胆 汁 酸 ト ラ ン ス ポ ー タ ー

胆 汁 酸 ト ラ ン ス ポ ー タ ー NTCP/SLC10A1 を 標 的 と し た B 型 肝 炎 ウ イ ル ス の 感 染 阻 害 薬 開 発 と 感 染 機 構 の 解 明 Elucidation of Molecular Mechanism of Hepatitis B Virus Infection and Drug Discovery Targeting Bile Acid Transporter, NTCP/SLC10A1

平 成 27 年 度 入 学 深 野 顕 人 （ Fukano, Kento）

指 導 教 員 小 笠 原 裕 樹

〜 背 景 〜

B 型 肝 炎 ウ イ ル ス（ HBV ）は 全 世 界 で お よ そ 2 億 6 千 万 人 、日 本 に 約 100 万 人 の キ ャ リ ア が 存 在 す る と 推 定 さ れ て お り 、 そ の 持 続 感 染 は 肝 硬 変 、 肝 細 胞 が ん な ど 慢 性 肝 疾 患 の 発 症 リ ス ク を 高 め る 。 HBV に 対 す る 現 行 の 抗 ウ イ ル ス 薬 と し て 、 イ ン タ ー フ ェ ロ ン α （ interferon-alpha: IFN α ） 及 び ペ グ 化 IFNα な ど の IFN 類 や 、ラ ミ ブ ジ ン 、ア デ ホ ビ ル 、エ ン テ カ ビ ル 、テ ノ ホ ビ ル と い っ た 核 酸 ア ナ ロ グ 型 逆 転 写 酵 素 阻 害 剤 が 用 い ら れ て い る 。 し か し な が ら 、 副 作 用 や 薬 剤 耐 性 ウ イ ル ス の 出 現 と い っ た 問 題 に 加 え 、 こ れ ら の 治 療 薬 は 一 度 感 染 し た 細 胞 か ら HBV を 完 全 に 排 除 す る こ と は 非 常 に 困 難 で あ る 。 そ の た め 、 こ れ ま で と は 異 な っ た 作 用 機 序 を 有 す る 治 療 薬 の 開 発 が 求 め ら れ て い る 。

HBV が 肝 細 胞 へ 侵 入 す る 際 に 必 須 の 宿 主 受 容 体 と し て 、肝 細 胞 基 底 膜 側

表 面 に 特 異 的 に 発 現 す る 胆 汁 酸 ト ラ ン ス ポ ー タ ー sodium taurocholate

cotransporting polypeptide / solute carrier family 10 member 1 （ NTCP/SLC10A1 ）

が 2012 年 に 報 告 さ れ て 以 来 、 NTCP を 標 的 と す る HBV 侵 入 阻 害 化 合 物 の

探 索 が 盛 ん に 行 わ れ て き た 。 し か し 、 こ れ ま で に 報 告 さ れ て い る HBV 侵

入 阻 害 化 合 物 の ほ ぼ 全 て は 、 HBV の 侵 入 だ け で な く NTCP 本 来 の 機 能 で あ る 肝 細 胞 内 へ の 胆 汁 酸 取 り 込 み も 阻 害 し て し ま う た め 、 胆 汁 酸 代 謝 変 化 に よ る 様 々 な 副 作 用 が 懸 念 さ れ る 。 そ こ で 本 研 究 で は ま ず 、 NTCP を 標 的 と し つ つ 、そ の 生 理 機 能 に は 影 響 せ ず に HBV 感 染 を 阻 害 で き る 特 異 的 な HBV 吸 着 阻 害 化 合 物 の 探 索 及 び 作 用 の 解 析 を 行 っ た 。 さ ら に 別 の ア プ ロ ー チ と し て 、こ れ ま で 標 的 と さ れ て き た HBV の NTCP へ の 吸 着 過 程 で は な く HBV の 内 在 化 に 着 目 し た 。HBV 内 在 化 機 構 に 関 し て は 、エ ン ド サ イ ト ー シ ス 依 存 的 に 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ る こ と が 知 ら れ る が 、 そ の 詳 細 な メ カ ニ ズ ム は ほ と ん ど 解 明 さ れ て い な い 。 そ こ で 内 在 化 を 阻 害 す る 化 合 物 を 探 索 し 、 こ れ を 用 い て HBV 内 在 化 分 子 機 構 の 解 析 を 試 み た 。

Ⅰ . シ ク ロ ス ポ リ ン 誘 導 体 を 用 い た HBV 吸 着 阻 害 化 合 物 の 探 索 と そ の 作 用 機 序 の 解 析

既 に HBV の 侵 入 阻 害 薬 と し て 報 告 さ れ て い る シ ク ロ ス ポ リ ン A （ CsA ） に 着 目 し 、 そ の 誘 導 体 の 活 性 を 解 析 し た 。 11 種 の シ ク ロ ス ポ リ ン 誘 導 体 の う ち 、 4 種 の 誘 導 体（ SCY806、 SCY446、

SCY450 、 SCY995） は 免 疫 抑 制

活 性 を 完 全 に 欠 失 し て い る が 、 CsA と 同 等 以 上 の HBV の 感 染 阻 害 活 性 を 有 し て い た（ 図 １ ）。こ れ ら の 誘 導 体 は 初 代 ヒ ト 肝 細 胞 へ の HBV 感 染 も 濃 度 依 存 的 に 阻 害 し 、そ の IC

は 0.4 〜 2 µM で あ っ た 。ま た 興 味 深 い こ と に 、 抗 HBV 効 果 を 示 し た 誘 導 体 の う ち SCY995 は 、 NTCP に 直 接 結 合 す る が 胆 汁 酸 の 取 り 込 み を 低 下 さ せ な い こ と が 明 ら か と な っ た（ 図 ２ ）。さ ら に 、こ

0 20 40 60 80 100 120

HBc % c o n tr o l p re S1 p e p ti d e CsA SC Y5 8 2

SC Y8 0 6 SC Y6 6 0 SC Y6 5 1 SC Y1 9 8 SC Y4 4 6 SC Y4 5 3

SC Y4 5 0 SC Y9 9 5 SC Y6 4 0

SC Y5 0 6

**

. CsA HBV

(**P < 0.01)

** ** ** ** **

れ ら の 化 合 物 は 様 々 な 遺 伝 子 型 の HBV や 核 酸 ア ナ ロ グ に 耐 性 を 有 す る HBV の 感 染 も 抑 制 し 、 広 範 な 抗 ウ イ ル ス 活 性 を 有 し て い た 。

次 に 、 [

H] 標 識 胆 汁 酸 を 用 い た カ イ ネ テ ィ ク ス ア ッ セ イ を 行 い 、 得 ら れ た ミ カ

エ リ ス メ ン テ ン プ ロ ッ ト か ら 、 CsA 及 び SCY446 は NTCP の 胆 汁 酸 結 合 ポ ケ ッ ト に 相 互 作 用 す る こ と が 示 唆 さ れ た （ 図 ３ ）。 ま た 、 HBV エ ン ベ ロ ー プ ペ プ チ ド を 用 い た カ イ ネ テ ィ ク ス ア ッ セ イ よ り 、 SCY995 は NTCP の 胆 汁 酸 結 合 ポ ケ ッ ト 外 側 の ウ イ ル ス 吸 着 部 位 に 相 互 作 用 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。

NTCP の 胆 汁 酸 取 り 込 み を 阻 害 せ ず HBV 感 染 を 選 択 的 に 阻 害 す る 化 合 物 は こ の SCY995 が 初 め て

の 例 で あ り 、 こ の 結 果 か ら NTCP の 有 す る ト ラ ン ス ポ ー タ ー 機 能 と ウ イ ル ス 受 容 体 機 能 が 分 離 可 能 で あ る こ と が 示 さ れ た 。

Ⅱ . NTCP の 胆 汁 酸 取 り 込 み 機 能 に 影 響 し な い HBV 特 異 的 侵 入 阻 害 ペ プ チ ド の 探 索

以 上 の 培 養 系 を 用 い た ス ク リ ー ニ ン グ に よ り 、 NTCP を 標 的 と し な が ら 選 択 的 な HBV 侵 入 阻 害 化 合 物 を 得 ら れ る こ と が 示 唆 さ れ た た め 、 よ り ス ル ー プ ッ ト の 高 い in vitro ス ク リ ー ニ ン グ 技 術 で あ る RaPID （ Random

0 20 40 60 80 100 120

control CsA SCY446 SCY995

%

. CsA NTCP

(*P < 0.05)

* *

OH

HO OH

H

CONHCH2CH2SO3H

H H

SCY995 CsA, SCY446

. CsA HBV

HBV

NTCP

OH

HO OH

H

CONHCH2CH2SO3H

H H

Peptide Integrated Discovery） シ ス テ ム を 利 用 し て 、 高 多 様 性 特 殊 環 状 ペ プ チ ド ラ イ ブ ラ リ ー か ら NTCP に 高 い 結 合 親 和 性 を 示 す ペ プ チ ド 候 補 を 見 出 し た 。 さ ら に 得 ら れ た ペ プ チ ド の 中 に 高

頻 度 に 認 め ら れ た 配 列 を NTCP 結 合 モ チ ー フ と 考 え 、 こ の 配 列 を 持 つ フ ォ ー カ ス ド ラ イ ブ ラ リ ー を 用 い て さ ら に ス ク リ ー ニ ン グ を 行 い 、 10 種 の 二 次 ヒ ッ ト ペ プ チ ド を 得 た 。こ れ ら の 中 で も 3 種 の ペ プ チ ド（ WD1、 WL2、 WL4）

は HBV の 感 染 を 強 く 阻 害 し 、 CsA よ り も そ の 活 性 が 高 く 、 IC

は 0.66 〜 2.5 µ M で あ っ た（ 図 ４ ）。さ ら に 、こ れ ら の ペ プ チ ド は 溶 解 最 大 濃 度 に お い て も NTCP の 胆 汁 酸 取 り 込 み を 低 下 さ せ な い こ と が 明 ら か と な っ た （ 図 ５ ）。

ま た 、 こ れ ら の ペ プ チ ド は 様 々 な 遺 伝 子 型 の HBV や 核 酸 ア ナ ロ グ 耐 性 HBV、 ワ ク チ ン 逃 避 HBV の 感 染 も 抑 制 す る こ と か ら 、 よ り 副 作 用 が 少 な い 高 活 性 な 抗 HBV 薬 の シ ー ズ に な り 得 る と 期 待 さ れ る 。

Ⅲ . HBV 内 在 化 阻 害 化 合 物 の 同 定

化 合 物 ス ク リ ー ニ ン グ に よ り 、 PPARγ ア ゴ ニ ス ト で あ る チ ア ゾ リ ジ ン 誘 導 体 ト ロ グ リ タ ゾ ン が 高 い 抗 HBV 活 性 を 持 つ こ と を 見 出 し た 。 さ ら に 7 つ の チ ア ゾ リ ジ ン 誘 導 体 な ど を 用 い て 構 造 活 性 相 関 を 解 析 し た 結 果 、 よ り 強 い 抗 HBV 活 性 を 有 す る シ グ リ タ ゾ ン を 見 出 し た 。 し か し 、 こ れ ら の 化 合 物 が 示 す 抗 ウ イ ル ス 活 性 は 、 PPAR γ ア ゴ ニ ス ト 活 性 非 依 存 的 で あ っ た 。

0 20 40 60 80 100 120

HBs%

. HBV

*

**

*

**

**

**

** **

** **

**

**

**

**

** **

(*P < 0.05, **P < 0.01)

control

WL2

WD1 WL4

CsA

. NTCP

0 20 40 60 80 100 120

control CsA WD1

% (**P < 0.01)

** *

WL2 WL4

ま た 、 こ れ ら は HBV の 侵 入 過 程 に 作 用 す る が 、 こ れ ま で の HBV 侵 入 阻 害 化 合 物 と 異 な り 、 HBV の 細 胞 表 面 へ の 吸 着 は 阻 害 し な か っ た 。 即 ち ト ロ グ リ タ ゾ ン は 、 既 知 の 阻 害 剤 と は 異 な る 機 序 に よ り HBV の 内 在 化 を 顕 著 に 阻 害 す る こ と が 示 唆 さ れ た （ 図 ６ ）。

Ⅳ . ト ロ グ リ タ ゾ ン を 用 い た HBV 内 在 化 機 構 の 解 析

NTCP を 含 む 多 く の SLC ト ラ ン ス ポ ー タ ー は 、そ の 活 性 維 持 や ト ラ フ ィ ッ キ ン グ 制 御 の た め に 二 量 体 ま た は 多 量 体 を 形 成 す る こ と が 知 ら れ る 。 そ こ で NTCP の 多 量 体 形 成 に 着 目 し 、 ト ロ グ リ タ ゾ ン に よ る HBV の 内 在 化 阻 害 メ カ ニ ズ ム を 解 析 し た 。 通 常 状 態 に お い て 一 定 量 の NTCP は 多 量 体 を 形 成 し て い る が 、 ウ イ ル ス エ ン ベ ロ ー プ ペ プ チ ド が 吸 着 す る こ と に よ り 多 量 体 化 が 促 進 す る こ と を 見 出 し た 。 そ し て ト ロ グ リ タ ゾ ン は そ の NTCP の 多 量 体 化 を 阻 害 す る こ と が 明 ら か と な っ た（ 図 ７ ）。ま た 、 NTCP の 多 量 体 化 に 関 わ る タ ン パ ク 質 の 領 域 を 解 析 し 、 そ の 領 域 か ら 成 る ペ プ チ ド を 用 い て 検 討 し た と こ ろ 、 ト ロ グ リ タ ゾ ン 同 様 に HBV 内 在 化 の 阻 害 を 示 し た 。 こ の 結 果 は 、 NTCP の 多 量 体 化 が HBV 内 在 化 に 繋 が る 重 要 な 現 象 で あ る こ と を 示 唆 す る

と と も に 、 こ の 過 程 が 新 た な 創 薬 標 的 に な り 得 る こ と を 示 す も の で あ る 。

0 20 40 60 80 100 120

HBV DNA%

. HBV

**

(**P < 0.01)

control troglitazone

NTCP

( )

HBV

+

. HBV

〜 総 括 〜

本 研 究 で は 、 NTCP に 直 接 作 用 す る が 胆 汁 酸 取 り 込 み 機 能 に は 影 響 し な い 特 異 的 な HBV 感 染 阻 害 化 合 物 と し て 、 シ ク ロ ス ポ リ ン 誘 導 体 SCY995 及 び 特 殊 環 状 ペ プ チ ド WD1 、 WL2 、 WL4 を 初 め て 見 出 し た 。 こ れ ら は 、 環 状 構 造 ペ プ チ ド と し て 生 体 内 で の 安 定 性 が 高 い た め 経 口 投 与 で き る 可 能 性 も あ り 、 臨 床 試 験 中 の HBV 侵 入 阻 害 薬 が 有 す る 問 題 点 を 解 決 で き る 新 規 治 療 薬 候 補 と し て 期 待 さ れ る 。 ま た 、 こ れ ま で に 報 告 の な い 新 た な 作 用 機 序 で あ る HBV 内 在 化 を 阻 害 す る 化 合 物 と し て ト ロ グ リ タ ゾ ン を 見 出 し た 。 こ れ は NTCP 多 量 体 化 及 び HBV 内 在 化 の 過 程 が 創 薬 標 的 に な り 得 る こ と を 初 め て 示 す 知 見 で あ り 、 ト ロ グ リ タ ゾ ン や そ の 誘 導 体 が 抗 HBV 薬 の シ ー ズ と し て だ け で な く 、 今 後 の 研 究 展 開 に お い て 、 未 だ 明 ら か で な い HBV 内 在 化 過 程 の メ カ ニ ズ ム を 解 析 す る 有 用 な プ ロ ー ブ に な る と 考 え ら れ る 。 以 上 の よ う に 、 本 研 究 で は HBV の 侵 入 過 程 を 標 的 と し た 創 薬 研 究 を 行 い 、 そ の ユ ニ ー ク な 成 果 と し て 、 新 た な 特 徴 を 持 つ 複 数 の 候 補 化 合 物 を 得 る こ と が で き た （ 図 ８ ）。 本 研 究 成 果 は 、 現 在 強 く 求 め ら れ て い る B 型 肝 炎 治 療 薬 の 新 た な

開 発 戦 略 に 有 用 で あ る と と も に 、 未 だ 不 明 な 点 を 残 す HBV の 侵 入 メ カ ニ ズ ム を 解 明 す る 上 で 重 要 な 知 見 を 提 供 す る も の で あ る 。

（ 参 考 文 献 ）

1) Shimura S., Watashi K., Fukano K., Peel M., Sluder A., Kawai F., Iwamoto M., Tsukuda S., Takeuchi JS., Miyake T., Sugiyama M., Ogasawara Y., Park SY., Tanaka Y., Kusuhara H., Mizokami M., Sureau C., Wakita T., J Hepatol., 66 , 685-692 (2017).

2) Passioura T., Watashi K., Fukano K., Shimura S., Saso W., Morishita R., Ogasawara Y., Tanaka Y., Mizokami M., Sureau C., Suga H., Wakita T., Cell Chem Biol. , 25, 906-915 (2018).

3) Fukano K., Tsukuda S., Oshima M., Suzuki R., Aizaki H., Ohki M., Park SY., Muramatsu M., Wakita T., Sureau C., Ogasawara Y., Watashi K., Front Microbiol., in press.

NTCP NTCP

NTCP

OH

HO OH

H CONHCH2CH2SO3H

H H

SCY995 WD1, WL2, WL4

HBV

. HBV