早稲田大学大学院 先進理工学研究科
博 士 論 文 概 要
論 文 題 目
Lutheran の発現を指標とした
肝幹・前駆細胞の性状解析
Characterization of Liver Stem/Progenitor Cells by the Expression Profile of Lutheran
申 請 者
三浦 泰史
Yasushi MIURA
生命医科学専攻 分子病態医化学研究
2018 年 4 月
肝臓は人体にとって必要不可欠な臓器であり、また再生能の高い臓器としても知られている。肝障 害後の再生は残存する肝細胞が単純に分裂することによってなされる場合が一般的ではあるが、肝細 胞の増殖だけでは克服できないような重篤な肝障害においては、肝幹・前駆細胞（LPC: Liver stem/Progenitor Cells）と呼ばれる未分化性と増殖性の高い細胞が出現し、肝細胞と胆管上皮細胞の 二方向性に分化することで再生に寄与するとされる。この肝臓の組織幹細胞とも言えるLPCの実体は 長い間不明であった。近年世界中で精力的に解明が試みられており、細胞表面マーカー分子の同定を 機にその性状は明らかになりつつある。しかしながら、肝再生過程におけるLPCの制御機構、すなわ ち障害に応答して出現してくる仕組みやその後の性状の変化の行方などに関する制御機構はほとんど 解明されていない。
第1章では、まず第1節から第3節にかけて肝臓の構造、臓器発生の過程を述べた。そして胎児期 の未熟な肝臓および成体の肝臓に存在すると考えられている肝幹・前駆細胞の実体を解析する試みを 歴史的に取り上げ、肝幹・前駆細胞を単離するために同定されてきたマーカー分子についてまとめた。
次に、第4節から第5節では本論文で扱う肝障害・肝再生についてその機序や病態を述べた。これ までに、肝障害時に出現するLPCは必ずしも一様な細胞集団でないことが、様々な肝障害モデルにお ける LPC の組織・解剖学的観察によって示唆されてきた。例えば代表的な LPC 誘導モデルである 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihidro-collidine（DDC） 含 有 餌 投 与 モ デ ル お よ び choline-deficient ethionine-supplemented（CDE）含有餌投与モデルの2つの実験系は、共に重篤な肝障害モデルであ る一方で、出現するLPC の形態や出現領域などが異なるという違いも持っている。DDC投与モデル とCDE 投与モデルでは障害される細胞種や障害領域などが異なることから、LPC が障害の種類に応 じて適した形質へと変化している可能性が考えられる。前述のようにその制御機構については不明で あるが、LPC 応答が生体の恒常性維持機構の一部であるならば、障害の種類によって LPC の性状が 異なるように見える現象には肝再生という観点から意義がある可能性が高い。ところが、細胞表面マ ーカーという視点から明確にLPCの違いを示した報告はなく、形態や分化能を含めたLPCの制御機 構という意味においても分子レベルでの解析の余地を残している。従って今後のLPC研究・肝再生研 究の発展のためには、LPCの性状や細胞運命の違いに着目した戦略が必要となる。そしてそのような 戦略を立てる上で、異なる性質を持ったLPCをそれぞれ分画化することのできる有用な細胞マーカー を同定することが重要な意味を持つことを述べた。
次に、第6節から第7節にかけて本論文で扱う重要なタンパク質であるLutheran（Lu）、Integrin β1
（ITGB1）、Laminin α5（Lama5）などの分子について、本論文で注目するはたらきを中心に述べた。
簡潔に述べると、Lama5 とITGB1は共局在しているとき恒常的に相互作用しており、それによって ITGB1は細胞-ECM接着を担うほか、結果として生じる ITGB1シグナルは細胞の形態、運動能、管 腔形成能と関わりが深いとされている。しかしLuはITGB1と同様にLama5をリガンドとして結合 する能力を有することから、Luが高発現する場合は競合的阻害のかたちでITGB1の細胞接着機能や シグナル伝達機能を阻害することが可能であるということを述べた。
第8節では研究の目的とそのために採る手法について述べた。本研究はLPCの新規マーカー分子の 探索を通じ、これまで不明であった異なる肝障害によって出現するLPCの異同を明確化することを主 な目的として行われるものである。それとともに、本研究では新規LPCマーカーを従来のLPCマー カーと組み合わせて LPC をより厳密に定義することを目指し、LPC におけるマーカー分子の機能解 析によってLPCの制御機構の解明に貢献することを目的とする。新規LPCマーカーを探索する戦略 として、胎児期肝幹・前駆細胞である肝芽細胞と成体肝幹・前駆細胞であるLPCの機能的類似に着目 した。すなわち、肝細胞・胆管細胞を生み出す元となる細胞である肝芽細胞とLPCはその性質として 非常に類似点が多く、従ってそれらの細胞で働いている重要なタンパク質もまた類似している可能性 が高い。そこで既に肝芽細胞マーカーとして同定していたLuの各肝障害モデルにおける発現を免疫組 織化学的手法により検証した。Lu の発現が LPCで確認されたため、マウス障害肝から Lu発現量の 異なるLPCを実際にセルソーターで単離し、LPC株の樹立を行った。樹立したLPC株に対して遺伝 子操作によるLu強制発現を行い、その性状の変化について検証した。さらに、in vivoの実験系を確 立するために、Luノックアウトマウス（Lu KO）をCRISPR-Cas9技術によって作製したことを述べ た。
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第2章では、実験材料と実験手順について具体的に述べた。
第3章では、実際に得られたデータを記載し、各実験の動機や得られた結果の特徴について述べた。
第1節ではCDE投与モデルとDDC投与モデルの間のLPC応答の違いを調べるために、典型的なLPC マーカーのひとつであるEpithelial Cell Adhesion Molecule（EpCAM）の免疫組織化学染色を行った。
DDC 3週間投与マウスの肝臓ではLPCが明瞭な管腔構造をなして門脈域で増生しているのに対して、
CDE 3 週間投与マウスの肝臓では細管様のLPC が門脈から離れた領域へと進入している様子が確認
された。この2つの異なるモデルで肝芽細胞マーカーであるLuを免疫染色およびフローサイトメトリ ー解析によって発現解析すると、DDC投与モデルにおける「管腔形成能の高いLPC」ではLuの発現 量が低いのに対して、CDE投与モデルにおける「遊走・浸潤能の高いLPC」ではLuの発現量が高い ことが分かった。
第2節では、組織学的なLPCの運動能や管腔形成能の違いはLuの発現量の違いにより規定される という仮説を立てた。これを検証するために、Luの発現量が異なる LPCの単離培養を試みた。セル ソーターを用いて障害肝のEpCAM陽性細胞のうちLu高発現細胞集団とLu低発現細胞集団をそれぞ れ単離した。以下、これらの培養細胞をそれぞれCELP、CELNと呼んだ。2つの細胞株の間には細胞 形態に差があることが明視野下で確認され、CELPでは不定形な細胞や仮足を持つ細胞が多く移動能を 備えることが予想される形態をとるのに対して、CELN では比較的整った丸い細胞が多数を占めた。
CELPではアクチンファイバーと仮足が確認できるのに対して、CELNでは細胞辺縁部でのアクチン集 積が特徴的であった。こうしたことからCELN とCELPの間には細胞の移動・遊走能に関して違いが あることが予想された。
第3節では、CELPとCELNの運動・遊走能をスクラッチアッセイによって評価した。あらかじめ 細胞の増殖を停止させたうえで、細胞をスクラッチした直後から観察していくと、明視野下で明らか にCELP の移動が CELN より顕著であることが確認できた。以上のことから 2 次元培養系において LPCの運動能の違いがLuの発現を指標として区別できることが分かった。組織学的な観察からはLu の発現の違いが運動能の他に管腔形成能にも関わることが予想できることから、次に管腔形成能を検 証するためのアッセイ系が必要となった。そこで第4節では引き続いて3次元培養系におけるLPCの 性状の違いを検証することとした。一般に、管腔構造をなす細胞は3次元培養することで内腔構造（シ スト）を形成する性質を持つことが知られている。3 次元培養の結果、CELN では顕著なシスト形成 が観察されたのに対して、CELP ではシストを形成する様子はほとんど見られず、凝集塊のみが観察 された。以上のことから3次元培養系においても、やはりLuの発現を指標としてLPCの性状の違い を区別できることが分かった。こうした一連の結果を踏まえると、LPCの性状は Lu によって制御さ れている可能性が十分に考えられた。
第5 節ではLPCの性状が Luによって制御されている可能性を検証するため、Luの発現が低い細 胞株であるCELNに対してLuを強制発現させた安定株CELN-Luを樹立した。また、コントロール としてGFPを強制発現させた安定株CELN-GFPを同時に樹立した。その結果、2次元培養における 細胞形態として CELN-GFP は親株である CELN と同様に丸く整った細胞形態をとるのに対して CELN-LuはCELPに類似した不定形の紡錘型細胞形態をとることが分かった。
第6節では、LuがLPCにおいて果たす機能についてLama5とITGB1に着目して解析した。CELP やCELN-Luの細胞膜にLuが存在することを考慮すると、これらの細胞ではLama5とITGB1の接 着を Luが競合的に阻害することによって ITGB1 の機能が減弱していることが考えられる。Luによ るLPCの機能制御がこのようなITGB1とLama5を介したものであるならば、ITGB1の機能を阻害 することによりCELNの性質がCELP様に変化することが予想される。これを検証するために、ITGB1 の中和抗体を用いた機能阻害がCELNにどのような影響を及ぼすかを2次元培養および3次元培養の 系で実験を行った。まず運動能に関して検証するためにCELNのスクラッチアッセイに ITGB1中和 抗体を投与する実験を行うと、中和抗体が添加されていない群に対して中和抗体を添加した群では運 動能の亢進が見られた。同様の抗体添加をCELNの3次元培養においても行うと、中和抗体が添加さ れていない群ではシスト構造が多数観察されるのに対して中和抗体を添加した群ではシスト構造が殆 ど見られず、そのかわりに細胞の凝集塊が観察された。以上のことから、ITGB1の機能阻害によって Lu の強制発現を行ったときと同様にCELN の運動能亢進および管腔形成能の減弱が起き、CELP様
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の細胞の性質が獲得されたことがわかった。従って、LuはITGB1の機能調節を介してLPCの性状を 制御している可能性が強く示唆された。
第7節では、第6節の結果を解釈する上で必要なLama5の発現を確認した。蛍光免疫組織化学染色 によってLaminin 511の構成分子であるLama5の発現をCDE投与モデルとDDC投与モデルの肝臓 で調べると、どちらの肝障害モデルにおいてもEpCAM陽性LPCの周囲に常にLama5が存在するこ とが分かった。また、それぞれの障害肝から EpCAM陽性細胞をセルソーティングしてその発現を解 析するとどちらのサンプルでもLama5のmRNAの存在が確かめられ、どちらの肝障害モデルにおい てもLPCでのLama5発現は一定レベルで確認でき、Lama5はLPC自体が産生していることが明ら かとなった。この結果により、Lu が新規の機能性 LPC マーカーであり、その働きが ITGB1 および
Lama5を介して発揮されている可能性が強く示唆された。
第8節では、Lu KOを作成し、重篤な肝障害モデルに供した際にLPCの性状に違いが現れるかど うかを検証した。野生型マウスおよびLu KOマウスをCDE 3週間投与モデルもしくはDDC3週間投 与モデルに供し、EpCAMの蛍光免疫組織化学染色を行った。第2章に記述の方法でLPCがどの程度 門脈から離れた位置へ到達したかを定量した。野生型マウスではCDE 3週間投与によってLPCの広 がりが確認できる一方で、Lu KOマウスではその広がりが著しく小さい様子が観察された。DDC3週 間投与モデルでは、野生型マウスと Lu ノックアウトマウスの間にあまり違いは見られなかったが、
Lu KOマウスの方で偽胆管構造の僅かな肥厚が観察された。この結果から、Luが生体内でLPCの性 状を実際に制御可能であることを確認した。
第4章では、第3章で得られた結果を解釈し、既報と組み合わせることで、肝再生におけるLPCの 制御という観点からLuが果たす役割について結論を導くことを試みた。
第1節から第4節ではLPCにおけるLuの発現調節について推察を行った。まず既知のプロモータ ー配列であるGATA1-binding siteやCACC-binding siteとの関連性が報告されているKLFファミリ ーに着目して考察した。胎児期の肝臓発生に重要な因子として KLF6が報告されており、肝芽細胞に Luが発現していることを考えるとKLF6はLuの発現を正に調節する可能性が考えられた。いっぽう で成体肝臓における KLF の役割は成熟した肝細胞などでは報告があるものの、LPC における役割に ついては殆どわかっておらず、KLFとLuの関係を推察することは現状で困難であると結論づけた。
次に、CDEモデルと DDCモデルで何が異なっているのかという点に立ち戻ってLuの発現量調節に ついて考察した。CDEモデルとDDCモデルで起きる細胞死の様式が異なること、また細胞死の様式 が異なるとき、細胞の死に際して放出・提示される分子（DAMPs: Damage-associated molecular patterns）のパターンもまた異なっていることを既報から示した。LPCにはDAMPsを認識可能な受 容体が発現していることや、DAMPsの受け取り手として代表的なマクロファージがLPCに対して及 ぼす影響などから、DAMPsがLPCに直接・間接の影響を与えて Luの発現量を調節している可能性 を示した。
第5節ではITGB1の細胞接着機能やITGB1の下流シグナルに着目して、LuによるLPCの形態・
運動能・管腔形成能の制御について観察された現象の説明を試みた。Focal adhesion kinase、p130 Crk-associated substrate proteinなどの ITGB1 シグナル関連分子に着目し、Lu の発現量の違いが LPCの形態・運動能・管腔形成能の違いとして現れうることを結論づけた。
第6節では今後の展望としてLuによるLPCの細胞運命への影響の可能性と医学応用の可能性につ いて述べ、本論を締めくくった。
新たなLPCマーカーとして世界的にも前例のない発現様式を示すLuの同定と機能解析は、細胞機 能の観点からLPCの制御機構とその意義についてより理解を深め、ひいては肝疾患の治療に資する研 究の足がかりとなる重要な成果であると考えられる。
No. 3
Ｎｏ.1
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
氏 名 三浦 泰史 印
（2018年 9月 現在）
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
論文
学会発表
1. ○Miura Y, Matsui S, Miyata N, Harada K, Kikkawa Y, Ohmuraya M, Araki K, Tsurusaki S, Okochi H, Goda N, Miyajima A Tanaka M. Differential expression of Lutheran/BCAM regulates biliary tissue remodeling in ductular reaction during liver regeneration. Elife 2018 Aug 7; 7:e36572
2. Yagai T, Matsui S, Harada K, Inagaki FF, Saijou E, Miura Y, Nakanuma Y, Miyajima A, Tanaka M. “Expression and localization of sterile alpha motif domain containing 5 is associated with cell type and malignancy of biliary tree.”
PLoS One. 2017 Apr 7;12(4):e0175355
3. Kido T, Koui Y, Suzuki K, Kobayashi A, Miura Y, Chern EY, Tanaka M, Miyajima A. “CPM Is a Useful Cell Surface Marker to Isolate Expandable Bi-Potential Liver Progenitor Cells Derived from Human iPS Cells.”Stem Cell Reports. 2015 Oct 13;5(4):508-15.
1. 三浦泰史, 田中稔, 吉川大和, 合田亘人, 宮島篤. Lutheran の発現を指標とした肝 幹/前駆細胞の性状解析. 第 21 回肝細胞研究会,(P-05). 東京医科歯科大学, 東京.
June 2014.
2. 三浦泰史, 田中稔, 吉川大和, 合田亘人, 宮島篤. Lutheran の発現を指標とした肝 幹/前駆細胞の性状解析. 第 37 回分子生物学会,(2P-0623). パシフィコ横浜, 神奈 川. November 2014.
3. Miura Y, Tanaka M, Kikkawa Y, Goda N, Miyajima A. Characterization of Liver Stem/Progenitor Cells by the Expression Profile of Lutheran. 第 13 回幹細胞 シンポジウム, (P-3). 伊藤国際学術研究センター, 東京. May 2015.
4. 三浦泰史, 田中稔, 吉川大和, 合田亘人, 宮島篤. Lutheran の発現を指標とした肝 幹/前駆細胞の性状解析. 第22 回肝細胞研究会,(P-1). 米子コンベンションセンタ ー, 鳥取. June 2015.
5. 三浦泰史, 田中稔, 吉川大和, 合田亘人, 宮島篤. Lutheranは肝幹/前駆細胞の性状を制 御する機能性マーカー分子である. 第38回日本分子生物学会年会、第88回
日本生化学会大会 合同大会,神戸ポートアイランド, 神戸．December 2015.
Ｎｏ.2
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
学会発表 (続き)
6. 三浦泰史, 吉川大和, 合田亘人, 宮島篤, 田中稔. Lutheranは肝幹/前駆細胞の Heterogeneityを規定する機能性マーカーである. 第23回 肝細胞研究会,大阪 大学中之島センター, 大阪. July 2016.
7. 三浦泰史, 吉川大和, 合田亘人, 宮島篤, 田中稔. Lutheran は肝障害時の EpCAM 陽性 細胞の性状を制御する機能性マーカーである. 第89回 日本生化学会大会, 仙台国 際センター 東北大学 川内北キャンパス, 宮城. September 2016.
