博士（薬学）山田勇磨 学位論文題名
ミトコンドリア標的型ナノデバイス MITO −Porter の創製
〜膜融合を介したミトコンドリアへの新規薬物送達戦略〜
学位論文内容の要旨
【結果と考察】
1．識子墓物のナノ粒ヨコ匕パッケージング技術の開発
多彩な機能を有するミトコンドリアを標的とした場合、様カな治療薬物が候補として挙げられる。
その中には、mtDNA（遺伝子補充）や機能性タンパク質など高分子薬物も挙げられる3、。これらの 治 療は非常に魅力的 であるが、高分子薬物の効率 的なパッケージング方法が 確立されていなか ったため、遺伝子治療、タンパク質治療への応用は難しかった。
当 研 究 室 で は 、 新 た な 人 工 遺 伝 子 ベ ク タ ー と し て 多 機 能 性 エン ベロ ープ 型 ナノ 構造 体 (MEND)の開発 を進めている5，帥。MENDは ポリカチオンによって凝縮 化された核酸ナノ粒子が脂 質 膜中 に存 在す る 特徴 的な 構造 を有 す るた め、 封入 率が非常に高い。その ため、MENDは薬理 作 用 を 発 揮 す る の に 十 分 量 の 薬 物 を 疾 患 部 位 ヘ 送 達 す る こ と が 可 能 で あ る 。 MENDはpDNAの 封 入に は適 して いた が 、薬 物候 補と し て有 望な オリ ゴDNA、 タンパク質では ナ ノ粒 子形 成が 困 難で あっ たた め適 応 され てい なか った。私は疎水基を有 するポリカチオン STR‑R8を最 適な 比 率で 混合 する事でオリゴDNA、 タンパク質のナノ粒子形成 を可能とし、高い 効率で脂質膜内部に封入する事に成功した7，帥。
2： 麺 胞 質 遂 達 型 リ ポ ソ ー ム に よ る 癌 細 胞 ミ ト コ ン ド リ ア ニ ニ ニ cD墓 惣 送 達 ミトコンドリアヘの薬物送達研究の第一弾として、リポソームを用いた癌細胞ミトコンドリアを標的 とした薬物送達研究を試みた。当研究室では、癌標的リガンドであるトランスフェリン(Tf)、エンド ソ ーム 脱 出素 子GALAを 用 いる 事で 癌細 胞質 中 への薬 物送達を可能とするりポソー ムの開発に 成功 している(Tf＆GAI一Aシステ ム）。Tfは癌細胞に過剰発現 する事が報告されており、薬物封 入リ ポソームに表面修飾する事で、リポソームを受容体介在性エンドサイトーシスによって細胞内 に取り込ませる事が可能である。しかし、細胞に取り込まれたりポソームはエンドソームから脱出し なけ れば、ライソソームで分解さ れてしまう。当研究室の角道らは、pH感受性膜融合性ペプチド GALAをりポソーム表面に修 飾する事で、エンドソーム 内が酸性環境化になった時に 膜融合を誘 起 し、薬物を細胞質中に送 達する戦略を考案し、リポ ソーム内封薬物を細胞質に送 達する事に 成功している9）。
私 は、アポトーシス誘導ペプチド、マストパランlo）をTf＆GALA搭載リポソームに封入し、癌細
一317―
胞 ミトコ ンドリ アを 標的と した癌細胞殺傷アプローチを試みた。マストパランがミトコンドリアに送達さ れ る と チ トク ロ ムcが 細胞 質 中 に 放 出 され 、 こ れ が 引き 金 と な ル アポ ト ー シ スが 誘起さ れる 。Tf＆ GALA搭 載 リ ポ ソ ー ム に マ ス ト パ ラ ン を 封 入 し 白 血 病 細 胞 株K‑562細 胞 に 添 加 し 、 細 胞 質に 放 出 さ れ た チ トク ロ ムcをWestem blot法 に よ り 検 出し た 結 果 、 チ トク ロ ムcの 細胞 質放 出が確 認され 、 ア ポト ー シ ス が 誘起 さ れ る 事 が 示唆 さ れ た11） 。 以 上 の 結果 か ら 、Tf＆GALA搭 載 リ ポ ソ ーム を 用 い る こ と でミ トコン ドリア への薬 物送 達を可 能とし 、薬理 活性 を発揮 させる 事が可 能であ るこ とが確 認 された 。
3． 膜 融 合 を 介 し て ミ ト コ ン ド リ ア ヘ ♂ 〕 靈 物 送達 を 可 能 と する り ポ ソ ー ム ュMITO‑PorterQ開 発 ミ トコ ン ド リ ア 移 行能 を 有 す る ベプ チ ドMTSを用い た戦略 は、タ ンパ ク質、 オリゴ ヌクレ オチ ドの送 達 にお い て そ の 有 用性が 示され おり、 ミトコ ンド リアを 標的と した薬 物送 達ツー ルとし て注目 されて いる ￣2 り
し か し 、MTSに よ る 送 達 は 非 常 に 狭 い 透 過 孔 を通 過 す る た め、 送 達 さ せ たい 物 質 の 大 きさ が 制 限 さ れ 、mtDNAや 高 次 構 造 を 保 持 し た タ ン パ ク 質 な ど を 送 達 す る 事 は 不 可 能 で あ るm。 さ ら に 、 mtDNAが コー ド す る タ ン パク 質 （ 呼 吸 鎖に 関 連 す る タン パ ク 質 ）は 、MTSによっ てミト コンド リア ヘ 送 達さ れ な ぃ こ と が報 告 さ れ て おり 、 ミ ト コ ンド リ ア 病 の 大半 を占 める 呼吸鎖 酵素異 常症を 治療す るこ とは不 可能で ある。
私 は 、 こ の 問題 を 解決す るため に薬 物を封 入した りポソ ームを 細胞 内に導 入後、 ミトコ ンド リア膜 と の結 合 （lst STEP)、 膜 融 合(2nd STEP)を 介して ミトコ ンド リア内 に内封 薬物を 放出 する、 ミトコ ン ドリ ア 融 合 性 リ ポソ ー ム(MITO‑Porter)に よ る 新 規送 達 戦 略 を 考 案し た 。 本 シ ステ ム を用い る事 で封 入物質 の種類 やサイ ズによ らな い送達 が可能 となる 。
はじ めに、 ミトコ ンド リアと 融合能 の高い キャリ アを 得るた めに、 脂質膜 組成のスクリーニングを行 っ た 。 脂 質 膜 構 成 成 分 と し て よ く 用 い ら れ るEPC、 ま た は 膜 融 合 性 脂 質DOPEと 様 カ な 脂 質 を 組 み 合 わ せ 、 脂 質 膜 の 電荷 、 安 定 性 、流 動 性 な ど の性 質 を 変 化 させ た り ポ ソ ー ムを 調 製 し た 。螢 光 共 鳴エ ネ ル ギ ー 転 移(FRET)を 利 用 し たス ク リ ー ニ ング の 結 果 、ミ トコン ドリ アと融 合能の 高いり ポ ソ ー ム(DOPE/SM/STR‑R8 [9:2:1] or DOPE/PNSTR‑R8［9：2：1］ ） を 得 る 事 に 成 功 し た1釣 。 こ れ ら の 知 見 に 基 づ ぃ て 調 製 し たMITO‑PorterにGFPを 封 入 し 細 胞 内 動 態 を 共 焦 点 レ ー ザ ー ス キャ ン 顕 微 鏡 に よっ て 観 察 し た。 そ の 結 果 、内 封 物 質GFPと ミ ト コ ンド リ ア と の 共局 在が 確認さ れ 、生 細 胞 内 ミ ト コンド リアヘ の高分 子送達 が可 能であ る事が 示唆さ れた 。さら に、螢 光観察 よりも 分 解能 の 高 い 電 子 顕微 鏡 を 用 い た評 価 を 行 い 、直 径10 nmの 金 コ ロイ ド が ミ ト コ ンド リ ア内に 送達 され ている ことを 確認し た15）
生 釜 重 型MITO‑Porterの 開 発 と そ の 評価
MITO‑Porterの ミト コ ン ド リ アへ の 薬物 送達 効率を 上昇さ せる事 を目 的とし て、本 キャリ アを細 胞 膜 融 合 性 脂 質 で コ ー テ ィ ン グ し た 多 重 型MITO‑Porterの 開 発 を 試 み た 。 薬 理 効 果 を評 価 す る た め に 、DNaseIを 内 封 薬 物 に 選 択 し た 。 ミ ト コ ン ド リ ア ヘDNaseIが 送 達 さ れ た 場 合に はmtDNAが 分 解 さ れ 、 細胞 内 の ミ ト コン ド リ ア 活 性が 低 下 す る 。
は じ めに 、DNaseIナ ノ 粒子 を 形 成 し 、ミ ト コ ン ド リ ア膜 、 細胞膜 と融合 性の高 い脂 質膜で コーテ イ ン グ し たDNaseI封 入 多 重 型MITo．Ponerの 調 製 を 行 っ た 。 粒 子 径 、 表 面 電 位 測 定 の 結 果 よ り 、 ナ ノ 構 造 体 の 形 成 を 確 認 し た。 次 に 、 調 製し た 多 重 型MITo．PonerをHeLa細 胞に 添 加 し ミ ト コ ン ド リ ア 活 性 を 評 価 し た 。 そ の結 果 、 従 来 型M11D．Ponerと 比 較 し て30倍 以 上 の 高い 活 性 を 示 す 事 が 確 認 され た 。
【 結諭】
ミ トコ ンドリ ア高融 合能リ ポソー ム MITO‑Porter は高分子を生細胞ミトコンドリアまで送達する事 が 示 さ れ た 。膜 融 合 を 介 して 内 封 分 子 をミ ト コ ン ド リア 内 に送 達する 本戦略 は、 送達分 子の大 きさ や 種 類 を 制 限 しな ぃ こ と が 期待 さ れ る 。 さら に 、 効 率 的 な薬 物 封 入 を 可能 ど 尹 るMENDシ ス テム と 多 重 型 コ ン セ プ ト を 導 入 し た 多 重 型MITO‑Porterは 、 従 来 型MITO‑Porterの薬 物 送 達 効 率・ 薬 理 効 果を飛 躍的に 上昇 させた 。今後 は、MI'I、o‐Ponerをより 進化 させ、 ミトコンドリアを標的とした疾 患 治療が 可能な キャ リアの 創製を 目指し 研究 を進め ていき たい。
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【参 考文 献】
Chan D.C., Cell, 125, 1241‑1252 (2006).
SchapiraA.H., Lancet, 368, 70‑82 (2006).
Yamada Y. et al., Mitochondrion, 7, 63‑71 (2007).
Weissig V et al., Mitochondrion, 3, 229‑244 (2004).
Kogure K. et al., J Control Release, 98, 317‑323 (2004).
Kogure K. et al., Adv Drug Deliv Rev, 60, 559‑571 (2008).
Yamada Y. et al, Biol Pharm Bull, 28, 1939‑1942 (2005).
Suzuki R. et al, Biol Pharm Bull, 30, 758‑762 (2007).
Kakudo T. et al, Biochemistry, 43, 5618‑5628 (2004).
Zimmerberg J. et al, Nature, 323, 36‑39 (1986).
Yamada Y. et al,Int J Pharm, 303, 1‑7 (2005).
Schatz G., J Biol Chem, 271, 31763‑31766 (1996).
FlierlA. et al, Mol Ther, 7, 550‑557 (2003).
Endo T. et‑ al, J Biochem (Tokyo), 118, 753‑759 (1995).
Yamada Y. et al, Biochim Biophys Acta, 1778, 423‑432 (2008).
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34 56 7a o o wl H H 11 ,+
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
ミトコンドリア標的型ナノデバイス IVIITO − Porter の 創製
〜膜融合を介したミトコンドリアヘの新規薬物送達戦略〜
近年、ミトコンドリアと様々な疾患との関連が明らかとなってきており、本オルガネラを標的 と した 薬物 治療 が注 目さ れて いる 。そ のた め、 ミト コンドリアを標的としたDrug Delivery
System (DDS)を 構築 する 必要 があ るが 、疾 患治 療を 実現 す るレ ベル のシ ステ ムは構築され ていない。本論文では、薬物キャリアとして注目されているりポソームに着目したミトコンドリ ア 標 的 型
DDSの 創 製 に つ い て 述 べ ら れ て い た 。山 田勇 磨氏 はミ トコ ンド リ ア標 的型
DDSに は 、薬 物の 効率 的な パッ ケージングおよぴ細胞内動態制 御に基づぃたミトコンドリアへの送 達 が 必 要 不 可 欠 と 考 え 、 こ れ ら の 要 素 を 満 た す
DDSの 創 製 を 目 指 し 研 究 を 行 っ た 。
効率 的な パッ ケー ジン グを 目指 した 研究 とし て、 山田 勇 磨氏 が所 属す る北 海道大学大学 院 薬 学 研 究 院 ・ 薬 剤 分 子 設 計 学 研 究 室 で 構 築 され た多 機能 性エ ンベ ロー プ型 ナノ 構造 体
(MEND)に 着 目 し て 研 究 を 進 め た 。
MENDは ポ リ カチ オン によ って 凝縮 化さ れた 核酸 ナノ 粒 子 が 脂 質 膜 中 に 存 在 す る 特 徴 的 な 構 造 を 有 す る た め 、 封 入 率 が 非 常 に 高 い 。
MENDは
pDNAの 封 入 に は 適 し て い た が 、 薬 物 候 補 と し て有 望な タン パク 質で はナ ノ粒 子形 成が 困 難 であ った ため 適応 され ていなかった。山田勇磨氏は、 タンパク質は大きな電荷を有さない の でポ リカ チオ ンで のナ ノ粒子形成は不可能であると考 え、タンパク質の有する疎水性領域 に 着目 した 。検 討の 結果 、疎 水基 を有 する ポリ カチ オン
STR‑R8を使 用す る事 でナノ粒子形 成 が可 能で ある 事を みい だし 、高 い効 率で 脂質 膜内 部に 封 入す る事 に成 功し た。この成果 は、タンパク質DDS の基盤技術となると期待される。
ミトコンドリア移行能を有 するペプチドMTS は、タンパク質、オリゴヌクレオチドの選択的送 達 ツ ー ル と し て 報 告さ れて いる が、 送達 分子 の種 類や 大き さを 制限 する た め、
mtDNA由 来
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タンパク質 、mtDNA などの送達は不可能 である。ミトコンドリア病の大半がこれらのタンパク 質の 変異 ・欠 損に より 引き 起こ され るの で、
MTSに 代わ る新 たな
DDSが 必要 と思 われる。こ の問 題を 解決 する ため に、 山田勇磨氏 は、膜融合を介して内封薬物をミトコンドリア内に送 達するりポソーム
MITO‑Porter'の開発に着手した。このシステムでは、薬物を封入したりポ ソームを細胞内に導入後、ミトコンドリア膜との膜融合を介してミトコンドリア内に内封薬物を 放出するため、封入薬物の種類やサイズによらない 送達が可能となる。ミトコンドリアと融合 能の 高い 脂質 膜組 成の スク リー ニン グを 螢光 共 鳴エ ネル ギー 転移
(FRET)と 単離 ミトコンド リ ア を 用 い て 行 っ た 。 そ の 結 果 、 ミ ト コ ン ド リア と融 合能 の高 い 脂質 組成 のり ポソ ーム
(DOPE/SM/STR‑R8 [9:2:1] or DOPE/PA/STR‑R8 [9:2:1]゜MITO‑Porter) を調 製す る事 に成 功し た。 次に 、細 胞内 ミト コンドリア への薬物送達が可能であるか否かを評価するために、
MITO
ー
Porterに
GFPを 封 入 し そ の 細 胞 内 動 態 を 観察 した 。そ の結 果、 内封 物質
GFPと ミト コンドリアとの共局在が確認され、生細胞内ミトコ ンドリアへの高分子送達が可能である事が 示唆された。さらに、電子顕微鏡を用いた評価を行い、直径10 nm の金コロイドがミトコンドリ ア内に送達されていることを確認した。MITO‑Porter がGFP や金コロイドを生細胞ミ卜コンドリ アへ の送 達す る事 より 、薬 物の 種類 や大 きさ に よら なぃ 送達 が可 能に なる と期 待される。
