5-HT 1A receptor 5-HT 2A/2C receptor

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第 3 章 代 謝 型 グ ル タ ミ ン 酸 2/3 受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamine の 抗 う つ 作 用 に お け る 内 側 前 頭 前 皮 質 － 背 側 縫 線 核 回 路 を 介 し た セ ロ ト ニ ン 神 経 の 関 与

3-1. 序 論

第 2 章 に お い て 、mGlu2/3受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamineの NSFTに お け る 抗 う つ 様 作 用 発 現 に は 何 れ も 共 通 す る セ ロ ト ニ ン 神 経 系 の 活 性 化 が 関 与 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 セ ロ ト ニ ン 神 経 は 背 側 縫 線 核 に 神 経 核 を 有 し 、こ の セ ロ ト ニ ン 神 経 は 前 頭 前 皮 質 、外 側 手 綱 核 、線 条 体 、尾 側 淡 蒼 球 、視 床 、視 床 下 部 及 び 扁 桃 体 な ど か ら の 神 経 投 射 に よ り そ の 活 性 が 制 御 さ れ て い る （97）。 最 近 、 内 側 前 頭 前 皮 質 か ら の グ ル タ ミ ン 酸 神 経 に よ り 制 御 さ れ て い る 背 側 縫 線 核 の 神 経 を オ プ ト ジ ェ ネ テ ィ ク ス に よ り 選 択 的 に 刺 激 す る と 強 制 水 泳 試 験 （FST） に お い て 抗 う つ 作 用 が 発 現 し 、 内 側 前 頭 前 皮 質 及 び 背 側 縫 線 核 の 神 経 全 体 の 刺 激 で は 抗 う つ 作 用 は 発 現 し な い と 報 告 さ れ た （98）。 こ の こ と か ら 、 内 側 前 頭 前 皮 質 か ら 背 側 縫 線 核 に 投 射 し て い る グ ル タ ミ ン 酸 神 経 に よ り 選 択 的 に 活 性 化 さ れ る セ ロ ト ニ ン 神 経 が 抗 う つ 作 用 の 発 現 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。ま た 、こ の 仮 説 は 、内 側 前 頭 前 皮 質 の 脳 深 部 刺 激 に よ る 抗 う つ 作 用 が セ ロ ト ニ ン 枯 渇 に よ り 拮 抗 さ れ る こ と か ら も 支 持 さ れ る （99）。 こ れ ま で に 、 著 者 ら は 、 mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 が 背 側 縫 線 核 の セ ロ ト ニ ン 神 経 発 火 を 促 進 す る こ と 、及 び AMPA 受 容 体 の 活 性 化 を 介 し て 内 側 前 頭 前 皮 質 に お け る 細 胞 外 セ ロ ト ニ ン 量 を 増 加 さ せ る こ と を 報 告 し て い る （53, 100）。 ま た 、NMDA 受 容 体 拮 抗 薬 の MK-801 は 内 側 前 頭 前 皮 質 の AMPA 受 容 体 活 性 化 を 介 し て 内 側 前 頭 前 皮 質 に お け る 細 胞 外 セ ロ ト ニ ン 量 を 増 加 さ せ る こ と も 報 告 さ れ て い る （101）。 従 っ て 、mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamine は 内 側 前 頭 前 皮 質 の AMPA 受 容 体 の 活 性 化 を 介 し て 背 側 縫 線 核 の セ ロ ト ニ ン 神 経 発 火 を 促 進 さ せ 、内 側 前 頭 前 皮 質 に お け る セ ロ ト ニ ン 遊 離 を 増 加 さ せ て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 さ ら に 、 第 2 章 に お い て 、mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamine の 抗 う つ 様 作 用 発 現 に は 、AMPA 受 容 体 を 介 し た セ ロ ト ニ ン 神 経 系 の 活 性 化 が 関 与 す る こ と を 示 唆 し た 。こ れ ら の こ と か ら 、mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamine の 抗 う つ 作 用 発 現 に は 内 側 前 頭 前 皮 質 の AMPA 受 容 体 の 活 性 化 を 介 し て 調 節 さ れ る 背 側 縫 線 核 の セ ロ ト ニ ン 神 経 の 活 性 化 が 関 与 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 し か し な が ら 、mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamine の 抗 う つ 作 用 発 現 に 内 側 前 頭 前 皮 質 － 背 側 縫 線 核 回 路 の グ ル タ ミ ン 酸 神 経 を 介 し た セ ロ ト ニ ン 神 経 の 活 性 が 関 与 す る か 否 か に つ い て は 明 ら か に さ れ て い な い 。そ こ で 、 第 3 章 で は 、mGlu2/3 受 容 体 拮 抗 薬 及 び Ketamine の 抗 う つ 作 用 発 現 に お け る 内 側 前 頭 前 皮 質 － 背 側 縫 線 核 回 路 に よ り 制 御 さ れ る セ ロ ト ニ ン 神 経 の 関 与 に つ い て 最 も 一 般 的 な 抗 う つ 活 性 の 評 価 方 法 で あ る FST、脳 内 微 量 注 入 法 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 手 法 を 用 い 検 討 し た 。

44 3-2. 実 験 材 料 ・ 方 法

3-2 -1. 動 物

動 物 は 7-9週 齢 の C57BL/6J系 雄 性 マ ウ ス（Charles River Laboratories, Yokohama, Japan） を 使 用 し た 。 動 物 は 室 温 23±3℃ 、 湿 度 50±20%、12 時 間 明 暗 サ イ ク ル （7:00-19:00点 灯 ）に 調 節 さ れ た 動 物 施 設（ 大 正 製 薬 株 式 会 社 医 薬 研 究 所 内 ）に お い て 飼 育 し た 。飼 育 時 、餌 及 び 水 は 自 由 摂 取 さ せ た 。実 験 動 物 の 飼 育 及 び 実 験 操 作 は 日 本 実 験 動 物 学 会 の 実 験 動 物 に 関 す る 指 針（1987）及 び 大 正 製 薬 株 式 会 社 医 薬 研 究 所 の 実 験 動 物 規 定 に 従 っ て 行 な わ れ た 。

3-2 -2. 試 薬

（ 全 身 投 与 ）LY341495 は 1/15 M phosphate buffer（pH 8.0） に 溶 解 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。Ketamine は 生 理 食 塩 液 で 希 釈 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。Paroxetine（Toronto Research Chemicals Inc., NORTH YORK, ON, Canada） は 生 理 食 塩 液 に 溶 解 し 、 薬 液 を 調 製 し た 。 NBQX は 生 理 食 塩 液 に 懸 濁 し 、薬 液 を 調 製 し た 。PCPAは 0.5% MC に 懸 濁 し 、薬 液 を 調 製 し た 。 全 身 投 与 に 使 用 す る 薬 液 の 投 与 容 量 は 10 ml/kg と し た 。

（ 局 所 投 与 ）LY341495は 1/15 M phosphate buffer（pH 8.0）に 溶 解 し 、リ ン ゲ ル 液（147 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.4 mM CaCl2） で 1000 又 は 10000 倍 希 釈 し て 、 薬 液 を 調 製 し た 。 Ketamine（50 mg/ml） は リ ン ゲ ル 液 で 7 又 は 70 倍 希 釈 し て 、 薬 液 を 調 整 し た 。NBQX は DMSOに 溶 解 し 、 リ ン ゲ ル 液 で 10 倍 希 釈 し て 、 薬 液 を 調 製 し た 。

3-2 -3. 強 制 水 泳 試 験

試 験 前 日 に マ ウ ス を 飼 育 室 か ら 移 動 し 、8 匹 ／ ケ ー ジ で 実 験 室 に 馴 化 さ せ た 。試 験 に は 水 温 25±1℃ の 水 を 水 深 13±1 cmに な る よ う に 入 れ た ア ク リ ル 製 無 色 透 明 の 円 筒（ 内 径 17 cm、 高 さ 24 cm） を 使 用 し た 。 マ ウ ス を 円 筒 の 水 中 に 静 か に 入 れ 、6 分 間 強 制 的 に 水 泳 さ せ た （ プ レ 試 験 ）。 水 泳 後 、 動 物 を 取 り 出 し 、 ホ ー ム ケ ー ジ に 戻 し た 。 プ レ 試 験 終 了 の 24.5時 間 後 に 、マ ウ ス を 再 び 6 分 間 強 制 的 に 水 泳 さ せ た（ 試 験 ）。試 験 時 に は 円 筒 の 前 方 に 設 置 さ れ た ビ デ オ カ メ ラ に よ り マ ウ ス の 行 動 を 録 画 し た 。無 動 の 基 準 は 全 く 動 か な い か あ る い は 水 に 沈 む の を 防 ぐ た め 後 肢 を 動 か す の み の 行 動 と し た 。無 動 時 間 の 測 定 に は ス ト ッ プ ウ ォ ッ チ を 使 用 し た 。 無 動 時 間 の 短 縮 は 抗 う つ 作 用 の 発 現 を 示 す 。

Ketamine（3, 10, 30 mg/kg）、LY341495（0.1, 0.3, 1 mg/kg）及 び Paroxetine（1, 3, 10 mg/kg）

は 試 験 の 30分 前 に 腹 腔 内 投 与 し た 。NBQX（1, 3, 10 mg/kg） は 試 験 の 35 分 前 に 皮 下 投 与 し た 。PCPA（300 mg/kg） は プ レ 試 験 前 日 ま で 3 日 間 、1 日 2 回 腹 腔 内 投 与 し 、 プ レ 試 験 は PCPA最 終 投 与 の 18 時 間 後 以 降 に 行 な っ た 。

3-2 -4. 脳 内 微 量 注 入 法

ガ イ ド カ ニ ュ ー レ の 埋 め 込 み

マ ウ ス を ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム （ ソ ム ノ ペ ン チ ル 、50 mg/kg, i.p.,

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Kyoritsuseiyaku Co., Tokyo, Japan） で 麻 酔 後 、 脳 定 位 固 定 装 置 （SR-5N, Narishige Co., Tokyo, Japan） に 固 定 し た 。 手 術 用 メ ス で 頭 皮 を 切 開 し 、 頭 蓋 を 露 出 さ せ 、Paxinos and Franklin の 脳 図 譜 に 従 っ て 歯 科 用 ド リ ル で 、bregma か ら 吻 側 方 向 に 2.0 mm、側 方 に 1.4 mm の 位 置 に 直 径 1 mm 程 度 の 孔 を あ け た 。ガ イ ド カ ニ ュ ー レ（AG-4, Eicom Co., Kyoto, Japan） の 先 端 が 内 側 前 頭 前 皮 質 に 位 置 す る よ う に 、20°の 角 度 を つ け 、 脳 組 織 の 表 面 か ら 腹 側 へ 2.3 mm 刺 入 し た 。 尚 、 ガ イ ド カ ニ ュ ー レ 挿 入 位 置 よ り 後 方 の 任 意 の 位 置 に ア ン カ ー ビ ス を 埋 め 込 み 、 歯 科 用 セ メ ン ト （GC UNIFAST, GC Co., Tokyo, Japan） を 用 い て ガ イ ド カ ニ ュ ー レ を 両 側 に 固 定 し た 。手 術 後 、ダ ミ ー カ ニ ュ ー レ（AD-4, Eicom Co.）

を ガ イ ド カ ニ ュ ー レ に 挿 入 し 、キ ャ ッ プ ナ ッ ト（AC-1, Eicom Co.）で 固 定 し た 。内 側 前 頭 前 皮 質 へ の 薬 液 投 与 は 手 術 2 日 目 以 降 に 実 施 し た 。

内 側 前 頭 前 皮 質 内 投 与

内 側 前 頭 前 皮 質 内 投 与 は ポ リ エ チ レ ン カ テ ー テ ル を 介 し て マ イ ク ロ シ リ ン ジ

（Hamilton Co., Reno, NV, USA） に 接 続 し た マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン カ ニ ュ ー レ

（AMI -4.5, Eicom Co.） を ガ イ ド カ ニ ュ ー レ に 挿 入 す る こ と に よ り 実 施 し た 。LY341495

（0.003, 0.03 pmol/0.1 l /side）、Ketamine（0.3, 3 nmol/0.1 l/side）及 び NBQX（0.01, 0.03 nmol/0.1 l/side） は シ リ ン ジ ポ ン プ （HARVARD APPARATUS Co., Holliston, MA, USA）

を 用 い て 0.05 l/min の 速 度 で 0.1 l を 両 側 に 投 与 し た 。 投 与 終 了 後 、 マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン カ ニ ュ ー レ を 2 分 間 留 置 し た 。LY341495 及 び Ketamine は 試 験 30 分 前 に 投 与 し 、NBQX は 試 験 開 始 の 35 分 前 に 投 与 し た 。 試 験 終 了 後 、 薬 液 の 投 与 部 位 を 確 認 す る た め 、Methylene blue（0.1 l, Sigma -Aldrich Co., St. Louis, MO, USA） を 投 与 し た 。 Methylene blueは シ リ ン ジ ポ ン プ を 用 い て0.05 l/minの 速 度 で0.1 lを 両 側 に 投 与 し た 。 投 与 終 了 後 、マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン カ ニ ュ ー レ を 2 分 間 留 置 し た 。留 置 後 、断 頭 し て 素 早 く 脳 を 摘 出 し た 後 、 冠 状 切 片 を 作 製 し 、 実 体 顕 微 鏡 下 で 刺 入 部 位 を 確 認 し た 。

3-2 -5. 自 発 運 動 量 試 験

試 験 前 日 に マ ウ ス を 飼 育 室 か ら 移 動 し 、8 匹 ／ ケ ー ジ で 実 験 室 に 馴 化 さ せ た 。試 験 に は ア ク リ ル 製 無 色 透 明 の 円 筒 （ 内 径 30 cm、 高 さ 30 cm） を 防 音 箱 の 中 に 入 れ て 使 用 し た 。マ ウ ス を 円 筒 の 中 に 静 か に 入 れ 、自 発 運 動 量 を SCANET apparatus（Neuroscience Inc., Tokyo, Japan） を 用 い て 60 分 間 測 定 し た 。

3-2 -6. 免 疫 染 色 灌 流 固 定

灌 流 固 定 は LY341495（0.003, 0.03 pmol/0.1 l/side, 1 mg/kg, s.c.） 及 び Ketamine（0.3, 3 nmol/0.1 l/side, 30 mg/kg, s.c.） の 投 与 90 分 後 並 び に NBQX（0.03 nmol/0.1 l /side）

の 投 与 95 分 後 に 行 っ た 。 こ れ ら の 薬 物 の 投 与 時 間 は 先 行 研 究 を 参 考 に し た （102）。 マ ウ ス を 吸 入 麻 酔 （Isoflurane; Mylan Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan） 後 、 開 腹 、 開

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胸 し 、心 臓 を 露 出 さ せ た 。次 に 、右 心 耳 を 切 り 、そ の 切 除 部 位 か ら 左 心 室 に ゾ ン デ を 挿 入 し 、 氷 冷 0.1 M PBS（pH 7.4） を 10 ml 灌 流 さ せ た 後 、 氷 冷 4% PFAを 20 ml 灌 流 さ せ た 。灌 流 固 定 後 、脳 を 摘 出 し 、4% PFAで 一 晩 浸 漬 固 定（4℃ ）し た 後 、凍 結 保 護 の た め に 、30%ス ク ロ ー ス に 脳 が 沈 む ま で 浸 し た 。 そ の 後 、 厚 さ 2 mmの 冠 状 切 片 （bregma か ら 尾 側 方 向 に 4 mm～6 mm、背 側 縫 線 核 ）を 作 製 し 、O.C.T.コ ン パ ウ ン ド（Sakura, Tokyo, Japan） で 包 埋 し 、 液 体 窒 素 で 凍 結 さ せ た 。

二 重 蛍 光 免 疫 染 色 法

ク リ オ ス タ ッ ト を 用 い て 、bregma か ら-4.48 mmか ら-4.84 mmの 間 （ 背 側 縫 線 核 ） で 120 m毎 に 40 mの 凍 結 冠 状 切 片 を 2枚 作 製 し 、 ス ラ イ ド ガ ラ ス に マ ウ ン ト し た 後 、 風 乾 し た 。風 乾 後 、PBSで 3 分 間 ず つ 3 回 洗 浄 し 、PBS/0.3% Triton X -100/5% 正 常 ロ バ 血 清 を 加 え て 1 時 間 室 温 で ブ ロ ッ キ ン グ し た 。そ の 後 、PBSで 10分 間 ず つ 3 回 洗 浄 し 、 1 次 抗 体 で あ る rabbit anti-c-Fos antibody（1:500, Abcam Inc., Cambridge, MA , USA） 及 び goat anti -TPH2 antibody（1:500, Abcam Inc.） を 加 え て 4℃ で 一 晩 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 PBS で 3 分 間 ず つ 3 回 洗 浄 し た 後 、2 次 抗 体 で あ る fluorescent 594 donkey anti -rabbit IgG secondary antibody（1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA） 及 び 488 donkey anti -goat IgG secondary antibody（1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.）を 加 え て 2 時 間 室 温 で イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。そ の 後 、PBSで 3 分 間 ず つ 3 回 洗 浄 し 、 退 色 防 止 剤 を 滴 下 し て カ バ ー ガ ラ ス で 封 入 し た 。

画 像 解 析 及 び 定 量 方 法

切 片 の 背 側 縫 線 核 に お い て 、セ ロ ト ニ ン 陽 性 細 胞 数 並 び に セ ロ ト ニ ン 及 び c-Fosで 二 重 標 識 さ れ た 細 胞 数 を 共 焦 点 顕 微 鏡 （Leica TCS SP5, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany） を 用 い て 200 倍 及 び 400 倍 の 倍 率 で 観 察 し た 。 細 胞 数 は ImageJ software

（National Institutes of Health, Bethesda, MD , USA） を 用 い て 、 投 与 条 件 を マ ス ク し た 状 態 で カ ウ ン ト し た 。細 胞 に お け る セ ロ ト ニ ン と c-Fosの 共 局 在 は 共 焦 点 顕 微 鏡 の 400倍 の 倍 率 で 同 定 し た 。

3-2 -7. 統 計

結 果 は 全 て 平 均 値 ± 標 準 誤 差 で 示 し た 。 多 群 間 比 較 の 場 合 は 、 一 元 配 置 分 散 分 析

（one-wa y analysis of variance : one -way ANOVA）又 は 二 元 配 置 分 散 分 析（two -way ANOVA）

を 用 い て 解 析 し た 後 、post-hoc解 析 と し て Dunnett ’s test又 は LSD test を 実 施 し た 。2 群 の 場 合 は Student ’s t-test を 用 い た 。 有 意 水 準 は 何 れ も 5%未 満 と し た 。 全 て の 統 計 解 析 に は SAS 9.2（SAS Institute Japa n Ltd., Tokyo, Japan） を 用 い た 。