代謝型グルタミン酸受容体拮抗薬及び
Ketamine の抗うつ作用の機序に関する 研究
Studies on the mechanisms of the antidepressant effects of
the metabotropic glutamate receptor antagonists and
an N-methyl-D-aspartate receptor antagonist, Ketamine
2016 年 3 月
目 次 緒 言 1 第 1 章 新 奇 環 境 摂 食 抑 制 試 験 に お け る 代 謝 型 グ ル タ ミ ン 酸 5 受 容 体 拮 抗 薬 の 作 用 と そ の 作 用 機 序 の 検 討 7 1-1 序 論 7 1-2 実 験 材 料 ・ 方 法 8 1-2 -1 動 物 8 1-2 -2 試 薬 8 1-2 -3 新 奇 環 境 摂 食 抑 制 試 験 8 1-2 -4 脳 室 内 投 与 9 1-2 -5 統 計 9 1-3 結 果 10 1-3 -1 新 奇 環 境 摂 食 抑 制 試 験 に お け る Diazepam 及 び Fluvoxamine の 作 用 10 1-3 -2 新 奇 環 境 摂 食 抑 制 試 験 に お け る mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 11 1-3 -3 mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 、 Diazepam 及 び Fluvoxamine の
本 学 位 論 文 は 、下 記 の 原 著 論 文 を 基 に 作 成 さ れ 、東 京 薬 科 大 学 大 学 院 薬 学 研 究 科 に 提 出 さ れ た も の で あ る 。
1. Kenichi Fukumoto, Michihiko Iijima and Shigeyuki Chaki., The Antidepressant Effects of an mGlu2/3 Receptor Antagonist and Ketamine Require AMPA Receptor Stimulation in the mPFC and Subsequent Activation of the 5 -HT Neurons in the DRN ., Neuropsychopharmacology, 41, 1046-1056 (2016)
2. Kenichi Fukumoto and Shigeyuki Chaki., Involvement of serotonergic system in the effect of a metabotropic glutamate 5 receptor antagonist in the novelty -suppressed feeding test., J Pharmacol Sci, 127, 57 -61 (2015)
3. Kenichi Fukumoto, Michihiko Iijima and Shigeyuki Chaki., Serotonin -1 A receptor sti mulation mediates effects of a metabotropic glutamate 2/3 receptor antagonist, 2S-2-amino -2 -(1S,2S-2 -carboxycycloprop -1 -yl) -3 -(xanth-9 -yl)propanoic acid (LY341495), and an N -methyl-D-aspartate receptor antagonist, ketamine, in the novelty -suppressed feeding test., Psychopharmacology (Berl), 231, 2291 -2298 (2014)
本 研 究 で 用 い た 主 な 化 合 物 の 構 造 式 と 薬 理 作 用
Compound IUPAC name Structural formula Function
LY341495
2S-2-amino-2-(1S,2S-2-
carboxycycloprop-1-yl)-3-(xanth-9-yl)propanoic acid mGlu2/3 receptor antgonist
MPEP 2-methyl-6-(phenylethynyl)-pyridine mGlu5 receptor antgonist
Ketamine (methylamino)cyclohexanone(RS)-2-(2-chlorophenyl)-2- NMDA receptor antagonist
CX546 (2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-1-piperidinylmethanone AMPA receptor potentiator
Rapamycin (3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17 E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,3 2,33,34,34a-hexadecahydro-9,27- dihydroxy-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4- hydroxy-3-methoxycyclohexyl]-1- methylethyl]-10,21-dimethoxy- 6,8,12,14,20,26-hexamethyl-23,27- epoxy-3H-pyrido[2,1-c][1,4]- oxaazacyclohentriacontine-1,5,11,28,29(4H,6H,31H)-pentone mTOR inhibitor Anisomycin (2R,3S,4S)-2-[(4-
methoxyphenyl)methyl]-3,4-pyrrolidinediol 3-acetate Protein synthesis inhibitor
K252a (9S,10R,12R)-2,3,9,10,11,12- hexahydro-10-hydroxy-9-methyl-1- oxo-9,12-epoxy-1H-diindolo[1,2,3- fg:3',2',1'-kl]pyrrolo[3,4-i][1,6]benzodiazocine-10-carboxylic
acid methyl ester
Trk tyrosine kinase inhibitor
NBQX
2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-
tetrahydrobenzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide
AMPA receptor antagonist
PCPA chlorophenyl)propanoic acid(S)-2-amino-3-(4- Tryptophan hydroxylase inhibitor
WAY100635
N-[2-(4-2-methoxyphenyl)-1-piperazinyl]ethyl]-N-(2-pyridyl)
cyclohexanecarboxamide 5-HT1A receptor antagonist
Ritanserin
6-[2-[4-[bis(4-
fluorophenyl)methylidene]piperidin-1- yl]ethyl]-7-methyl-[1,3]thiazolo[2,3-b]pyrimidin-5-one
略 語
AMPA:-amino -3 -hydroxy-5 -methyl-4 -isoxazole propionic acid BDI: Beck Depression Investry
BDNF: brain-derived neurotrophic factor BP: bipolar disorder
CGI -I: Clinical Global Impression-Improvement scale ECT: electric convulsive therapy
eIF4B: eukaryotic initiation factor 4B ELISA: enzyme -linked immunosorbent assay FST: forced swi mming test 、 強 制 水 泳 試 験 GAB A: -aminobutyric acid
HAM-D: Hamilton Rating Scale for Depression IN: intranasal
IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry IV: intravenous
MADRS: Montgomery-As berg Depression Rating Scale MDD: major depressive disorder
Met: methionine
mGlu: metabotropic glutamate 、 代 謝 型 グ ル タ ミ ン 酸 mPFC: medial prefrontal cortex 、 内 側 前 頭 前 皮 質 mTOR: mammalian target of rapa mycin
NMDA: N-methyl-D-aspartate NPY: neuropeptide Y
NSFT: novelty-suppressed feeding test 、 新 奇 環 境 摂 食 抑 制 試 験 PET: positron emission tomography
PFC: prefrontal cortex 、 前 頭 前 皮 質
PGI-I: Patient Global Imression -Improvement scale p70S6K: 70 -kDa ribosomal protein S6 kinase
QIDS-SR: Quick In ventory of Depressive Symptoms -Self-Report Version QOL: quality of life
SI: suicidal ideation
5-HT: 5 -hydroxytryptami ne 、 セ ロ ト ニ ン
薬 物 （ 本 研 究 で 用 い た 主 な 化 合 物 の 構 造 式 と 薬 理 作 用 で 記 載 し た 薬 物 に つ い て は 含 ま な い ）
CHPG: (RS) -2 -chloro -5 -hydroxyphenylglycine
CPPG: (RS) -α-cyclopropyl -4 -phosphonophenylglycine DHPG: (S) -3,5 -dihydroxyphenylglycine
Diazepam: 7 -chloro -1 -methyl-5 -phenyl-3H-1,4 -benzodiazepin -2 -one DMSO: dimethyl sulfoxide
DOM: 2,5 -dimethoxy-4 -methylamphetamine
Fenobam: N-(3 -chlorophenyl) -N-(4,5 -dihydro -1 -methyl-4 -oxo -1 H-imidazole -2-yl)urea Fluvoxamine: Fluvoxamin e maleate
GRN-529:
4-difluoromethoxy-3 -(pyridine -2 -ylethynyl)phenyl)5H -pyrrolo[3,4-b]pyridine-6(7H) -yl methanone
Homo AMPA: (RS) -2 -ami no -4 -(3 -hydroxy-5 -methylisoxazol -4 -yl)butyric acid L-AP4: L-(+)-2 -amino -4-phosphonobutyric acid
LY367385: (S) -(+)-α-ami no -4 -carboxy-2 -methylbenzeneacetic acid
LY379268: (1R,4R,5S,6R) -4 -amino -2 -oxabicyclo[3.1.0]hexane -4,6-dicarboxylic acid MC: methylcellulose
MGS0028: (1R,2S,5S,6S) -2 -amino -6 -fluoro -4 -oxobicyclo[3.1.0]hexane -2,6-dicarboxylic acid MGS0039: (1R,2R,3R,5R,6R) -2 -amino -3 -(3,4 -dichlorob enzyloxy) -6 -fluorobicyclo[3.1.0] hexane -2,6 -dicarboxylic acid
MK-801: (5S,10R) -(+)-5 -Methyl-10,11 -dihydro-5H-dibenzo[a,d]cycl ohepten-5,10 -imine maleate
MTEP: 3-[(2 -methyl-1,3 -thiazol -4-yl)ethynyl] -pyridine Paroxetine: paroxetine hydrochloride
PBS: phosphat e-buffered saline PCA: para -chloroamphetamine PCPA: para -chlorophenylalanine PFA: paraformaldehyde
SNRI: serotonin noradrenalin e reuptake inhibitor 、 セ ロ ト ニ ン ・ ノ ル ア ド レ ナ リ ン 再 取 り 込 み 阻 害 薬
4
Fig. 1 The mechanisms of the antidepressant effect of Ketamine.
Ketamine inhibits the NMDA receptor on the GAB Aergic interneuron and increases the release of glutamate. The release of glutamate activates the AMPA receptor. Then, the activation of AMPA receptor induces the secretion of B DNF and the subsequent sti mulation of the TrkB/mTOR signaling, leading to the facilitation of synaptic protein synthesis and spinogenesis and the elicitation of the antidepressant effect.
Ketamine
NMDA
receptor
GABA interneuron
Presynaptic neuron
Glutamate
AMPA
receptor
BDNF
TrkB
receptor
Postsynaptic neuron
Antidepressant effect
mTOR
Glutamate
BDNF
5
Table 1 The effect s of Ketamine on mood disorder
Frequency Ketamine MDD Single 0.5 mg/kg, IV Randomized, Placebo-controlled, double-blinded trial 7 HAM-D Improvement (230 min~72 h) 10 0.5 mg/kg, IV Randomized, placebo-controlled, double-blinded trial 17 HAM-D Improvement (110 min~1 week) 11 0.5 mg/kg, IV Open-label trial 32 SSI MADRS HAM-D BDI Improvement
(SI; 40 min~230 min) 12
0.5 mg/kg, IV Open-label trial (ECT non-responder) 17
Improvement (40 min~230 min)
0.5 mg/kg, IV Open-label trial 23 Improvement (40 min~230 min) 0.5 mg/kg, IV Randomized, midazolam-controlled, double-blind trial 47 MADRS Improvement (1 day~7 days) 14 50 mg, IN Randomized, placebo-controlled, double-blinded trial 20 MADRS Improvement (40 min~48 h) 15
0.5 mg/kg, IV Open-label trial 26 MADRS-SI Improvement (SI; 24 h)
0.5 mg/kg, IV, six infusions over 12
days
Open-label trial 9 MADRS-SI Improvement (SI; 12 days)
0.5 mg/kg, IV, six infusions over 12
days
Open-label trial 10 MADRS QIDS-SR Improvement (120 min~12 days) 17 0.5 mg/kg, IV, six infusions over 12 days
Open-label trial 24 MADRS
Improvement (120 min~12 days, overall response rate: 70.8% )
18
as the anesthetic
during ECT Open-label trial 31 HAM-D
Improvement (faster onset of action vs ECT
only)
19
as the anesthetic
during ECT Retrospective study 42 HAM-D
Improvement (faster onset of action vs ECT
only)
20
Repeated 0.5 mg/kg, IV, three
infusions over 6 days Open-label trial 18
HAM-D BDI
Improvement (24 h~9 days, faster onset of action vs ECT
only ) 21 0.5 mg/kg, IV, single (add-on) Randomized, placebo-controlled, double-blind trial 18 MADRS Improvement (40 min~3 days) 22 0.5 mg/kg, IV, single (add-on) Randomized, placebo-controlled, double-blind trial 15 MADRS Improvement (40 min~3 days) 23 BPⅠ, Ⅱ (treatment resistant) Single MADRS 13 Pathological
condition Test design N Assessment
6
Table 2 Distributions and properties of metabotropic glutamate receptors
Agonist Antagonist mGlu1 Cerebellum Hippocampus Olfactory bulb Thalamus DHPG LY367385 mGlu5 Cerebral cortex Hippocampus Nucleus accumbens Olfactory bulb Striatum CHPG MPEP MTEP mGlu2 Amygdala Cerebral cortex Cerebellum Hippocampus Nucleus accumbens Olfactory bulb Striatum Thalamus Presynapse LY379268 MGS0028 LY341495 MGS0039 mGlu3 Amygdala Cerebral cortex Cerebellum Hippocampus Nucleus accumbens Olfactory bulb Striatum Thalamus Presynapse and postsynapse LY379268 MGS0028 LY341495 MGS0039 mGlu4 Amygdala Cerebellum Olfactory bulb Thalamus Ventral pallidum Presynapse L-AP4 CPPG mGlu6 - - HomoAMPA CPPG mGlu7 Amygdala Hypothalamus Nucleus accumbens Piriform cortex Hippocampus Spinal cord Striatum Superior colliculus L-AP4 CPPG mGlu8 Entorhinal cortex Olfactory bulbs Piriform cortex L-AP4 CPPG Ligand Distribution (brain) Synaptic
Localization Signaling Function
7
第 1 章 新 奇 環 境 摂 食 抑 制 試 験 に お け る 代 謝 型 グ ル タ ミ ン 酸 5 受 容 体 拮 抗 薬 の 作 用 と そ の 作 用 機 序 の 検 討
1-1. 序 論
8 1-2. 実 験 材 料 ・ 方 法
1-2 -1. 動 物
動 物 は 9 週 齢 の C57BL/6J 系 雄 性 マ ウ ス（ Charles River Laboratories, Yokohama, Japan） を 使 用 し た 。 動 物 は 室 温 23±3℃ 、 湿 度 50±20%、 12 時 間 明 暗 サ イ ク ル （ 7:00-19:00 点 灯 ）に 調 節 さ れ た 動 物 施 設（ 大 正 製 薬 株 式 会 社 医 薬 研 究 所 内 ）に お い て 飼 育 し た 。飼 育 時 、餌 及 び 水 は 自 由 摂 取 さ せ た 。実 験 動 物 の 飼 育 及 び 実 験 操 作 は 日 本 実 験 動 物 学 会 の 実 験 動 物 に 関 す る 指 針（ 1987）及 び 大 正 製 薬 株 式 会 社 医 薬 研 究 所 の 実 験 動 物 規 定 に 従 っ て 行 な わ れ た 。 1-2 -2. 試 薬
（ 全 身 投 与 ） MPEP（ Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA） は 0.5% methylcellulose （ MC）に 溶 解 し 、薬 液 を 調 製 し た 。 Ketamine（ 50 mg/ml, 動 物 用 ケ タ ラ ー ル 50, Sankyo Yell Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan ） は 生 理 食 塩 液 で 希 釈 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。 Diazepam（ Sigma -Aldrich Co. ） は 0.5% MC に 懸 濁 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。 Fluvoxamine （ Sigma-Aldrich Co. ） は 生 理 食 塩 液 に 溶 解 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。 Anisomycin （ EMD Biosciences, Inc., La Jolla, CA, USA ） は 2 M HCl に 溶 解 し た 後 、 生 理 食 塩 液 で 希 釈 し 、 pH 7.4 と な る よ う に 1M NaOH を 添 加 し て 薬 液 を 調 製 し た 。 全 身 投 与 に 使 用 す る 薬 液 の 投 与 容 量 は 10 ml/kg と し た 。
9 Fluvoxamine（ 30 mg/kg ） は 試 験 の 30 分 前 及 び 60 分 前 に そ れ ぞ れ 腹 腔 内 投 与 し た 。 慢 性 投 与 の た め に 、 Fluvoxamine（ 30 mg/kg） は 1 日 1 回 28 日 間 腹 腔 内 投 与 し 、 最 終 投 与 か ら 60 分 後 に 試 験 を 行 な っ た 。 Anisomycin（ 100 mg/kg） は 試 験 の 90 分 前 又 は 24.5 時 間 前 に 腹 腔 内 投 与 し た 。 1-2 -4. 脳 室 内 投 与
脳 室 内 投 与 は マ ウ ス を 保 定 し 、 Paxinos and Franklin の 脳 図 譜 に 従 っ て bregma か ら 尾 側 方 向 に 0.2 mm、側 方 に 1 mm の 位 置 に ポ リ エ チ レ ン カ テ ー テ ル を 介 し て マ イ ク ロ シ リ ン ジ（ Hamilton Co., Reno, NV, USA）に 接 続 し た 28G の 注 射 針（ Terumo Co., Tokyo, Japan） の 先 端 が 片 側 の 側 脳 室 に 位 置 す る よ う に 、脳 組 織 の 表 面 か ら 腹 側 へ 2 mm 刺 入 す る こ と に よ り 実 施 し た 。 Rapamycin（ 0.2 nmol/2l） 及 び K252a（ 2.0 nmol/2l） は 1.0 l/min の 速 度 で 2.0 l を 片 側 に 投 与 し た 。 投 与 終 了 後 、 注 射 針 を 2 分 間 留 置 し た 。 Rapamycin 及 び K252a は 試 験 の 24.5 時 間 前 に 投 与 し た 。
1-2 -5. 統 計
10 1-3. 結 果
1-3 -1. 新 奇 環 境 摂 食 抑 制 試 験 に お け る Diazepam 及 び Fluvoxamine の 作 用
Diazepam（ 0.3 mg/kg, i.p. ） は 投 与 30 分 後 に 、 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、 急 性 の 抗 う つ 様 作 用 を 発 揮 し た （ Fig. 2A）。 Fluvoxamine（ 30 mg/kg, i.p.） は 急 性 投 与 で は 摂 食 ま で の 潜 時 に 影 響 を 及 ぼ さ ず 、28 日 間 の 反 復 投 与 に よ り 、摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し た（ Fig. 2B, C）。
(A) Single dose (B) Single dose (C) Repeated dose
Fig. 2 Effects of Diazepam and Fluvoxamine in the NSFT in mice.
(A) Diazepam (0.3 mg/kg, i.p.) was administered 30 min prior to the test. (B) Fluvoxamine (30 mg/kg, i.p.) was administered 60 min prior to the test. (C) Fluvoxamine (30 mg/kg, i.p.) was administered once daily for 28 days, and the test was performed 60 min after the final treatment. Values indicate the mean ± S.E.M. ((A): n = 12, (B): n = 12 , (C): n = 12 ). **p < 0.01 compared with Vehicle (Student’s t-test).
11
1-3 -2. 新 奇 環 境 摂 食 抑 制 試 験 に お け る mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用
MPEP（ 3 mg/kg, i.p. ）は 投 与 60 分 後 に 、摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し た（ 急 性 作 用 ）（ Fig. 3A）。さ ら に 、MPEP（ 1, 3 mg/kg, i.p.）は 投 与 24 時 間 後 で も 、摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し た （ 持 続 性 作 用 ）（ Fig. 3B）。
(A) Acute effect (B) Sustained effect
Fig. 3 Effects of MPEP in the NSFT in mice.
(A) MPEP (1, 3 mg/kg, i.p.) was administered 60 min prior to the test. (B) MPEP (1, 3 mg/kg, i.p.) was administered 24 h prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. ((A): n = 11 -12, (B): n = 12). *p < 0.05, **p < 0.01 compared with Vehicle (Dunnett’s -test).
12
1-3 -3. mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 、 Diazepam 及 び Fluvo xamine の 摂 餌 量 に 及 ぼ す 作 用
MPEP（ 3 mg/kg, i.p.）及 び Diazepam（ 0.3 mg/kg, i.p.）は 投 与 60 分 後 及 び 30 分 後 に 、 そ れ ぞ れ 摂 餌 量 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た（ Table 3）。ま た 、Fluvoxamine（ 30 mg/kg, i.p.） は 28 日 間 の 反 復 投 与 に よ り 、摂 餌 量 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た（ Table 3）。こ れ ら の こ と か ら 、こ れ ら 薬 物 の 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 す る 作 用 に 摂 食 量 は 関 与 し な い こ と が 示 さ れ た 。
Table 3 Effects of MPEP, Diazepam and Fluvoxamine on food consumption in mice
MPEP (3 mg/kg, i.p.) wa s administered 60 min prior to the test. Diazepam (0.3 mg/kg , i.p.) was administered 30 min prior to the test. Fluvo xamine (30 mg/kg, i.p.) was administered once daily for 28 days and the test was performed 60 min after the final treatment. Vehicle A: 0.5% MC, Vehicle B : Saline. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 6 -12).
Drugs Food consumption
13
1-3 -4. mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る タ ン パ ク 質 合 成 の 関 与
MPEP（ 3 mg/kg, i.p.）の 急 性 作 用 は タ ン パ ク 質 合 成 阻 害 薬 の Anisomycin（ 100 mg/kg, i.p.） に よ り 拮 抗 さ れ な か っ た （ Fig. 4A ）。 一 方 、 MPEP （ 3 mg/kg, i.p. ） の 持 続 性 作 用 は Anisomycin（ 100 mg/kg, i.p. ）に よ り 拮 抗 さ れ た（ Fig. 4B）。Anisomycin（ 100 mg/kg, i.p. ） は そ れ 自 体 で 摂 食 ま で の 潜 時 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た （ Fig. 4A, B）。
(A) Acute effect (B) Sustained effect
Fig. 4 Effects o f a protein synthesis inhibitor on the action of MPEP in the NSFT in mice. (A) MPEP (3 mg/kg, i.p.) was administered 60 min prior to the test. Anisomycin (100 mg/kg, i.p.) was administered 90 min prior to the test. (B) MPEP (3 mg/kg, i.p.) wa s administered 24 h prior to the test. Anisomycin (100 mg/kg, i.p.) was administered 24.5 h prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. ((A): n = 11-12, (B): n = 11 -12). **p < 0.01 compared with HCl/Saline -treated Vehicle, ++p < 0.01 compared with Anisomycin-treated Vehicle, ##p < 0.01 compared with HCl/ Saline -treated MPEP (LSD post -hoc test).
14
1-3 -5. mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る mTOR シ グ ナ ル の 関 与
MPEP（ 3 mg/kg, i.p. ） の 急 性 作 用 は mTOR 阻 害 薬 の Rapamycin（ 0.2 nmol/2 l, i.c.v.） に よ り 拮 抗 さ れ な か っ た（ Fig. 5A）。一 方 、MPEP（ 3 mg/kg, i.p.）の 持 続 性 作 用 は Rapamycin （ 0.2 nmol/2 l, i.c.v.）に よ り 部 分 的（ 42%）に 拮 抗 さ れ た（ Fig. 5B）。Rapamycin（ 0.2 nmol/2 l, i.c.v.） は そ れ 自 体 で 摂 食 ま で の 潜 時 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た （ Fig. 5A, B）。
(A) Acute effect (B) Sustained effect
Fig. 5 Effects o f an mTOR inhibitor on the action of MPEP in the NSFT in mice.
(A) MPEP (3 mg/kg, i.p.) was administered 60 min prior to the test. Rapamycin ( 0.2 nmol/2 l, i.c.v.) was administered 90 min prior to the test. (B) MPEP (3 mg/kg, i.p.) was administered 24 h prior to the test. Rapamycin ( 0.2 nmol/2 l, i.c.v.) was administered 24.5 h prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. ((A): n = 11 -12, (B): n = 11-12). *p < 0.05, **p < 0.01 compared with DMSO -treated Vehicle, +p < 0.05 compared with Rapamycin-treated Vehicle (LSD post -hoc test).
15
1-3 -6. Ketamine の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る mTOR シ グ ナ ル の 関 与
Ketamine（ 30 mg/kg, i.p. ） は 投 与 30 分 後 に 、 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し （ 急 性 作 用 ）、 そ の 作 用 は Rapamycin（ 0.2 nmol/2 l, i.c.v.）に よ り 拮 抗 さ れ な か っ た（ Fig. 6A）。一 方 、 Ketamine（ 30 mg/kg, i.p. ）は 投 与 24 時 間 後 に 、摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し（ 持 続 性 作 用 ）、 そ の 作 用 は Rapamycin（ 0.2 nmol/2 l, i.c.v.） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 6B）。
(A) Acute effect (B) Sustained effect
Fig. 6 Effects o f an mTOR inhibitor on the action of Ketamine in the NSFT in mice.
16 1-3 -7. Ketamine の 摂 餌 量 に 及 ぼ す 作 用
Ketamine（ 30 mg/kg, i.p.）は 投 与 30 分 後 の 摂 餌 量 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た（ Table 4）。 こ の こ と か ら 、 Ketamine の 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 す る 作 用 に 摂 食 量 は 関 与 し な い こ と が 示 さ れ た 。
Table 4 Effect of Ketami ne on food consumption in mice
Ketamine (30 mg/kg, i.p.) was administered 30 min prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 5 -6).
1-3 -8. mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る TrkB の 関 与
MPEP（ 3 mg/kg, i.p. ）の 持 続 性 作 用 は Trk チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 阻 害 薬 の K252a（ 2.0 nmol/2 l, i.c.v.） に よ り 拮 抗 さ れ な か っ た （ Fig. 7）。 K252a（ 2.0 nmol/2 l, i.c.v.） は そ れ 自 体 で 摂 食 ま で の 潜 時 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た （ Fig. 7）。
Sustained effect
Fig. 7 Effect of a Trk tyrosine kinase inhibitor on the action of MPEP in the NSFT in mice. MPEP (3 mg/kg, i.p.) was administered 24 h prior to the test. K252a （ 2.0 nmol/2 l, i.c.v.） was administered 24.5 h prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 8 -9). **p < 0.01 compared with DMSO -treated Vehicle, +p < 0.05 compared with K252a -treated Vehicle (LSD post -hoc test).
Drugs Food consumption
19
Fig. 8 Proposed mechanisms of the effects of Ketamine and the mGlu5 receptor antagoni st. Ketamine and the mGlu5 receptor antagonist induce the acute effect s. Ketamine activates BDNF/TrkB signaling and subsequently stimulates mTOR signaling, leading to the elicitation of the sustained effect. The mGlu5 receptor antagonist induces the sustained effect through the new protein synthesis, partly via mTOR signaling but not via B DNF/TrkB signaling.
Ketamine
BDNF/TrkB
signaling
Sustained effects
mGlu5 receptor
antagonist
mTOR
signaling
New protein synthesis
Ketamine
mGlu5 receptor
antagonist
20 第 2 章 新 奇 環 境 摂 食 抑 制 試 験 に お け る 代 謝 型 グ ル タ ミ ン 酸 受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamine の 作 用 に 対 す る セ ロ ト ニ ン 神 経 系 の 関 与 2-1. 序 論 第 1 章 で は 、 mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 が Ketamine と 同 様 に 即 効 性 、 か つ 持 続 的 な 抗 う つ 様 作 用 を 発 現 す る こ と を 示 し た 。 加 え て 、 そ の 機 序 は Ketamine の そ れ と 一 部 異 な る こ と を 明 ら か に し た 。 mGlu 受 容 体 に 作 用 す る 薬 物 の 中 で は 、 mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 他 に mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 作 用 及 び そ の 作 用 機 序 の 検 討 が 行 な わ れ て い る 。こ れ ま で 、 mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 の MGS0039 及 び LY341495 は 、 強 制 水 泳 試 験 （ FST）、 尾 懸 垂 試 験 （ TST）、 学 習 性 無 力 モ デ ル 、 嗅 球 摘 出 モ デ ル 及 び 社 会 的 隔 離 モ デ ル な ど の 様 々 な 動 物 モ デ ル に お い て 抗 う つ 作 用 を 示 す こ と が 報 告 さ れ て い る（ 46, 47, 68, 69）。ま た 、 既 存 の 抗 う つ 薬 が 奏 功 し な い corticosterone 反 復 投 与 モ デ ル に お い て も LY341495 は Ketamine と 同 様 に 抗 う つ 作 用 を 示 し た こ と か ら 、 mGu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 は 治 療 抵 抗 性 う つ 病 に も 有 用 で あ る こ と が 示 唆 さ れ て い る （ 48）。 さ ら に 、 既 存 の 抗 う つ 薬 が 抗 う つ 作 用 を 発 現 す る ま で に 数 週 間 を 要 す る 慢 性 予 測 不 能 ス ト レ ス モ デ ル に お い て も 、 LY341495 は Ketamine と 同 様 に 投 与 24 時 間 後 又 は 48 時 間 後 に 抗 う つ 作 用 を 示 し 、そ の 作 用 は 投 与 10 日 後 ま で 持 続 す る こ と が 報 告 さ れ て い る （ 28, 70）。 従 っ て 、 mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 は 即 効 性 及 び 持 続 性 の 抗 う つ 作 用 を 併 せ 持 つ こ と が 示 唆 さ れ る 。 mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 は 抗 う つ 作 用 の 機 序 に お い て も 、Ketamine の そ れ と 一 部 共 有 す る こ と が 示 さ れ て い る 。 即 ち 、 mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 作 用 発 現 に は Ketamine と 同 様 に 、グ ル タ ミ ン 酸 遊 離 促 進 に よ る AMPA 受 容 体 の 活 性 化 を 介 し た TrkB/mTOR シ グ ナ ル の 活 性 化 、そ れ に 続 い て 惹 起 さ れ る 前 頭 前 皮 質 に お け る シ ナ プ ス タ ン パ ク 質 の 合 成 促 進 な ど の 神 経 可 塑 的 な 変 化 が 関 与 す る と 示 唆 さ れ て い る （ 24, 26, 27, 29, 32, 69, 71-74）。
21 が 報 告 さ れ て い る （ 79）。 こ れ ら の こ と か ら 、 mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 作 用 発 現 に も セ ロ ト ニ ン 神 経 系 が 関 与 す る こ と が 推 測 さ れ る 。 し か し な が ら 、 NSFT に お い て 、 mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る セ ロ ト ニ ン 神 経 系 の 関 与 及 び そ の 機 序 は 明 ら か に さ れ て い な い 。そ こ で 、第 2 章 で は NSFT を 用 い て mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 、 mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamine の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る セ ロ ト ニ ン 神 経 系 の 関 与 に つ い て 検 討 し た 。
Fig. 9 Proposed mechanisms of the release of 5 -HT in the prefrontal cortex induced by Ketamine, mGlu2/3 receptor antagonist and mGlu5 receptor antagonist .
Ketamine and mGlu2/3 receptor antagonist increase the release of 5 -HT in the prefrontal cortex via the stimulation of AMPA receptor. The mGlu5 receptor antagonist increases the release of 5 -HT in the prefrontal cortex via an unidentified mechanisms .
22 2-2. 実 験 材 料 ・ 方 法
2-2 -1. 動 物
動 物 は 7-9 週 齢 の C57BL/6J 系 雄 性 マ ウ ス（ Charles River Laboratories, Yokohama, Japan ） を 使 用 し た 。 動 物 は 室 温 23±3℃ 、 湿 度 50±20%、 12 時 間 明 暗 サ イ ク ル （ 7:00-19:00 点 灯 ）に 調 節 さ れ た 動 物 施 設（ 大 正 製 薬 株 式 会 社 医 薬 研 究 所 内 ）に お い て 飼 育 し た 。飼 育 時 、餌 及 び 水 は 自 由 摂 取 さ せ た 。実 験 動 物 の 飼 育 及 び 実 験 操 作 は 日 本 実 験 動 物 学 会 の 実 験 動 物 に 関 す る 指 針（ 1987）及 び 大 正 製 薬 株 式 会 社 医 薬 研 究 所 の 実 験 動 物 規 定 に 従 っ て 行 な わ れ た 。 2-2 -2. 試 薬
LY341495（ Tocris Cookson Ltd., Bristol, UK ） は 1/15 M phosphate buffer（ pH 8.0） に 溶 解 し 、薬 液 を 調 製 し た 。Ketamine は 生 理 食 塩 液 で 希 釈 し 、薬 液 を 調 製 し た 。MPEP 及 び Ritanserin（ Sigma -Aldrich Co., St. Louis, MO, USA ） は 0.5% MC に 溶 解 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。 CX546（ Tocris Cookson Ltd.） は 10% hydroxypropyl--cyclodextrin に 溶 解 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。 8-OH-DPAT （ Research Biochemicals Inc., Natick, MA, USA ） 及 び WAY100635（ Sigma -Aldrich Co. ）は 生 理 食 塩 液 に 溶 解 し 、薬 液 を 調 製 し た 。NBQX（ Tocris Cookson Ltd. ） は 生 理 食 塩 液 に 懸 濁 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。 PCPA（ Wako P ure Chemical Industries, Ltd, Osaka ）は 0.5% MC に 懸 濁 し 、薬 液 を 調 製 し た 。PCA（ Sigma -Aldrich Co.） は 注 射 用 水 に 溶 解 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。 全 て の 薬 液 の 投 与 容 量 は 10 ml/kg と し た 。
2-2 -3. 新 規 環 境 摂 食 抑 制 試 験
23 PCA（ 10 mg/kg）を 腹 腔 内 投 与 し 、投 与 10 分 後 か ら 52 分 後 ま で 、18 分 間 隔 で 2 分 間 ず つ（ 合 計 3 回 ）の 首 振 り 行 動 の 回 数 を 測 定 し た 。首 振 り 行 動 の 回 数 は 2 分 間 の 首 振 り 行 動 を 3 回 分 合 計 す る こ と に よ り 算 出 し た 。 2-2 -5. セ ロ ト ニ ン 量 測 定 PCPA（ 300 mg/kg, i.p.） の 最 終 投 与 18 時 間 後 に 断 頭 し 、 脳 を 素 早 く 摘 出 し 、 氷 上 で 前 頭 皮 質 を 分 画 し た 。 前 頭 皮 質 は 使 用 す る ま で -80℃ で 保 存 し た 。 前 頭 皮 質 は 氷 冷 し た 0.1M 過 塩 素 酸 溶 液 中 で ホ モ ジ ナ イ ズ し 、 4℃ 、 17,360×g で 遠 心 分 離 し た 。 上 清 中 の セ ロ ト ニ ン 量 は ELISA キ ッ ト（ Labor Diagnostika Nord, Nordhorn, Germany ）を 用 い て 測 定 し た 。
2-2 -6. 統 計
24 2-3. 結 果
2-3 -1. mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る AMPA 受 容 体 の 関 与
MPEP（ 3 mg/kg, i.p. ）は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、そ の 作 用 は AMPA 受 容 体 拮 抗 薬 の NBQX（ 1, 3, 10 mg/kg, s.c. ） に よ り 拮 抗 さ れ な か っ た （ Fig. 10）。
mGlu5 receptor antagonist
Fig. 10 Effect of an AMPA receptor antagonist on the action of MPEP in the NSFT in mice. MPEP (3 mg/kg, i.p.) was administered 60 min prior to the test. NBQX (1, 3, 10 mg/kg , s.c.) was administered 65 min prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 11 -12). **p < 0.01 compared with Saline -treated Vehicle (Student’s t-test).
25
2-3 -2. mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る AMPA 受 容 体 の 関 与
LY341495（ 1 mg/kg, i.p.）は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、そ の 作 用 は NBQX（ 10 mg/kg, s.c.） に よ り 拮 抗 さ れ た（ Fig. 11）。NBQX（ 10 mg/kg, s.c.）は そ れ 自 体 で 摂 食 ま で の 潜 時 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た （ Fig. 11）。
mGlu2/3 receptor antagonist
Fig. 11 Effect of an AMPA receptor antagonist on the action o f LY341495 in the NSFT in mice.
LY341495 (1 mg/kg, i.p.) was administered 30 min prior to the test. NBQX (10 mg/kg , s.c.) was administered 35 min prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 11 -12). **p < 0.01 compared with Saline -treated Vehicle, ##p < 0.01 compared with Saline -treated LY341495 (LSD post hoc test).
26
2-3 -3. Ketamine の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る AMPA 受 容 体 の 関 与
Ketamine（ 30 mg/kg, i.p. ） は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、 そ の 作 用 は NBQX（ 10 mg/kg, s.c.） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 12）。
Fig. 12 Effect of an AMPA receptor antagonist on the action of Ketamine in the NSFT in mice. Ketamine (30 mg/kg, i.p.) was administered 30 mi n prior to the test. NB QX (10 mg/kg , s.c.) was administered 35 min prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 11 -12). **p < 0.01 compared with Saline -treated Vehicle, ##p < 0.01 compared with Saline -treated Ketamine (LSD post hoc test).
27
2-3 -4. AMPA 受 容 体 増 強 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る AMPA 受 容 体 の 関 与
AMPA 受 容 体 増 強 薬 の CX546（ 10 mg/kg, s.c. ）は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、 そ の 作 用 は NBQX（ 10 mg/kg, s.c.） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 13）。
AMPA receptor potentiator
Fig. 13 Effect of an AMPA receptor antagonist on the action of CX546 in the NSFT in mice. CX546 (10 mg/kg, s.c.) was administered 30 min prior to the test. NBQX (10 mg/kg , s.c.) was administered 35 min prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 9 -12). *p < 0.05 compared with Saline -treated Vehicle, #p < 0.05 compared with Saline -treated CX546 (LSD post hoc test).
28
2-3 -5. mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 及 び AMPA 受 容 体 増 強 薬 の 摂 餌 量 に 及 ぼ す 作 用
LY341495（ 1 mg/kg, i.p.） 及 び CX546（ 10 mg/kg, s.c.） は 投 与 30 分 後 に 、 摂 餌 量 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た （ Table 5）。 こ の こ と か ら 、 こ れ ら 薬 物 の 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 す る 作 用 に 摂 食 量 は 関 与 し な い こ と が 示 さ れ た 。
Table 5 Effects of LY341495 and CX546 on food consumption in mice
LY341495 (1 mg/kg, i.p.) or CX546 (10 mg/kg , s.c.) was administered 30 min prior to the test. Vehicle A: 1/15 M phosphate buffer, Vehicle B: 10% hydroxypropyl - -cyclodextrin. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 4 -6).
2-3 -6. セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の セ ロ ト ニ ン 量 に 及 ぼ す 作 用
セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA の 投 与 条 件 が 脳 内 の セ ロ ト ニ ン を 枯 渇 さ せ る の に 十 分 で あ る か を ELISA に よ り 検 討 し た 。セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA（ 300 mg/kg, i.p., twice daily for 3 days）は 0.5% MC 投 与 群 と 比 較 し て 、マ ウ ス の 前 頭 皮 質 に お け る セ ロ ト ニ ン 含 有 量 を 74.8%抑 制 し た（ Table 6）。こ の こ と か ら 、今 回 用 い た PCPA の 投 与 条 件 は 脳 内 の セ ロ ト ニ ン を 枯 渇 さ せ る の に 十 分 で あ る こ と が 免 疫 学 的 に 示 さ れ た 。
Table 6 Effect of PCPA on 5 -HT content in the frontal cortex in mice
PCPA (300 mg/kg, i.p.) was administered t wice daily for 3 consecutive days until the day before the test. Values represent as the mean ± S.E.M. (n = 4). **p < 0.01 compared with 0.5% MC (Student’s t-test).
Drugs Food consumption
(mg food / g of mouse)
Vehicle A (i.p.) 4.4 ± 0.3
LY341495 (1 mg/kg, i.p.) 5.3 ± 0.8
Vehicle B (s.c.) 4.0 ± 1.0
CX546 (10 mg/kg, s.c.) 3.8 ± 0.4
Drugs 5-HT content (ng/mg tissue) Percent change
0.5% MC 4.33 ± 0.80 ―
29
2-3 -7. セ ロ ト ニ ン 遊 離 促 進 薬 誘 発 首 振 り 行 動 試 験 に お け る セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の 作 用
セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA の 投 与 条 件 が 脳 内 の セ ロ ト ニ ン を 枯 渇 さ せ る の に 十 分 で あ る か を セ ロ ト ニ ン 遊 離 促 進 薬 誘 発 首 振 り 行 動 試 験 に よ り 検 討 し た 。セ ロ ト ニ ン 遊 離 促 進 薬 の PCA（ 10 mg/kg, i.p.）は 首 振 り 行 動 の 回 数 を 増 加 さ せ 、そ の 作 用 は セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA（ 300 mg/kg, i.p., twice daily for 3 days ） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 14）。 PCPA （ 300 mg/kg, i.p., twice daily for 3 days ） は そ れ 自 体 で 首 振 り 行 動 の 回 数 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た （ Fig. 14）。 こ の こ と か ら 、 今 回 用 い た PCPA の 投 与 条 件 は 脳 内 の セ ロ ト ニ ン を 枯 渇 さ せ る の に 十 分 で あ る こ と が 行 動 薬 理 学 的 に 示 さ れ た 。
5-HT release enhancer
Fig. 14 Effect of 5 -HT depletion on P CA -induced head twitch response in mice.
Mice were treated with PCPA (300 mg/kg , i.p.) twice daily for 3 consecutive days until the day before the test, and head twitch responses induced by injection of PCA (10 mg/kg , i.p.) were counted. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 10). **p < 0.01 compared with 0.5% MC-treated Vehicle, ##p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated P CA (LSD post hoc test).
30
2-3 -8. mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る セ ロ ト ニ ン の 関 与
MPEP （ 3 mg/kg, i.p. ） は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、 そ の 作 用 は セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA（ 300 mg/kg, i.p., twice daily for 3 days）に よ り 拮 抗 さ れ た（ Fig. 15）。PCPA（ 300 mg/kg, i.p., twice daily for 3 days ） は そ れ 自 体 で 摂 食 ま で の 潜 時 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た （ Fig. 15）。
mGlu5 receptor antagonist
Fig. 15 Effect of 5 -HT depletion on the action of MPEP in the NSFT in mice.
MPEP (3 mg/kg , i.p.) was administered 60 min prior to the test. PCPA (300 mg/kg , i.p.) was administered t wice daily for 3 consecutive days until the day before the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 10 -12). **p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated Vehicle, ##p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated MPEP (LSD post hoc test).
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2-3 -9. mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る セ ロ ト ニ ン の 関 与
LY341495（ 1 mg/kg, i.p. ） は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、 そ の 作 用 は セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA（ 300 mg/kg, i.p., twice daily for 3 days ） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 16）。
mGlu2/3 receptor antagonist
Fig. 16 Effect of 5 -HT depletion on the action of LY341495 in the NSFT in mice.
LY341495 (1 mg/kg, i.p.) was administered 30 min prior to the test. P CPA (300 mg/kg , i.p.) was administered twice daily for 3 consecutive days until the day before the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 12). *p < 0.05 compared with 0.5% MC -treated Vehicle, #p < 0.05 compared with 0.5% MC -treated LY341495 (LSD post hoc test).
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2-3 -10. Ketamine の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る セ ロ ト ニ ン の 関 与
Ketamine（ 30 mg/kg, i.p. ） は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、 そ の 作 用 は セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA（ 300 mg/kg, i.p., twice daily for 3 days ） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 17）。
Fig. 17 Effect of 5 -HT depletion on the action of Ketamine in the NSFT in mice.
Ketamine (30 mg/kg, i.p.) was administered 30 min prior to the test. PCPA (300 mg/kg , i.p.) was administered twice daily for 3 consecutive days until the day before the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 11 -12). **p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated Vehicle, ##p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated Ketamine (LSD post hoc test).
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2-3 -11. AMPA 受 容 体 増 強 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る セ ロ ト ニ ン の 関 与
CX546（ 10 mg/kg, i.p. ） は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、 そ の 作 用 は セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA（ 300 mg/kg, i.p. , twice daily for 3 days ） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 1 8）。
AMPA receptor potentiator
Fig. 18 Effect of 5 -HT depletion on the action of CX546 in the NSFT in mice.
CX546 (10 mg/kg, s.c.) was administered 30 min prior to the test. P CPA (300 mg/kg , i.p.) was administered twice daily for 3 consecutive days until the day before the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 11 -12). **p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated Vehicle, ##p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated CX546 (LSD post hoc test).
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2-3 -12. mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る 5-HT1 A受 容 体 及 び 5-HT2 A/ 2 C 受 容 体 の 関 与
MPEP（ 3 mg/kg, i.p. ） は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、 そ の 作 用 は 5-HT1 A受 容 体 拮 抗 薬 の WAY100635（ 1, 3, 10 mg/kg, s.c.） に よ り 拮 抗 さ れ な か っ た （ Fig. 19A）。 一 方 、 MPEP の 作 用 は 5-HT2 A / 2 C受 容 体 拮 抗 薬 の Ritanserin（ 0.5 mg/kg, i.p.） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 19B）。
(A) 5-HT1 A receptor (B) 5-HT2 A / 2 C receptor
Fig. 19 Effects of a 5 -HT1 A receptor antagonist or a 5 -HT2 A / 2 C receptor antagonist on the action of MPEP in the NSFT in mice.
MPEP (3 mg/kg, i.p.) was administered 60 min prior to the test. (A) WAY100635 (0.3, 1, 3 mg/kg, s.c.) was administered 90 min prior to the test. **p < 0.01 compared with Saline -treated Vehicle (Student’s t-test). (B) Ritanserin (0.125, 0.25, 0.5 mg/kg , i.p.) was administered 90 min prior to the test. **p < 0.01 compared with 0.5% MC-treated Vehicle (Student’s t-test), ##p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated MPEP (Dunnett’s test). Values indicate the mean ± S.E.M. ((A): n = 11 -12, (B): n = 12).
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2-3 -13. mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る 5-HT1 A 受 容 体 及 び 5-HT2 A / 2 C受 容 体 の 関 与
LY341495（ 1 mg/kg, i.p. ）は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、そ の 作 用 は 5-HT1 A受 容 体 拮 抗 薬 の WAY100635（ 1, 3 mg/kg, s.c.） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 20A）。 一 方 、 LY341495 の 作 用 は 5-HT2 A / 2 C受 容 体 拮 抗 薬 の Ritanserin（ 0.5 mg/kg, i.p.）に よ り 拮 抗 さ れ な か っ た（ Fig. 20B）。
(A) 5 -HT1 A receptor (B) 5-HT2 A / 2 C receptor
Fig. 20 Effects of a 5 -HT1 A receptor antagonist or a 5 -HT2 A / 2 C receptor antagonist on the action of LY341495 in the NSFT in mice.
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2-3 -14. Ketamine の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る 5-HT1 A受 容 体 及 び 5-HT2 A / 2 C受 容 体 の 関 与
Ketamine（ 30 mg/kg, i.p. ）は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、そ の 作 用 は 5-HT1 A受 容 体 拮 抗 薬 の WAY100635（ 3 mg/kg, s.c.） に よ り 拮 抗 さ れ た（ Fig. 21A）。一 方 、 Ketamine の 作 用 は 5-HT2 A / 2 C受 容 体 拮 抗 薬 の Ritanserin（ 0.5 mg/kg, i.p.） に よ り 拮 抗 さ れ な か っ た （ Fig. 21B）。
(A) 5 -HT1 A receptor (B) 5-HT2 A / 2 C receptor
Fig. 21 Effects of a 5 -HT1 A receptor antagonist or a 5 -HT2 A / 2 C receptor antagonist on the action of Ketamine in the NSFT in mice.
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2-3 -15. AMPA 受 容 体 増 強 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る 5-HT1 A受 容 体 及 び 5-HT2 A/ 2 C 受 容 体 の 関 与
CX546（ 10 mg/kg, s.c. ）は 摂 食 ま で の 潜 時 を 短 縮 し 、そ の 作 用 は 5-HT1 A受 容 体 拮 抗 薬 の WAY100635（ 3 mg/kg, s.c.） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 22A）。 一 方 、 CX546 の 作 用 は 5-HT2 A / 2 C受 容 体 拮 抗 薬 の Ritanserin（ 0.5 mg/kg, i.p.）に よ り 拮 抗 さ れ な か っ た（ Fig. 22B）。 WAY100635（ 3 mg/kg, s.c. ） 及 び Ritanserin（ 0.5 mg/kg, i.p. ） は そ れ 自 体 で 摂 食 ま で の 潜 時 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た （ Fig. 22A, B）。
(A) 5 -HT1 A receptor (B) 5-HT2 A / 2 C receptor
Fig. 22 Effects of a 5 -HT1 A receptor antagonist or a 5 -HT2 A / 2 C receptor antagonist on the action of CX546 in the NSFT in mice.
CX546 (10 mg/kg, s.c.) was administered 30 min prior to the test. (A) WAY100635 (3 mg/kg, s.c.) was administered 60 min prior to the test. **p < 0.01, compared with Saline -treated Vehicle, ##p < 0.01, compared with Saline -treated CX546 (LSD post hoc test). (B) Ritanserin (0.5 mg/kg, i.p.) was administered 60 min prior to the test. **p < 0.01, compared with 0.5% MC-treated Vehicle, ++p < 0.01 compared with Ritanserin -treated Vehicle (LSD post hoc test). Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 12).
38 2-3 -16. 5 -HT1 A受 容 体 作 動 薬 の 作 用
8-OH-DPAT（ 0.1, 0.3, 1, 3 mg/kg, i.p. ）は 摂 食 ま で の 潜 時 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た（ Fig. 23）。
5HT1 A receptor agonist
Fig. 23 Effect of 8 -OH-DPAT in the NSFT in mice.
8-OH-DPAT (0.1, 0.3, 1, 3 mg/kg, s.c.) was admi nistered 30 min prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 8).
39 2-4 考 察
本 章 で は NSFT を 用 い て mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 で あ る LY341495、 mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 で あ る MPEP 及 び Ketamine の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に お け る セ ロ ト ニ ン 神 経 系 の 関 与 に つ い て 検 討 し た 。
NSFT に お け る LY341495 及 び Ketamine の 抗 う つ 様 作 用 は AMPA 受 容 体 拮 抗 薬 で あ る NBQX に よ り 拮 抗 さ れ た 。NBQX は そ れ 自 体 で は 摂 食 ま で の 潜 時 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た 。 ま た 、 本 研 究 で 用 い た LY341495、 MPEP 及 び Keamine の 用 量 は そ れ 自 体 で 摂 餌 量 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た こ と か ら 、こ れ ら 薬 物 の 抗 う つ 様 作 用 は 非 特 異 的 な 作 用 で は な い こ と が 示 さ れ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamine は AMPA 受 容 体 の 活 性 化 を 介 し て 抗 う つ 様 作 用 を 発 現 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。こ の こ と は AMPA 受 容 体 増 強 薬 で あ る CX546 が 本 モ デ ル に お い て 抗 う つ 様 作 用 を 発 揮 し 、 そ の 作 用 が NBQX に よ り 拮 抗 さ れ た 結 果 か ら も 支 持 さ れ る 。本 章 の 結 果 は 、他 の 動 物 モ デ ル に お け る 結 果 と も 一 致 す る （ 26, 29, 53）。 さ ら に 、 mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 が グ ル タ ミ ン 酸 作 動 性 神 経 終 末 の 自 己 受 容 体 を 抑 制 す る こ と に よ り 、前 頭 前 皮 質 で の グ ル タ ミ ン 酸 遊 離 を 促 進 す る こ と が 報 告 さ れ て い る （ 72）。 ま た 、 Ketamine は 前 頭 前 皮 質 の 錐 体 神 経 細 胞 の 脱 抑 制 を 惹 起 し 、 グ ル タ ミ ン 酸 遊 離 を 促 進 す る こ と が 示 唆 さ れ て い る （ 24）。 こ れ ら の こ と か ら 、 mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamine は 、 前 頭 前 皮 質 に お い て グ ル タ ミ ン 酸 遊 離 を 促 進 し 、 ポ ス ト シ ナ プ ス の AMPA 受 容 体 の 活 性 化 を 介 し て 抗 う つ 様 作 用 を 発 現 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 一 方 、 MPEP の 抗 う つ 様 作 用 は NBQX に よ り 拮 抗 さ れ ず 、 こ の AMPA 受 容 体 を 介 さ な い 作 用 は 、 FST に お け る 報 告 と も 一 致 す る （ 79）。 従 っ て 、 mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 は AMPA 受 容 体 の 活 性 化 を 介 さ ず に 抗 う つ 様 作 用 を 発 現 す る こ と が 示 さ れ た 。
41 ト ニ ン 遊 離 の 促 進 が 関 与 す る 可 能 性 が 示 さ れ た こ と 、さ ら に 、MPEP が セ ロ ト ニ ン 受 容 体 に 対 す る 親 和 性 を 有 し て い な い こ と を 考 慮 す る と （ 92）、 MPEP は セ ロ ト ニ ン 遊 離 を 促 進 し 、 間 接 的 に 5-HT2 A / 2 C 受 容 体 を 活 性 化 し て 作 用 を 発 現 す る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 本 研 究 に お い て は 、mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に セ ロ ト ニ ン 遊 離 の 促 進 が 関 与 し て い る こ と を 示 唆 し た が 、 セ ロ ト ニ ン 受 容 体 サ ブ タ イ プ の 関 与 に つ い て は mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamine と 異 な る こ と が 明 ら か と な っ た 。興 味 深 い こ と に 、 mGlu5 受 容 体 ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス に お い て 、5-HT2 A受 容 体 作 動 薬 の DOM に 対 す る 運 動 量 の 反 応 性 が 上 昇 す る こ と が 報 告 さ れ て い る （ 93）。 即 ち 、 mGlu5 受 容 体 の 遮 断 に よ り 5-HT2 A受 容 体 の 感 受 性 が 増 大 す る こ と が 示 唆 さ れ て い る 。さ ら に 、5-HT2受 容 体 は GABA 神 経 に 局 在 し 、 5-HT2 A / 2 C受 容 体 作 動 薬 で あ る DOI は 前 頭 前 皮 質 に お い て GABA 遊 離 を 促 進 す る こ と が 報 告 さ れ て い る （ 94, 95）。 う つ 病 患 者 に お い て GABA 神 経 系 が 障 害 さ れ て い る こ と を 考 慮 す る と （ 96）、 5-HT2受 容 体 を 介 し た GABA 神 経 系 の 調 節 が 本 研 究 で 観 察 さ れ た mGlu5 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。
42
Fig. 24 Proposed mechanisms of the acute effect s of Ketamine, mGlu2/3 receptor antagonist and mGlu5 receptor antagonist in the NSFT.
Ketamine and mGlu2/3 receptor antagonist increase the release of 5 -HT in the prefrontal cortex via the stimulation of AMPA receptor and subsequently activate the 5 -HT1 A receptor, leading to the acute effect s in the NSFT. The mGlu5 receptor antagonist increases the release of 5 -HT in the prefrontal cortex and subsequently activate the 5 -HT2 A / 2 C receptor, leading to the acute effect in the NSFT.
mGlu2/3 receptor
antagonist
Ketamine
AMPA receptor
mGlu5 receptor
antagonist
5-HT
Prefrontal cortex
Acute antidepressant effects
44 3-2. 実 験 材 料 ・ 方 法
3-2 -1. 動 物
動 物 は 7-9 週 齢 の C57BL/6J 系 雄 性 マ ウ ス（ Charles River Laboratories, Yokohama, Japan ） を 使 用 し た 。 動 物 は 室 温 23±3℃ 、 湿 度 50±20%、 12 時 間 明 暗 サ イ ク ル （ 7:00-19:00 点 灯 ）に 調 節 さ れ た 動 物 施 設（ 大 正 製 薬 株 式 会 社 医 薬 研 究 所 内 ）に お い て 飼 育 し た 。飼 育 時 、餌 及 び 水 は 自 由 摂 取 さ せ た 。実 験 動 物 の 飼 育 及 び 実 験 操 作 は 日 本 実 験 動 物 学 会 の 実 験 動 物 に 関 す る 指 針（ 1987）及 び 大 正 製 薬 株 式 会 社 医 薬 研 究 所 の 実 験 動 物 規 定 に 従 っ て 行 な わ れ た 。 3-2 -2. 試 薬
（ 全 身 投 与 ） LY341495 は 1/15 M phosphate buffer（ pH 8.0） に 溶 解 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。 Ketamine は 生 理 食 塩 液 で 希 釈 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。 Paroxetine （ Toronto Research Chemicals Inc. , NORTH YORK, ON, Canada ） は 生 理 食 塩 液 に 溶 解 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。 NBQX は 生 理 食 塩 液 に 懸 濁 し 、薬 液 を 調 製 し た 。PCPA は 0.5% MC に 懸 濁 し 、薬 液 を 調 製 し た 。 全 身 投 与 に 使 用 す る 薬 液 の 投 与 容 量 は 10 ml/kg と し た 。
（ 局 所 投 与 ）LY341495 は 1/15 M phosphate buffer（ pH 8.0）に 溶 解 し 、リ ン ゲ ル 液（ 147 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.4 mM CaCl2） で 1000 又 は 10000 倍 希 釈 し て 、 薬 液 を 調 製 し た 。 Ketamine（ 50 mg/ml） は リ ン ゲ ル 液 で 7 又 は 70 倍 希 釈 し て 、 薬 液 を 調 整 し た 。 NBQX は DMSO に 溶 解 し 、 リ ン ゲ ル 液 で 10 倍 希 釈 し て 、 薬 液 を 調 製 し た 。 3-2 -3. 強 制 水 泳 試 験 試 験 前 日 に マ ウ ス を 飼 育 室 か ら 移 動 し 、8 匹 ／ ケ ー ジ で 実 験 室 に 馴 化 さ せ た 。試 験 に は 水 温 25±1℃ の 水 を 水 深 13±1 cm に な る よ う に 入 れ た ア ク リ ル 製 無 色 透 明 の 円 筒（ 内 径 17 cm、 高 さ 24 cm） を 使 用 し た 。 マ ウ ス を 円 筒 の 水 中 に 静 か に 入 れ 、 6 分 間 強 制 的 に 水 泳 さ せ た （ プ レ 試 験 ）。 水 泳 後 、 動 物 を 取 り 出 し 、 ホ ー ム ケ ー ジ に 戻 し た 。 プ レ 試 験 終 了 の 24.5 時 間 後 に 、マ ウ ス を 再 び 6 分 間 強 制 的 に 水 泳 さ せ た（ 試 験 ）。試 験 時 に は 円 筒 の 前 方 に 設 置 さ れ た ビ デ オ カ メ ラ に よ り マ ウ ス の 行 動 を 録 画 し た 。無 動 の 基 準 は 全 く 動 か な い か あ る い は 水 に 沈 む の を 防 ぐ た め 後 肢 を 動 か す の み の 行 動 と し た 。無 動 時 間 の 測 定 に は ス ト ッ プ ウ ォ ッ チ を 使 用 し た 。 無 動 時 間 の 短 縮 は 抗 う つ 作 用 の 発 現 を 示 す 。
45
Kyoritsuseiyaku Co., Tokyo, Japan ） で 麻 酔 後 、 脳 定 位 固 定 装 置 （ SR-5N, Narishige Co., Tokyo, Japan） に 固 定 し た 。 手 術 用 メ ス で 頭 皮 を 切 開 し 、 頭 蓋 を 露 出 さ せ 、 Paxinos and Franklin の 脳 図 譜 に 従 っ て 歯 科 用 ド リ ル で 、bregma か ら 吻 側 方 向 に 2.0 mm、側 方 に 1.4 mm の 位 置 に 直 径 1 mm 程 度 の 孔 を あ け た 。ガ イ ド カ ニ ュ ー レ（ AG-4, Eicom Co., Kyoto, Japan） の 先 端 が 内 側 前 頭 前 皮 質 に 位 置 す る よ う に 、 20 ° の 角 度 を つ け 、 脳 組 織 の 表 面 か ら 腹 側 へ 2.3 mm 刺 入 し た 。 尚 、 ガ イ ド カ ニ ュ ー レ 挿 入 位 置 よ り 後 方 の 任 意 の 位 置 に ア ン カ ー ビ ス を 埋 め 込 み 、 歯 科 用 セ メ ン ト （ GC UNIFAST, GC Co., Tokyo, Japan） を 用 い て ガ イ ド カ ニ ュ ー レ を 両 側 に 固 定 し た 。手 術 後 、ダ ミ ー カ ニ ュ ー レ（ AD-4, Eicom Co.） を ガ イ ド カ ニ ュ ー レ に 挿 入 し 、キ ャ ッ プ ナ ッ ト（ AC-1, Eicom Co.）で 固 定 し た 。内 側 前 頭 前 皮 質 へ の 薬 液 投 与 は 手 術 2 日 目 以 降 に 実 施 し た 。
内 側 前 頭 前 皮 質 内 投 与
内 側 前 頭 前 皮 質 内 投 与 は ポ リ エ チ レ ン カ テ ー テ ル を 介 し て マ イ ク ロ シ リ ン ジ （ Hamilton Co., Reno, NV, USA ） に 接 続 し た マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン カ ニ ュ ー レ （ AMI-4.5, Eicom Co.） を ガ イ ド カ ニ ュ ー レ に 挿 入 す る こ と に よ り 実 施 し た 。 LY341495 （ 0.003, 0.03 pmol/0.1 l/side）、Ketamine（ 0.3, 3 nmol/0.1 l/side）及 び NBQX（ 0.01, 0.03 nmol/0.1 l/side） は シ リ ン ジ ポ ン プ （ HARVARD APPARATUS Co., Holliston, MA, USA） を 用 い て 0.05 l/min の 速 度 で 0.1 l を 両 側 に 投 与 し た 。 投 与 終 了 後 、 マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン カ ニ ュ ー レ を 2 分 間 留 置 し た 。 LY341495 及 び Ketamine は 試 験 30 分 前 に 投 与 し 、 NBQX は 試 験 開 始 の 35 分 前 に 投 与 し た 。 試 験 終 了 後 、 薬 液 の 投 与 部 位 を 確 認 す る た め 、 Methylene blue（ 0.1 l, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA ） を 投 与 し た 。 Methylene blue は シ リ ン ジ ポ ン プ を 用 い て 0.05 l/min の 速 度 で 0.1 l を 両 側 に 投 与 し た 。 投 与 終 了 後 、マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン カ ニ ュ ー レ を 2 分 間 留 置 し た 。留 置 後 、断 頭 し て 素 早 く 脳 を 摘 出 し た 後 、 冠 状 切 片 を 作 製 し 、 実 体 顕 微 鏡 下 で 刺 入 部 位 を 確 認 し た 。
3-2 -5. 自 発 運 動 量 試 験
試 験 前 日 に マ ウ ス を 飼 育 室 か ら 移 動 し 、8 匹 ／ ケ ー ジ で 実 験 室 に 馴 化 さ せ た 。試 験 に は ア ク リ ル 製 無 色 透 明 の 円 筒 （ 内 径 30 cm、 高 さ 30 cm） を 防 音 箱 の 中 に 入 れ て 使 用 し た 。マ ウ ス を 円 筒 の 中 に 静 か に 入 れ 、自 発 運 動 量 を SCANET apparatus（ Neuroscience Inc., Tokyo, Japan） を 用 い て 60 分 間 測 定 し た 。
3-2 -6. 免 疫 染 色 灌 流 固 定
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胸 し 、心 臓 を 露 出 さ せ た 。次 に 、右 心 耳 を 切 り 、そ の 切 除 部 位 か ら 左 心 室 に ゾ ン デ を 挿 入 し 、 氷 冷 0.1 M PBS（ pH 7.4） を 10 ml 灌 流 さ せ た 後 、 氷 冷 4% PFA を 20 ml 灌 流 さ せ た 。灌 流 固 定 後 、脳 を 摘 出 し 、4% PFA で 一 晩 浸 漬 固 定（ 4℃ ）し た 後 、凍 結 保 護 の た め に 、 30%ス ク ロ ー ス に 脳 が 沈 む ま で 浸 し た 。 そ の 後 、 厚 さ 2 mm の 冠 状 切 片 （ bregma か ら 尾 側 方 向 に 4 mm～ 6 mm、背 側 縫 線 核 ）を 作 製 し 、O.C.T.コ ン パ ウ ン ド（ Sakura, Tokyo, Japan） で 包 埋 し 、 液 体 窒 素 で 凍 結 さ せ た 。 二 重 蛍 光 免 疫 染 色 法 ク リ オ ス タ ッ ト を 用 い て 、 bregma か ら -4.48 mm か ら -4.84 mm の 間 （ 背 側 縫 線 核 ） で 120 m 毎 に 40 m の 凍 結 冠 状 切 片 を 2 枚 作 製 し 、 ス ラ イ ド ガ ラ ス に マ ウ ン ト し た 後 、 風 乾 し た 。風 乾 後 、PBS で 3 分 間 ず つ 3 回 洗 浄 し 、PBS/0.3% Triton X-100/5% 正 常 ロ バ 血 清 を 加 え て 1 時 間 室 温 で ブ ロ ッ キ ン グ し た 。そ の 後 、PBS で 10 分 間 ず つ 3 回 洗 浄 し 、 1 次 抗 体 で あ る rabbit anti-c-Fos antibody（ 1:500, Abcam Inc., Cambridge, MA , USA） 及 び goat anti -TPH2 antibody （ 1:500, Abcam Inc. ） を 加 え て 4℃ で 一 晩 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 PBS で 3 分 間 ず つ 3 回 洗 浄 し た 後 、2 次 抗 体 で あ る fluorescent 594 donkey anti -rabbit IgG secondary antibody（ 1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA） 及 び 488 donkey anti-goat IgG secondary antibody （ 1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. ）を 加 え て 2 時 間 室 温 で イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。そ の 後 、PBS で 3 分 間 ず つ 3 回 洗 浄 し 、 退 色 防 止 剤 を 滴 下 し て カ バ ー ガ ラ ス で 封 入 し た 。
画 像 解 析 及 び 定 量 方 法
切 片 の 背 側 縫 線 核 に お い て 、セ ロ ト ニ ン 陽 性 細 胞 数 並 び に セ ロ ト ニ ン 及 び c-Fos で 二 重 標 識 さ れ た 細 胞 数 を 共 焦 点 顕 微 鏡 （ Leica TCS SP5, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany） を 用 い て 200 倍 及 び 400 倍 の 倍 率 で 観 察 し た 。 細 胞 数 は ImageJ software （ National Institutes of Health, Bethesda, MD , USA） を 用 い て 、 投 与 条 件 を マ ス ク し た 状 態 で カ ウ ン ト し た 。細 胞 に お け る セ ロ ト ニ ン と c-Fos の 共 局 在 は 共 焦 点 顕 微 鏡 の 400 倍 の 倍 率 で 同 定 し た 。
3-2 -7. 統 計
47 3-3. 結 果 3-3 -1. 強 制 水 泳 試 験 に お け る Paroxetine の 無 動 時 間 に 及 ぼ す 作 用 Paroxetine（ 10 mg/kg, i.p. ） は FST に お け る 無 動 時 間 を 短 縮 し 、 抗 う つ 作 用 を 示 し た （ Fig. 25）。Paroxetine は 臨 床 に お い て 、抗 う つ 薬 と し て 用 い れ ら れ て い る 。従 っ て 、今 回 用 い た FST の 条 件 は 抗 う つ 作 用 を 評 価 す る た め に 妥 当 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 SSRI
Fig. 25 Effect of Paroxetine in the FST in mice.
Paroxetine (1, 3, 10 mg/kg, i.p.) was administered 30 min prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 8). **p < 0.01 compared with Vehicle (Dunnett’s test).
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3-3 -2. 強 制 水 泳 試 験 に お け る mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 の 無 動 時 間 に 及 ぼ す 作 用
LY341495（ 1 mg/kg, i.p. ） は 無 動 時 間 を 短 縮 し 、 抗 う つ 作 用 を 示 し た （ Fig. 26）。
mGlu2/3 receptor antagonist
Fig. 26 Effect of LY341495 in the FST in mice.
LY341495 (0.1, 0.3, 1 mg/kg , i.p.) was administered 30 min prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 8). **p < 0.01 compared with Vehicle (Dunnett’s test).
3-3 -3. 強 制 水 泳 試 験 に お け る Ketamine の 無 動 時 間 に 及 ぼ す 作 用
Ketamine（ 30 mg/kg, i.p. ） は 無 動 時 間 を 短 縮 し 、 抗 う つ 作 用 を 示 し た （ Fig. 27）。
Fig. 27 Effect of Keta mine in the FST in mice.
Ketamine (3, 10, 30 mg/kg , i.p.) was administered 30 min prior to the test. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 8). *p < 0.05 compared with Vehicle (Dunnett’s test).
49
3-3 -4. Paroxetine の 抗 う つ 作 用 発 現 に お け る セ ロ ト ニ ン の 関 与
Paroxetine（ 10 mg/kg, i.p. ）の 抗 う つ 作 用 は セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA（ 300 mg/kg, i.p. , twice daily for 3 days） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 28）。 従 っ て 、 今 回 用 い た PCPA の 投 与 条 件 は セ ロ ト ニ ン 神 経 系 を 調 節 す る 薬 物 の 抗 う つ 作 用 を 消 失 さ せ る の に 十 分 で あ る こ と が 示 さ れ た 。
SSRI
Fig. 28 Effect of 5 -HT depletion on the antidepressant effect of Paroxetine in the FST in mice. Paroxetine (10 mg/kg , i.p.) was administered 30 min prior to the test. PCPA (300 mg/kg , i.p.) was administered twice daily for 3 consecutive days until the day before the pretest. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 9 -10). **p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated Vehicle, ##p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated Paroxetine (LSD post hoc test).
50
3-3 -5. mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 の 抗 う つ 作 用 発 現 に お け る セ ロ ト ニ ン の 関 与
LY341495（ 1 mg/kg, i.p. ） の 抗 う つ 作 用 は セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA（ 300 mg/kg, i.p. , twice daily for 3 days ） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 29）。
mGlu2/3 receptor antagonist
Fig. 29 Effect of 5 -HT depletion on the antidepressant effect of LY341495 in the FST in mice. LY341495 (1 mg/k ,g i.p.) was administered 30 min prior to the test. P CPA (300 mg/kg , i.p.) was administered twice daily for 3 cons ecutive days until the day before the pretest. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 10). **p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated Vehicle, ##p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated LY341495 (LSD post hoc test).
51
3-3 -6. Ketamine の 抗 う つ 作 用 発 現 に お け る セ ロ ト ニ ン の 関 与
Ketamine（ 30 mg/kg, i.p. ） の 抗 う つ 作 用 は セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA（ 300 mg/kg, i.p. , twice daily for 3 days ） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 30）。
Fig. 30 Effect of 5 -HT depletion on the antidepressant effect of Ketamine in the FST in mice. Ketamine (30 mg/kg, i.p.) was administered 30 min prior to the test. PCPA (300 mg/kg , i.p.) was administered twice daily for 3 consecutive days until the day before the pretest. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 10). **p < 0.01 compared with 0.5 % MC-treated Vehicle, ##p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated Ketamine (LSD post hoc test).
52
3-3 -7. mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 の 内 側 前 頭 前 皮 質 内 投 与 に よ る 作 用
LY341495（ 0.03 pmol/side ） の 内 側 前 頭 前 皮 質 内 投 与 は 無 動 時 間 を 短 縮 し 、 抗 う つ 作 用 を 示 し た （ Fig. 31A）。 な お 、 解 析 に 用 い た 個 体 毎 の Vehicle 及 び LY341495 の 内 側 前 頭 前 皮 質 内 に お け る 投 与 位 置 を Fig. 31B に 示 す 。
(A) mGlu2/3 receptor antagonist (mPFC) (B)
Fig. 31 Effect of microinjection of LY341495 into the mP FC in the FST in mice.
(A) LY341495 (0.003, 0.03 pmol/side) was administered into the mPFC 30 min prior to the test. (B) Location of the microinjection cannula tips in the mPFC included in the analyses of the data illustrated in (A). The line drawings are from Paxinos and Franklin (1997). The numbers to the right are the millimeters from the bregma. The open square represen ts the location of the microinjection cannula tips. IL: infralimbic, PrL: prelimbic. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 8). **p < 0.01 compared with Vehicle (Dunnett’s test).
53
3-3 -8. Ketamine の 内 側 前 頭 前 皮 質 内 投 与 に よ る 作 用
Ketamine（ 3 nmol/side ） の 内 側 前 頭 前 皮 質 内 投 与 は 無 動 時 間 を 短 縮 し 、 抗 う つ 作 用 を 示 し た（ Fig. 32A）。な お 、解 析 に 用 い た 個 体 毎 の Vehicle 及 び Ketamine の 内 側 前 頭 前 皮 質 内 に お け る 投 与 位 置 を Fig. 32B に 示 す 。
(A) Ketamine (mP FC) (B)
Fig. 32 Effect of microinjection of Ketamine into the mP FC in the FST in mice.
(A) Ketamine (0.3, 3 nmol/side) was administered into the mPFC 30 min prior to the test. (B) Location of the microinjection cannula tips in the mPFC included in the analyses of the data illustrated in (A). The line dra wings are from Paxinos and Franklin (1997) . The numbers to the right are the millimeters from the bregma. The open square represents the location of the microinjection cannula tips. IL: infralimbic, PrL: prelimbic. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 7 -8). **p < 0.01 compared with Vehicle (Dunn ett’s test).
54
3-3 -9. mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 の 内 側 前 頭 前 皮 質 内 投 与 に よ る 抗 う つ 作 用 発 現 に お け る セ ロ ト ニ ン の 関 与
LY341495（ 0.03 pmol/side ） の 内 側 前 頭 前 皮 質 内 投 与 に よ る 抗 う つ 作 用 は セ ロ ト ニ ン 枯 渇 薬 の PCPA（ 300 mg/kg, i.p., twice daily for 3 days） に よ り 拮 抗 さ れ た （ Fig. 33A）。 な お 、 解 析 に 用 い た 個 体 毎 の Vehicle 及 び LY341495 の 内 側 前 頭 前 皮 質 内 に お け る 投 与 位 置 を Fig. 33B に 示 す 。
(A) mGlu2/3 receptor antagonist (mPFC) (B)
Fig. 33 Effect of 5 -HT depletion on the antidepressant effect of microinjection of LY341495 into the mP FC in the FST in mice.
(A) LY341495 (0.03 pmol/side) was administered into the mP FC 30 min prior to the test. PCPA (300 mg/kg, i.p.) was administered t wice daily for 3 consecutive days until the day before the pretest. (B) Location of the microinjection cannula tips in the mP FC included in the analyses of the data illustrated in (A). The line drawings are from Paxinos and Franklin (1997). The numbers to the right are the millimeters from the bregma. The open square represents the location of the microinjection cannula tips. IL: infralimbic, PrL: prelimbic. Values indicate the mean ± S.E.M. (n = 8). **p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated Vehicle, ##p < 0.01 compared with 0.5% MC -treated LY341495 (LSD post hoc test).
