慢性 関節リ ウ マチ滑膜細 胞由来 m atrix m etallo pr otein a s e 2 くゼ ラテ ナ ー ゼ1 の性質と活 性 化機構
金沢大学 医学 部整 形外科 学 講 座く主 任二野村 進 数 掛
安 井 厚
く昭和6 3年7 月6 日受 付I
M atrix m etallopr otein a s e 2 くM M P−21 の性 質と活 性 化機 構を解 明す る た めに， マ クロ ファ ー ジ 調 整 培 地で処理 し た R A 滑 膜 細 胞 培 養 液よ り 4 つ のカ ラムク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー によっ て滞 在 型 M M P．2 を精 製し た． 精 製さ れ た潜 在型 M M P−2 は， 還元， 非 還 元 状 態にかかわ らず， S D S− ポ リ ア ク リルアミド ゲル電 気泳 動に お い て分子量74，00 0 の単一 なバ ンド と して観 察さ れ た， M M P−2 の活 性は
ethyle n ed ia min etetr a a c etic a ci d くE D T Al ， 1 ， 1 0 − フ ェ ナン ス ロ リン及 び tis s u e inh ibito r of
m etallopr otein a s e くT 工M Pl によ り阻 害さ れ た が， シ ス テ インプロ ティナ ー ゼ， セリン 宛 ティナー ゼ
及び アス パラギン酸プロ ティナ ー ゼ阻 害 剤で は阻 害さ れ なか った− 1 JL g の M M P−2 は3 70CでI 型 ゼ ラ
チンを 2 5．5FL gl min 分 解す る他， プロテ オ グ リ カンとエラステンを そ れ ぞ れ 2 0ngノmin と 8ngl min 分 解し た． さ らに， 3 20C に おいて 押塾及び V 型コ ラー ゲンを， ま た， 3 70C でラミ ニ ンを分 解し た． しか
し， フ ィプロ ネ ク ナンや 王 型コ ラー ゲン に対す る活 性は み ら れ な かった． これ ら の結 果は− M M P−2 が
コラ ゲ ナ ー ゼ と の協 同 作用によ り問 質 性コラ ー ゲンを分 解す る ばかり で な く， 基底 膜 構 成々分の破壊に も重 要な役 割を演 じ てい る 可能 性のある こ と を 示唆 し てい る ． 潜 在 塾 M M P −2 は 1．Om M
N H TP h．H g．Ac と3 70C で 5 分 間作用 さ せ ることによ り最も強く活 性 化さ れ た− N H 2−P h．Hg−Ac によ る 満 性 化 後そ の活性は不 安 定であ り， N H2
−P b．Hg．Ac を除 去 後も同 様であった． 1■Om M N H TP h−Hg−Ac によ る活 性 化 後． 潜在 型M M P−2 は還 元状 態で分子量6 7，0 0 0 の活 性 型M M P．2 に低 分子化し一次いで よ り小さ なフラ グ メントに分 解さ れ た． N H2−P h−H g−A c によ る滞 在 型M M P−2 の低 分子化は温 度 依 存性で ぁり， E D T A の存 在に よ り完 全に阻 害さ れ た． ま た， ト リ プシ ン， プ ラス ミ ン， トロ ンビン， 好 中球エ ラスター ゼ及び好 中球カ テ プシ ンG な ど の蛋 白 分解 酵素は潜 在型 M M P−2 を活性 化し な かっ た． これ ら
のデ ー タ は， 潜 在 型 M M P−2 の酒性 化が蛋 白分 解 酵 素によ る限 定 分 解では行わ れず， 酵 素 蛋 白のコ ン
フ ォメ ー ションを変 化さ せ る何ら か の因子によ り生 ずること を強く 示唆している■
Key w．o rds m etallopr otein a s e， Ch a r a cte riz atio n ， a Ctiv atio n， rhe u m atoid
a rthritis，Syn O Vial c e11s
慢 性 関 節リ ウマ チ くrhe u m atoid a rthritis， R Al は， 抗原 一抗 体 複 合 体を起 炎 物 質と し て慢 性 増 殖 性 滑 膜 炎を生じ， その結 果 関 節 軟 骨や関 節 周 囲 組 織が 破 壊さ れ る疾 患である． R A に おけ る関 節 軟 骨 破 壊
には， 炎 症 性 細 胞に由来す る活 性 酸 素や荷重によ る 機械 的ストレ スな ど種々の因子 が関 与す る が， その
細 胞 間マ ト リックス構 成々分の分 解には蛋 白 分 解 酵
素が 主役を演じ る と考え ら れ ている1 −． これ らの蛋白 分 解 酵 素の う ち 金属 依 存 性 蛋 白 分 解 酵 素であ る
m atrix m etallopr otein a s e くM M Pl は， 培養 滑 膜細 胞によ り合 成． 分泌さ れ ること や， 関 節 構 成 組 織に 存 在す る ほ と ん ど すべての細 胞 間マ ト リッ ク ス成分 を分 解し得ることか ら， R A にお け る関 節 破 壊に重 要な役 割を果た す と推 定さ れて いる． 培 養R A 滑膜
A b br e viatio n s こ D I F P， diis opr op yl flu o r oph o sph atei D M E M ， Dulbe c c o，s m odified E agle，s m ediu 町 E D T A ， ethyle n edia min etetr a a c etic a cid i E H S ， Engelbr eth −H olm −Sw a− r 町 M M P
， m atrix m etallopr otein a s e i P A G E， pOlya c ryla m ide gel ele ctr opho r e sisi
慢 性 関 節リウマ チ滑膜 細 胞 由 来 ゼ ラ テ ナ ー ゼ
細胞に由 来す る M M P には 現在まで に3 種 類が区 別 さ れて おり， M M PTl はコ ラゲ ナ ー ゼ2 13 l， M M P −2 は
ゼラ テ ナー ゼ4，5 1， M M P−36 ，はpr ote oglyc a n a s e刀あ る
いは Str O m elysin即 と呼ば れ る酵 素に相 当す る．
M M P−3 は軟 骨プロテ オ ブ リ カンやフ ィブロ ネクテ ン のほか基底 膜 構 成々分であ る1 V 型コ ラ ー ゲンやラ ミニ ンを分解す ること が報 告さ れ ている6 けI．
一 方，
M M P −1 は問 質 性コラ ー ゲン であ る I ，工工，工Ilコ ラー ゲンを その分子の アミ ノ末 端から3ノ4 の部 位で特 異 的
に分解す る ほか， 軟 骨に存 在す る X 型 コ ラ ー ゲ ンを 2 カ所で分解す る と報 告さ れ ている9I． これ らコ ラ ー ゲンの分解産物は，3 70Cく体 温フで そのらせん構 造を 失いゼ ラ チン に変 性す る． M M P−2 は， この ゼラチン を小さいペプ チ ドに分 解す ることに よ りコ ラ ー ゲン
分子の分 解に重 要な役 割を演じ る と報 告さ れ てい る10 I．
M M P−2 は， これ まで ヒト皮膚41，
ヒト好 中球1 1及び ウ サ ギ骨5切培 養 液よ り精 製さ れ その性 質の 一部が明 らかと なっ ている が， R A 滑 膜 細 胞 由 来の M M P−2 はいま だ精 製さ れて お らず， そ の性 質に つい て は十 分に解 明さ れ ていない ． ま た， M M P−2 は潜 在塾酵 素 とし て分泌 さ れ細 胞 外で活 性 化を 受 け る が， その活 性化磯構について は 全 く 不 明であ る．
本 研 究で は， R A 滑 膜 細 胞 培 養 液か ら滞 在型 M M P−2 を単 離精 製し， 本 酵 素の性 質と活 性 化 機 構
の解明 を試みた．
材料およ び方法 工． 実 験 材 料
ア ク リル アミド， ジ チ オスレイ トー ル，
エ チレ ン
ジア ミン四酢 酸四 ナ ト リ ウム くethyle n ed iami n etetr− a a c etic a cid，E D T AI ， ヨ ー ド アセ ト ア ミド 及 び
S Odiu m dode cyls ulfateくS D Sl は和 光 純 薬よ り購入 し た． 4 −a min ophe nylm e r c u ric a c etate くN H 2−P h− Hg．Acl ， 1 ， 1 0山フェ ナン スロ リン， ジ イソプロピ ル フルオロリン酸， ジメチル ス ル フ ォキシド， N−エ チルマ レイ ミ ド， 2 −メ ルカ プ トエ タノ ー ル， ペ プ スタ テンA ，
フェニ ル メタン ス ル ホ ニ ル フ ルオ リ プ ラス ミ ノ ー ゲン， ストレ プト キ ナ ー ゼ， ト リ プシ ン，
ト リプ シ ンイン ヒ ビタ ー ， トロ ン ビ ン及 び ト ラン ス フェリンくじ卜1 は S igm a 社くSt．Lois， U． S．A1． よ り購入 し た． Y M −10メ ンブラ ン， 限 外 濾 過 装 置と Gr e e nA Dye matr e x ゲルは アミコ ン社 製 くDa n v e r s，
75 1
U ．S− A −1 の もの を使用 し た． ま た， Sephade x
G−1 0，D E A E−セ ルロ ー ス及 び A ffi−Gel−1 0 は そ れ ぞ れ P ha r a m a cia F in e C he mic al 社 くSw ede nJ， W ha− tm a n 社 くEngl a nd l 及び B io−Rad 社 くR ichm o nd，
U． S．A．j よ り購入 し た．仁1 − C1 4コ無 水 酢 酸， 1 25I及 び亡2 ， 3 −3Hコ プロリンは A m e r sha m Japa n 社 くT okyol よ り， ま た仁3Hコ ヨ ー ド酢 酸は N e w
Engl a nd Nu cle a r 社 くU ．S．A1． よ り購入 し た． プロ テ オ グ リ カン，
エ ラ ステン及び ラ ミニ ンは Dr− Naga s eくK a n s a s M ed ic al Scho ol， 米 国j よ り，
Engelbr eth．H olm −S w a r m くE H SI 肉 腰 由 来I V 塾 コ ラー ゲンは Dr．Ku rk in e nくR WJ−M edic al Scho ol，米 国う よ り， 好 中球エラスター ゼ と カ テ プシ ンG は Dr．
Tr a visくGe o rgi a 大 学， 米 国J よ り提 供を受け た． ま た ， T is s u e inhi bito r of m etallopr oteina s e s
くT I M PI は愛知 学 院大 学 歯 学部 判lは 郎 教 授よ り，
ヒト血清 由来フ ィプロ ネクチンは本 学 第 一 病理河原 栄 先生 よ り恵 与さ れ た．
マクロ フ ァ ー ジ調 整 培地は， M ain a rd i ら1 21の方 法
に従い作 製し た． す な わ ち成 熟ウ サ ギく2 へ2．5 Kgう
の耳 介静 脈に 0．2ml の Fr e u nd 完全ア ジュ バ ンド を 注 射2 遇 後に屠 殺し， 肺 胞 中に遊 走し たマ クロ
ファ ー ジ をハンクス液で肺 胞を洗 浄す ることによ り 採取し た． こ の マクロ フ ァー ジ を0．2％ 水 酸化ラ ク ト アルブ ミン くG i bc o． Ne w Y o rk，U ．S． A1． を含む無 血清 Dulbe c c o，s m od ified Eagle
，
s m ediu m 仁D−
M E M eFlo w Labo r ato rie slコで培 養し， こ の培 養 液 を アミコ ン限 外 濾 過 装置で5 0 −70倍に濃 縮しセマ ク
ロフ ァ ー ジ調 整 培 地と し て 用いた．
ラット卵 黄 褒 由 来I V 型コ ラー ゲン の標 識は胎 齢1 4 日のラッ ト卵 黄 襲を亡2，3 欄コプロリンく7 0ノJC iノmll を含む無血清D M E M 培 地 CO．1 mM アスコ ル ビ ン
酸， 5 0 0ノノgノml フマ ル酸ベ ー タ アミ ノプロ ピ オニ ト リル及 び0．2％ 水 酸化ラ ク ト アルブ ミンを含むう で 12 時 間 培 養して 行ない， こ の培 養 液を硫 安 沈殿法
く3 0％ 飽 和 度う で濃縮して用いた．
H ． R A 滑 膜細胞培養 液の調整
R A 滑 膜 細胞は， 金 沢 大 学 医学 部 付 属 病 院と その
関連 病 院の R A 患 者よ り， 人 工関 節置 換 術や滑膜 切
除術の際に採 取し た． Daye r ら1 3 ，の方 法に従い ，
R A 滑膜 組 織よ り初 代 培 養細 胞を得た．す な わ ち， 摘 出し た R A 滑 膜 組織を すみや かに無 菌的にハサミで 細 切し， 4m gl ml の細 胞 分 散用 コラ ゲ ナ ー ゼEc olla一
P M S F
， phe ny l−m eth a n e s ulfo nyl flu o ridei R A， rhe u m atoid a rthritisi S D S， S Od iu m
dode cyls ulfateニT I M P，tis s u e inhibito r of m etallopr otein a s e s．
