ ングスラ イ ド( 武 藤 化 学, 東 京) ^に付 着^{さ せ}, 1 0 0 % キ シ^{レ ン}で 1 0分 間, 3回^の脱^パラフ ィ ンを 行^った 後, 1 0 0 %, 1 0 0 %, 1 0 0 % , 9 0 %, 7 0 % のエタ^{ノ ー ル}に て各3分間親 水^し, 流 水 水 洗し た^. 次に0^.0 1 M ク^エ ン酸 積 衝 液 (0^･1 M ク^エン 醸) ^2.1gを 蒸 留 水^{1 0 0 0ml に}溶^{か し}, 2 N の水 酸 化^{ナ トT) ウ ムにて} 聞 6^.0 に調 整) に て 50 0 W , 5分 間, 3回^{の マ} イ ク^ロ ウエ ^【 ブ処理 を行^{っ た.} そ^の後^{2 0}分 間 室 温^{に て0.3 %}過 酸 化 水 素 加^メタ^{ノー ル} で内 因性^{ペ ル}オ キ シ ダ ^ー ゼ を阻 害し た^. 次に ウ^シ正^′尉^血清 (ダ

コ ジャ パ ン, 京 都) を 用^{い て ブロ ッ キング を}行い, pH 7^･2のり ン酸 綬 衝 食 塩 水 (pho sphate^‑bufEe r ed s alin e, P B S)^にて洗 浄し,

抗 ^Bcl‑2 蛋 白 抗 体 (^{Clo n e1 2 4}) (^{ダコ ジャ パ ン}) をP B S に て4 0倍 に希 釈し, 室 温で1時 間 反 応さ せ た^. 続^{いて P B S に て 5}分臥 ³ 回 洗 浄 後, ピ オ ナ^ン標 識抗マ ウス_, 抗ウ サ ギ ^･ ヤ ギ抗 体 (^ダコ ジャ パ ン) を用^いて室 温^{に て 2 0}分 間反 応^{さ せ}, P B S で 5分間, 3 回 洗 浄し,

ペ ルオ キ シ ダ ^ー ゼ標 識^ス トレプ ト ア ピ ジ^ン(^ダコジ

ャ パ ン) ^で室 温^{に て2 0}分 間 反応^{さ せ た.} 発 色 剤は 四塩 酸^{3, 3 ̀･} ヂ^アミノ ベ ンチ ジン(3,3^‑di am in obe n zi din etetr ah_ydr o ch llo rid^e･

D A B) ( 和 光^, 束 京) ^{2 0m}gを1 0 0ml^のP B S に溶 解し, 1 0_p13 0 %過

平 成⁸ 年1 2月3 日受付, 平 成⁹ 年¹ 月^{2 0}日受^理

A b br evi atio n s: D A B, 3,3^‑diami n ob^{e n z}idin e tetr ah_ydr o chllo ride; P B S,Ph o sph ate^‑bu 鮎r ed s alin e

酸化水 素水 を 加 え 作 製^{し た｡ P B S で 5}分 間, 3回 洗 浄複, こ の発 色剤を用^い室 温に て顕 微 鏡で発色 状 態 を確 認し な が ら3 ^〜7分 間 反応^{さ せ1 0}分流 水 水 洗し, マイ ヤ ^{ー ･ ヘ マ} ト キ シ リ^ン( 武藤 化 学) に て1分 間核 染 色を行^った･ そ^の後 流 水 水 洗に て10分 間 色 出 しを行^っ た^. 9 0 %, 1 0 0 %, 1 0 0 %, 1 0 0 %のエ タノ^ー ルにて各³分 間^の脱 水^を行^っ た後, 1 0 0 % キ シレ ンに より3分 間, 3回^の透徹 を 行^{い, マリノー ル}( 武 藤 化 学) ^{に て}封^{入 を}行^{っ た･}

2. p 53

パラ^{フ ィ ン}包 捜さ れ た癌 組 織を 4_〃m の厚^{さ に}薄 切^し, シ ラ^ン

コ ^ーティ ング^スラ イ ド に付 着さ せ, 1 0 0 % キ シ^{レ ン}で1 0分 間, 3 回^の脱^{パラフ ィ ンを}行^った後, 1 0 0 %, 1 0 0 %, 1 0 0 %, 9 0 %, 7 0 % のエタ^{ノ ー ル}に て各3分 間 親 水し, 流 水 水 洗し た 次に 0^.0 1 M ク

エン酸緩 衝 液 中に て 5 0 0 W , 5分 間, 3回^の マイ ク^ロウ^{エ ー} ブ処 理を行^{っ た.} そ^の後^{2 0}分 間 室 温^{に て0.3 %}過 酸 化 水 素 加^{メタノ ー}

ルで内 因性^ペルオ キ シ ダ^ー ゼを 阻害^{し た.} 次に ウ シ 正常血清を 用^{いて ブロ ッキング}を 行^い, P B S に て洗 浄^し, 抗p5 3蛋 白 抗 体 (^{D O‑7}) (^{ダコ ジャ パ ン}) を P B S に て 1 0 0倍に希 釈し, 室 温で 1時 間反 応^{さ せ た.} 続^いて P B S に て5分 間, 3回 洗 浄 後, ビ オ ナ ^ン標 識抗^マウ^ス, 抗ウ サ ギ ^･ ヤ ギ抗 体を用^いて室 温に て2 0分 間反 応 させ, P B S で5分 間, 3 回 洗 浄し, ペ ルオ キ シ ダ^ー ゼ標 識^スト レプ ト ア ピ ジ^ンで室 温に て2 0分 間 反 応さ せ た^. P B S で 5分 間, 3 回洗 浄後, 発 色 剤で室 温に て顕 微 鏡で発 色 状 態を確 認しなが ら

B

Fig^･1･ Im m u n oh isto che mic al staining of Bcl^〜2 in epide r m oi d

C a r cin o ma^. T he cy topla s m of Bcl^‑2 _pr otein p^{o s}itiv e c ell w a s Stain edstr o ngly(朗, ×4 0;(^B), ×4 0 0^.

3 ^､7分 間 反応さ せ, 1 0分 間 流 水水 洗し, マイ ヤ ^{ー ･ ヘ} マト キ シ リ^ンに て 1分 間 桟 敷 色^を行^{った. その}後 流 水 水洗^{に て10}分 間 色 出しを 行った^. 9 0 %, 1 0 0 %, 1 0 0 %, 1 0 0 % のエ タノ ^ー ルに て各3 分 間脱 水 を 行っ た後, 1 0 0% キ シレ ンに より3分 間, 3回の透 徹^を 行^い, マリ^{ノ ー ル}に て封入 を行^っ た^.

】Ⅰ【^. 免疫 組 織 染 色の判 定

透 過 光 顕 微 鏡 画 像 解 析 装 置 C A S 2 0 0 イ^メー ジ分 析 装 置 (^Cell A

n aly^sisSyste m ,E lmhu r st_,U S A) を 用^い免 疫 組 織 染 色 強度を定 量 的に測 定^{し た. マ イ ヤ ー ･ へ マ ト キ シ リンに よ る}核 染 色^は 6 2 0n m の波 長で測 光し, D A B の染色 強度 (O D) は5 00n m の波長

で測 光し た.

1 . B^cl^‑2^の染 色 強度^の測 定

Bcl^‑2 の染 色 強 度^の測定に は細 胞 計 測プロ グ ラムを 用^い, 細 胞 質^の平均 吸 光 度 を 測 定し た^. 陰 性 標 準 標 本^の平均 吸 光 度 測定 は 5標 本か ら任 意に選 択し た 1 0 ^〜1 5視 野で お^こな^った^. 染 色標 本^の平 均 吸 光 度 測 定^は膿瘍^{のリン パ}球 浸 潤^の少ない部 分^を任意 に選 択し, 1 0 ^､1 5視 野で おこなっ た^. 陰 性 標 準 標 本^の吸 光 度 測 定に より 得^{ら れ た}値^の平均 値^をもと め､ 平 均 値^{以 上 を}陽 性^､ 平 均 値 未 満 を 陰性と判 定し た｡

2 ^. _p5 3^の染 色 強 度^の測 定

p5 3の染 色 強度^の測 定^{に は}, E R/^{P R}定 量 分 析 法^を用^い, 全 柁 面 積に対 する D A B で発 色し た核^の面 積 比 ( 陽 性 面 積 比, %

十

一 ナ

て

十

↑ 十

二

く

∵十 十 ナ

S む S 再 0

‑

O

｣

0 0 q

∈

コ Z

Cy^{top la $ m a V e r age OP tic a}lde n sity

F ig^.2. H istogr a m ofa v e r age op tic al de n si_{t y} of Bcl^‑2 staining iⁿ

Cy tOpla s m ^. T he c utoff p^ointw a sde丘n eda sl^.0 5 2,Which isthe a v e r ag^ein n eg^ativ e c o ntr oI stud_y (a r r o w)^. T he cy topla s m a v e r ag^{e o}p tic al de n si_{t y}of le s stha n l^.0 5 2w a s r ega rdeda s Bcl^‑ 2 _pr otein^‑P^{O S}itiv e, a nd thatof l^.0 5 2 0 r m O r e W a S r ega rded a s

Bcl^‑2pr otein n egativ e^.