博 士 （ 獣 医 学 ） 鈴 木 則 彦
学 位 論 文 題 名
抗 腫 瘍 性 代 謝 拮 抗 剤 trifiuorothymidine の DNA 断 片 化 お よ V
び 複 製 ・ 修 復 機 構 に 及 ぼ す 影 響 学 位 論 文 内 容 の 要 旨
現 在 世 界 中 で 最 も 広 く 使 用 さ れ て い る 制 癌 剤 ，5―Fluorouracil (5FU)の 主な 作 用 機 構 は thymidylate synthase (TS)の 阻 害 と 考 え ら れ て い る ． 新 規 抗 腫 瘍 薬TAS―102は 主 成 分 をtrifluorothymidine (TFT)と し ， そ の 生 体 内 分 解 酵 素 を 阻 害 す るthymidine phosphorylase inhibitorを 配 合 し た 制 癌 剤 で あ る ．TAS―102はTSを 阻 害 す る よ り も ， TFTが ト リ リ ン 酸 体 ま で 代 謝 さ れDNAに 多 く 取 り 込 ま れ る こ と でDNAの 一 本 鎖 切 断 を 弓f き 起 こ す こ と か ら ，TSが 高 発 現 し た5FU耐 性 株 に 対 し て も 強 い 抗 腫 瘍 効 果 を 発 揮 す る と 考 え ら れ て い る ． し か し な が ら ，TFTが ど の 様 にDNAヘ 取 り 込 ま れ ， 取 り 込 ま れ たTFT が ど の 様 に 除 去 さ れ る の か ， そ れ ら の ― 一 連 の 過 程 で 生 じ る と 考 え ら れ るDNAの 断 片 化 に 関 す る 機 序 は 充 分 に は 明 ら か に さ れ て い な い ． 本 学 位 論 文 で は こ の 点 に 焦 点 を 当て ，TFT のDNA断 片 化 お よ び 複 製 ・ 修 復 機 構 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 以 下 の 検 討 を 行 っ た ，
ヌ ー ド マ ウ ス に ヒ ト 大 腸 癌 株 由 来CO−3細 胞 を 移 植 し た 腫 瘍 モ デ ル に 対 し てTAS―102投 与 は ，5FU系 薬 剤 で あ るCapecitabine投 与 と 同 等 あ る い は そ れ 以 上 の 効 カ を 持 っ て 抗 腫 瘍 効 果 を 示 し た ， ま た 腫 瘍 細 胞 のDNAは 両 薬 剤 の 投 与 で 傷 害 を 受 け ， そ の 指 標 で あ るapurinic and apyrimidinicサ イ ト 数 が 増 加 し た ．Capecitabine投 与 で はDNA二 本 鎖 切 断 は 観 察 さ れ な か っ た が ，TASー102投 与 で はDNA二 本 鎖 切 断 が 有 意 に 増 加 し た ． ヒ ト 子 宮 頚 癌 由 来HeLa細 胞 にTFTを 暴 露 す る と ，DNAの 傷 害 に 伴 っ て 誘 導 さ れ る ataxiaーtelangiectasia and Rad3−related proteinの り ン 酸 化 と そ の 下 流 で 細 胞 周 期 を 調 節 す るcheckpoint kinaselの 活 性 化 が 暴 露24時 間 で 観 察 さ れ た ． さ ら に48時 間 目 以 降 で はDNAの 二 本 鎖 切 断 に よ り 活 性 化 す るataxia−telangiectasia mutatedや そ の 下 流 で 相 同 組 み 換 え 修 復 に 関 与 す るbreast cancer susceptibility gene2の り ン 酸 化 が 認 め ら れ た ， 処 理 後72時 間 目 に お け るDNAの 傷 害 の 程 度 は 対 照 の 倍 以 上 と な っ た ．
次 にHeLa細 胞 に 卜 リ チ ウ ム ラ ベ ル し たTFTを 与 えDNAへ の 取 り 込 み 量 を 測 定 し た と こ ろ ，4時 間 で62.2 pmol/106 cellsで あ り ，5FUの 取 り 込 み 量 の 約300倍 で あ っ た ．DNA polymeraseaを 用 い たDNAの 伸 張 反 応 をin vi troで 調 べ た と こ ろ ，TFTの ト リ リ ン 酸 化 体 はdTTPと 同 様 に 鋳 型DNAのadenine (A)に 対 し て 速 度 は 低 下 す る も の の 新 生DNA に 取 り 込 ま れ ， ま たdTTPと の 競 合 阻 害 活 性 は 低 い こ と が 示 さ れ た ． さ ら にTFTを 含 む DNAを1塩 基DNA伸 長 反 応 と り ガ ー ゼ 反 応 を 組 み 合 わ せ て 作 製 し ， こ れ を 鋳 型 と し て も DNA polymerase0に よ るDNAの 伸 張 反 応 が 見 ら れ た ． っ ま り ，TFTは5FUと は 異 な り ， そ の 代 謝 産 物 がDNA polymerasenの 基 質 と な っ て 細 胞 内DNAに 効 率 的 に 取 り 込 ま れ ， 複 製 の 鋳 型 と も な り う る こ と が 明 ら か と な っ た ．
次 にTFTを 含 むDNAを 作 製 し ，DNA除 去 修 復 に 関 わ る 酵 素(DNAグ リ コ シ ラ ー ゼ ） に つ い て そ の 作 用 を 検 討 し た ．5FUを 含 む 二 本 鎖DNAで は 反 対 側 がAあ る い はGuanine (G) で モj uracilーDNA glycosylase や single―stranded selective monofunctional
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uracil―DNA glycosylase1で 切 断 さ れ ， 反 対 側 がGの と き はthymineーDNA glycosylase (TDG)あ る い はmethyl CpG binding domain (MBD4)で の 切 断 が 認 め ら れ た ， し か しTFT を 含 む 二 本 鎖DNAで は 反 対 側 がAの 時 は 何 れ の 酵 素 に よ っ て も 切 断 が 見 ら れ ず ， 反 対 側 がGの 時 は5FLJよ り も 切 断 活 性 は 弱 い も の のTDGお よ びMBD4で 切 断 さ れ た ． こ のTDG 及 びMBD4の 切 断 活 性 が 殺 細 胞 効 果 に 影 響 す る か を 調 ぺ る た めHeLa細 胞 か ら こ れ ら の DNAグ リ コ シ ラ ー ゼ の ノ ッ ク ダ ウ ン 細 胞 を 樹 立 し た と こ ろ ，5FUに デ オ キ シ リ ボ ー ス が 結 合 し た5―fluoro―2 ーdeoxyuridineに よ る 殺 細 胞 効 果 は 明 ら か に 減 弱 し た， 一 方，TFT の 殺 細 胞 効 果 は TDGあ る い はMBD4を ノ ッ ク ダ ウ ン し て も 影 響 さ れ な か っ た ．
以 上 の 結 果 はTFTが5FUと は 異 な り ， 腫 瘍 細 胞 のDNAに 多 く 取 り 込 ま れ ， 取 り 込 ま れ た TFT残 基 は 容 易 に は 除 去 さ れ ず ，TFTを 含 むDNAは 鋳 型 と し て 複 製 さ れ う る こ と を 示 し て お り ， 未 解 明 の 何 ら か の メ カ ニ ズ ム でDNAの 一 本 鎖 お よ び ニ 本 鎖 切 断 を 生 じ る こ と が 考 え ら れ た ．TFTのDNA傷 害 機 構 の 完 全 解 明 は 今 後 の 課 題 で あ る が ，DNAへ の 取 り 込 み と ，DNA修 復 系 に 抵 抗 す る ニ と がTFTの 有 す る 抗 腫 瘍 効 果 の 一 因 で あ る こ と が 示 さ れ ， 従 来 の5FU治 療 な ど に 耐 性 と な っ た 腫 瘍 に 対 し てTFT固 有 の 作 用 機 構 で 効 果 を 発 揮 す る こ と を 示 唆 し て い る ．
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