C（PKC）の選択的阻害剤として, Streptomyces sp.

第 1 章 緒論

UCN-01（7-hydroxy-staurosporine, Fig. 1）は, Ca

⁺⁺及びリン脂質依存性プロテイ ンキナーゼ

C（PKC）の選択的阻害剤として, Streptomyces sp.

培養液から単離精製 された現在臨床試験中の抗癌剤である ^1-3)

. UCN-01

の抗腫瘍効果を示す作用機序と しては

PKC

阻害だけでなく, ヒト癌細胞においてサイクリン依存性キナーゼ（Cdk）

を阻害することにより, その細胞周期を

G1

期に集積させる細胞周期特異的な作用 やアポトーシス誘導作用があることが明らかにされている  ^4-6)

. さらに , UCN-01

は

in vitro

及び

in vivo

において, マイトマイシン

C, シスプラチン及び 5-フルオロ

ウラシル等のいくつかの重要な既存の化学療法剤の抗癌効果を増強し, 他の抗癌剤 との併用効果も期待されている ^7-9)

.

H N

N N

O H

H CO

3

NHCH

₃

HO O

H

3

C 7

Fig. 1 Chemical structure of UCN-01

非常に興味深いことに, この UCN-01 は Phase II臨床試験において, 癌患者に

72

時間定速静脈内投与を行ったところ

, 動物実験の結果からは予想も出来ない異常な

体内動態を示した. 動物実験における, 分布容積（Vdss）, 全身クリアランス（CLtot） 及び消失半減期（t_1/2）はそれぞれ, 6000~17000 mL/kg, 

600~4000 mL/h/kg

及び

3~12 h

という値を示した. 一方, 癌患者における

Vd

_ss及び

CL

_totはそれぞれ

79.6~158 mL /kg,

0.0407~0.102  mL/h/kg

と非常に小さな分布容積及び全身クリアランスを示した

. さ

らに, 消失半減期は

253~1660  h

と動物実験に比べて約 130 倍もの長い消失半減期 が観察された¹⁰⁾

.

このような癌患者における異常な動態特性の一因として

, 極めて高い血清蛋白質

との結合性が挙げられている. 事実, 本薬物はヒトα1

-酸性糖蛋白質（hAGP）に対

し

10

⁸

M

^-1という結合定数が報告されている ¹⁰⁾

. この値は, 血清蛋白質に対する薬

物の結合定数としては異常とも言えるほど大きい

. 例えば , ステロイドホルモン

や塩基性薬物は hAGP に強く結合することが知られているが, その結合定数は高々

10

⁵

~10

⁶

M

^-1程度である¹¹⁾

. 加えて, 多くのリガンドが結合するヒト血清アルブミン

（HSA）についても, ビリルビン-HSA複合体の結合定数は

10

⁶

~10

⁷

M

^-1である¹²⁾

. 従

って, 現在までのところ, UCN-01 と

hAGP

の複合体の結合定数は, 血清蛋白質- リガンド複合体の中で最大と言える. しかしながら, UCN-01が

hAGP

に対してな ぜこのような異常とも言える結合定数を示すのかについては全く不明である

. また Fuse

等の研究から, 本薬物は動物種

AGP

に対しては

hAGP

のように強く結合しな いことが明らかにされている¹⁰⁾

.

hAGP

は, 183個のアミノ酸残基と

5

本の糖鎖からなる分子量約

44 kDa

の血清糖 蛋白質である¹³⁾ （Fig. 2）. この蛋白質の糖鎖含量は分子量の約

45%と他の糖蛋白

質のなかでも極めて高いため, X 線結晶構造解析や

NMR

解析等による立体構造の 解明はなされていない.

N

C

164

183

54 15 38

5

85 75

72 147

Fig. 2 Structure model of hAGP

Predicted positions of secondary structure were determined from the calculation of the primary structure accoding to Chou and Fasman´s.

●:glycan, ■:-S-S-bond, ○:herical, △:ß-sheet

しかしながら, 円二色性（CD）スペクトルや分子モデルの設計によるデータか ら, 水溶液中では

ß

シート構造に富んでいることが報告されている ^{14, 15)}

（Table 1）.

Table 1 Estimation of the secondary structure in hAGP

α -helix ß-structure

Contents (%) 20 60

さらに, hAGPには

2

つの異なる遺伝子（hAGP-A 及び

hAGP-B/B´）産物, F1*S

及び

A

体が約

2:1

の割合で存在し, アミノ酸配列が

22

残基異なる^16-18)（Fig. 3）

.  hAGP

の生体内での役割については十分に理解されていないが, in vivoの炎症モデルを用 いた実験により, 抗炎症作用や免疫抑制作用などが認められている^{19, 20)}

. 加えて, 血

中における

hAGP

濃度は約 20 µM であるが, 感染, 炎症及び癌などの疾患時に

5~10

倍に上昇することが知られている^{21, 22)}

.

YVGGQEHFAH LLILRDTKTY MLAFDVNDEK

PETTKEQLGE FYEALDCLRI PKSDVVYTDW

QHEKERKQEE

GES

10 20 30 40

50 60 70 80

90 100 110 120

130 140 150 160

170 180

QIPLCANLVP QIPLCANLVP

VPITNATLDQ VPITNATLDR

ITGKWFYIAS ITGKWFYIAS

AFRNEEYNKS AFRNEEYNKS VQEIQATFFY

VQEIQATFFY

FTPNKTEDTI FTPNKTEDTI

FLREYQTRQD FLREYQTRQN

QCIYNTTYLN QCFYNSSYLN VQRENGTISR

VQRENGTVSR YEGGREHVAH NLELRDTKTL MFGSYLDDEK

NWGLSVYADK

NWGLSFYADK PETTKEQLGE FYEALDCLCI PRSDVMYTDW

KKDKCEPLEK

KKDKCEPLEK QHEKERKQEE

GES F1*S

A

Fig. 3 Amino acid sequence of hAGP variants

Differences in the amino acid sequence between the F1*S and A variant are underlined.

血中において上昇した

hAGP

は多くの薬物と結合して, それらの分布や薬理効果 に影響を与えることが知られている. 例えば, hAGP を過剰発現させた

transgenic

mice

において, HIVプロテアーゼ阻害薬として知られているサキナビルのクリアラ ンス及び分布容積は, control miceに比べて有意な低下が観察され, その結果

AUC

の増大が起こる ²³⁾

. さらに, 白血病患者において, hAGP

濃度とチロシンキナー ゼ阻害剤であるイマチニブの血清中濃度は正の相関を示し

, クリンダマイシン併用

により蛋白結合の競合が生じた結果, イマチニブの

AUC

の増大が起こる ²⁴⁾

. 加え

て, hAGP の血清中濃度は乳癌, 肺癌及び卵巣癌患者において

, 健常人に比べて

有意な増加が観察され, hAGP のバリアント

F1*S

及び

A

体のそれぞれの発現量が

増加する ²⁵⁾

. これらのことより, hAGP

は明らかに薬物の体内動態において重要な

役割を果たしている.

hAGP

分子上の薬物結合部位の研究は, これまで, 蛍光法, 平衡透析法, CDス ペクトル法及び限外濾過法やアミノ酸残基を直接修飾する化学修飾法を用いて盛ん に行われてきた^26-30)

. X

線結晶構造解析はリガンド-蛋白質間の相互作用様式を解析 する方法として非常に有用な方法であるが ^31-33)

, hAGP

の

X

線結晶構造解析はなさ れていない. そのためリガンド-hAGP の相互作用の詳細を検討するには

, より強

力な解析法が必要となる

. これを行う方法として , 光アフィニティラベル法や部

位特異的変異法が挙げられる

. 光アフィニティラベル法は , 特異的化学修飾法の

代表であり, 光照射によりニトレン

, カルベンと言った非常に反応性の高い化学

的活性種を発生させて, これを結合部位近傍にラベルする方法である³⁴⁾（Fig. 4）.

hv

Protein

Photoreactive group

Ligand

Covalent bond

Fig. 4 Photoaffinity labeling techniques

 一方, 部位特異的変異法は広く用いられている手法であり

, 蛋白質分子上のア

ミノ酸を他の異なるアミノ酸に置換し, 蛋白質の機能変化を見ることで薬物結合部 位を同定するもので, アミノ酸レベルで結合部位の同定ができるという点で非常に 優れている^{35, 36)}

.

 このような背景の下, 本研究では様々な解析法を駆使して, hAGP に対して異常 な結合性を示す

UCN-01

の結合部位の同定を試みた. まず第

2

章において, 

UCN-01

の誘導体である

UCN-02

及び

Staurosporine

を用いて, hAGP に対する結合性を検討

した. さらに, hAGP のリガンド結合に重要な役割を果たすと考えられているアミ ノ酸残基を化学修飾し, これらの修飾

hAGP

に対する

UCN-01

の結合性を検討した.

第

3

章では, [³

H]UCN-01

を光ラベル化剤として光アフィニティラベル法を用いて 検討を行った. さらに

, 光アフィニティラベル法により同定したアミノ酸残基を

部位特異的変異法により置換させた変異

hAGP

を作成し, UCN-01 の結合に関与す るアミノ酸残基の同定を行った

. 最後に, 化学修飾法 , 光アフィニティラベル法

及び部位特異的変異法の結果をもとに, hAGP の立体構造モデルを用いて

UCN-01

とのドッキングシュミレーションを行い

, 結合部位を同定した . 以下に得られた

知見を詳述する.

第 2 章 ヒト

₁

-酸性糖蛋白質（ hAGP）と  UCN-01 及びその誘導体     の相互作用

第

1

節 序

 UCN-01 は, ヒト血清蛋白質の中で

hAGP

に対してのみ非常に強く結合すること が知られている. そこで本章では, UCN-01 の C-7位の置換基が異なった

UCN-02

及び

Staurosporine

を用いて, hAGP に対する結合性を検討した. さらに, UCN-01

がどのような相互作用様式に基づいて

hAGP

に強固に結合しているかを明らかにす るために, UCN-01 と hAGP の結合に及ぼす塩濃度, 脂肪酸添加及び

pH

の影響を 調べ, 結合様式について検討した

. 最後に , hAGP

のリガンド結合に重要な役割 を果たすと考えられているアミノ酸残基を化学修飾し, これらの修飾

hAGP

に対す

る

UCN-01

の結合性を調べ, 結合部位の同定を試みた.

第

2

節 

hAGP

に対する

UCN-01

及びその誘導体の結合特性

2-1 UCN-01, UCN-02

及び

Staurosporine

の

hAGP

に対する結合性評価

Staurosporine

は UCN-01 の C-7位の水酸基が脱離した化合物であり, 

UCN-02

は, こ の水酸基がα-配置した

UCN-01

の立体異性体である（Fig. 5）. UCN-01, UCN-02 及び

Staurosporine

は, PKC及び

protein kinase A（PKA）の阻害効果が異なっており,

PKC

に対する

IC

₅₀はそれぞれ

0.0041, 0.062

及び

0.0027

となり, PKA に対するそ れは

0.042, 0.25

及び

0.082

という値を示す ³⁷⁾

. そこで UCN-01, UCN-02

及び

Staurosporine

の

hAGP

に対する結合定数（Ka）を算出した（Table 2）. UCN-01の

Ka

は

288 ± 75 × 10

⁶

M

^-1と

3

つの誘導体のなかで最大となり, この値は

Fuse

等の報 告と一致している¹⁰⁾

. 

一方, C-7 位の水酸基の脱離した

Staurosporine

の

Ka

は

UCN-01

のそれと比べて

1/25, C-7

位の水酸基がα-配置した

UCN-02

では

1/200

に低下し, 3 つの誘導体のなかで最小の値となった. UCN-01 と

PKD1

（3-phosphoinositide-dependent

protein kinase 1）の X 線結晶構造解析の結果, UCN-01

の C-7 位の水酸基は, PKD1 の薬理効果に重要な役割を果たしているグルタミン（Gln）220 残基と水素結合して いることが明らかになっている. また, UCN-01 と

Chk1（checkpoint kinase 1）の

X 線結晶構造解析の結果, UCN-01 の C-7 位の水酸基は, Chk1 の

ATP（adenosine

triphosphate）結合部位においてセリン（Ser）147

残基と水素結合が観察されている

38)

. UCN-01

の C-7 位の水酸基と

PKD1

及び

Chk1

との水素結合は C-7 位の水酸基の 脱離した Staurosporine では観察されておらず, この水素結合が

PKD1

及び

Chk1

の 阻害効果において重要な役割を演じていることが明らかにされている. このように,

UCN-01

の C-7 位の置換基はその薬理効果において重要な役割を演じており, 本研

究で行った

UCN-01

の

hAGP

に対する結合においても重要性が示唆された. 興味深 いことに, UCN-01 の C-7 位の置換基が

α -配置することにより, UCN-02

において

は

1/200

もの結合定数の低下が観察され, UCN-01 の

hAGP

に対する特異的な結合

には C-7 位の置換基に加えてその配向性が重要な役割を演じていることが明らかに なった.

H N

N N

O

H

H CO

3

NHCH

₃

R O

H

₃

C 7

R = OH (ß) : UCN-01 OH (α) : UCN-02

=

H : Staurosporine

=

Table 2 Binding parameters of UCN-01, UCN-02 and Staurosporine to hAGP at pH 7.4

Ligands

Ka (× 10

⁶

M

^-1

) n

UCN-01 UCN-02 Staurosporine

288 ± 75 1.48 ± 0.11 11.33 ± 5.74 0.92 ± 0.04 0.93 ± 0.06 0.91 ± 0.11 All values are mean ± S.D. (n=3).

n:number of binding sites

2-2 UCN-01

と

hAGP

の結合における

NaCl

の影響

 一般に, 蛋白質と薬物の結合には静電的及び疎水性相互作用が複雑に関与してい ると言われている ^39-41)

. これらの相互作用の関与を明らかにする手段としては,

 塩 効果, pH の影響, リガンド結合定数, 熱力学的検討及び構造活性相関などによる 解析が知られている. 静電的相互作用の関与を確認する最も簡便な方法の

1

つとし て, イオン強度を変化させて結合性を調べることが知られている

. そこで, 最初

に, NaCl 濃度を

0

から

1000 mM

まで変化させ, UCN-01の

hAGP

に対する結合性 の変化について検討した. Fig. 6に示すように, NaCl濃度を変化させたところ, 変 化の程度は小さいものの, NaCl濃度依存的に結合性の低下が観察された.

0 150 500 1000

0 50 100

Bound (%)

NaCl (mM)

* *

Fig. 6 Effect of NaCl on binding of UCN-01 to hAGP at pH 7.4

The concentrations are:[UCN-01]=[hAGP]=20 µM. Each point represents the mean±S.D.(n=3). *Statistically significant compared with no NaCl; p<0.01.

なお, 本実験条件下では

NaCl

添加により, hAGP 構造の有意な変化は観察され なかった（Fig. 7）.

200 210 220 230 240 250

0 mM NaCl 150 mM NaCl 500 mM NaCl 1000 mM NaCl

[ θ ] × 10

-3

( deg ・ cm

2

dmol

-1

) 0

-10 10

Wavelength (nm)

Fig. 7 Far-UV CD spectra of hAGP in the presence of NaCl (0~1000 mM) The concentration is:[hAGP]=10 µM.

これらの結果は, NaCl が

hAGP

の立体構造を変化させた結果, UCN-01 結合を 低下させるのではなく, むしろ, 小さいながら hAGPに対する

UCN-01

結合を阻害 していることを示唆している. すなわち, UCN-01と hAGPとの結合には, その程 度の大きさは明らかでないものの, 静電的相互作用が関与していることが推察され る.

2-3 UCN-01と

hAGP

の結合における脂肪酸の影響

次いで, 疎水性相互作用の関与を評価するため, 炭素数

12

の脂肪酸であるラウ リン酸を添加して結合率の測定を行った. ラウリン酸濃度は

0 µM

から

100 µM

ま で変化させた.  Fig. 8 に示すように, ラウリン酸添加によって, UCN-01 の結合 は有意に低下した.

0 20 60 100 0

50 100

Bound (%)

Lauric acid (µM)

* *

*

Fig. 8 Effect of lauric acid on binding of UCN-01 to hAGP at pH 7.4

The concentrations are:[UCN-01]=[hAGP]=20 µM. Each point represents the mean±S.D.(n=3). *Statistically significant compared with no lauric acid; p<0.01.

 脂肪酸添加は, しばしば

HSA

の立体構造を変化させ, ひいてはリガンド結合性 に影響を及ぼすことが知られている ⁴²⁾

. しかしながら, このような場合 , 結合性

を低下させるよりむしろ結合性を増加させる ⁴³⁾

. 従って, ここで観察された脂肪

酸添加によるリガンド結合性の低下は, リガンドと脂肪酸との置換現象に基づくも のと考えられる. すなわち, これらの現象は

hAGP

分子上での

UCN-01

と脂肪酸と の置換反応で説明できるかもしれない. 事実, 脂肪酸濃度依存的に

UCN-01

結合が 減少することは, この考えを支持しているものと思われる.

 以上の結果より, UCN-01 と

hAGP

の結合には疎水性相互作用が関与しているこ とが示唆された.

2-4 UCN-01

と

hAGP

の結合における

pH

の影響

 ところで, 薬物と

HSA

や

hAGP

との相互作用は, pHに影響を受けることが知ら

れている^44-46)

. これらの変化は, リガンドと蛋白質の解離に伴う相互作用の変化, あ

るいは蛋白質の立体構造変化に伴うものと説明されている. そこで, pH 6 から

8

における

UCN-01

と

hAGP

の結合性について検討を行った.

Bound (%)

pH

*

*

*

6 7 7.4 8

0 50 100

Fig. 9 Effect of pH on the binding of UCN-01 to hAGP

Concentrations are:[UCN-01]=[hAGP]=20 µM. Each point represents the mean ± S.D. (n=3). *Statistically significant compared with pH 7.4; p<0.01.

 その結果, Fig. 9 のように, UCN-01 結合性は

pH

上昇に伴って増大し, pH 7.4 において最大であった. UCN-01 の構造と

hAGP

の等電点（pI=2.7）から考え合わ せて, pH 7.4 での最大結合率はゲスト-ホスト間の解離現象が程よく絡み合って疎 水性相互作用と静電的相互作用が強化されたものと考えられる

. ところで, hAGP

はこれらの

pH

領域で立体構造変化を惹起することが考えられる

. そこで, hAGP

自身の遠・近紫外領域における

CD

スペクトルの

pH

プロファイルを作成した. 二 次構造においてはいずれの

pH

においても有意な構造変化は観察されなかったが

（data not shown）, 三次構造において

pH

上昇に伴うコットン効果の増加が観察さ れた（Fig. 10）

. 

これらの

CD

スペクトル変化は次のように説明される. すなわち, 

hAGP

は酸性領域では立体構造が緩み

, 塩基性領域では堅固になると考えられる . 従っ

て, pH上昇に伴う

UCN-01

結合の変化は, pH依存的な

hAGP

コンフォメーション 変化もその一因と考えられる.

[ θ ] × 10

-3

( deg ・ cm

2

dmol

-1

) 70

0 -20

250 270 290 310 330 350

pH 8 pH 7.4 pH 7 pH 6

Wavelength (nm)

Fig. 10 Near-UV CD spectra of hAGP at various pHs The concentration is:[hAGP]=10 µM.

第

3

節 

UCN-01

と

hAGP

の結合におけるシアル酸及びアミノ酸残基の役割

3-1 UCN-01

と

hAGP

の結合におけるシアル酸の役割

 hAGPはその分子内の

5

つのアスパラギン（Asn）残基に枝分かれ構造を有する糖 鎖が結合しており, 血清蛋白質のなかでも最も糖化されている蛋白質の

1

つである

13)（Fig.  11）. いずれの糖鎖末端にも, 負に帯電したシアル酸が多く存在している ため, 最も小さな

pI

値をもつ血清蛋白質でもある.

Sia

Sia

Gal

Gal

GlcNAC

GlcNAC

Man

Man

Man GlcNAC GlcNAC Asn

Sialidase

Asialo-hAGP hAGP

Fuc

Fig. 11 Oligosaccharide structure of asialo-hAGP and hAGP

Sia:sialic acid, Gal:garactose, GlcNAc:N-acetylglucosamine, Man:mannose, Fuc:fucose

一般に蛋白質の糖鎖は

, それ自身水溶性を高めるのみならず , 多様な生理シス

テムにおける分子認識や蛋白質のコンフォメーションの安定性に寄与していること が明らかにされている

.

薬物が結合する蛋白質の部位は

, 多くのアミノ酸からな

るペプチド部分と言われている. しかしながら, UCN-01 は

hAGP

に対し

10

⁸

M

^-1 という非常に高い結合定数を示すため, 蛋白質のペプチド以外の部分に結合する可 能性も考えられる. そこで, hAGP からシアル酸を除いたアシアロ

hAGP

に対する

UCN-01

の結合性を検討した結果, Table 3に示すように, hAGP とアシアロ

hAGP

との間には

UCN-01

の結合に有意な差異は認められなかった. プロプラノロールの

hAGP

に対する結合率は

, シアルを除去することによりわずかに減少することが知

られているが ⁴⁷⁾

, UCN-01

と

hAGP

との結合にシアル酸は関与していないものと考 えられた.

hAGP

Bound (%) 96.33 ± 1.26 95.59 ± 1.06 Native-hAGP Asialo-hAGP

Table 3 Effect of sialic acid on binding of UCN-01 to hAGP at pH 7.4

The concentrations are : [Native-hAGP]= [Asialo-hAGP]= [UCN-01]= 20 µM.

Each value represents the mean ± S.D. (n=3).

3-2 hAGP

バリアントに対する

UCN-01

の結合性評価

 hAGPには, 

2

つのバリアント, 

F1*S

体と

A

体の存在が明らかになっている. F1*S 体と

A

体において, 全アミノ酸残基中の

22

残基が異なっている^16-18)

. 薬物の hAGP

バリアントに対する結合特異性は

, 数多く報告されている . 例えば, イミプラミ

ン, アミトリプチリン及びプロパフェノンが

A

体に, F1*S 体にはジピリダモール 及びプラゾシンが特異的に結合する

. しかしながら, プロゲステロン , プロプラ

ノロール及びクロルプロマジンの

hAGP

バリアントに対する選択性は認められてい

ない⁴⁸⁾

. 興味深いことには, F1*S

体と

A

体の存在比には, 個体差があることが報

告されている⁴⁹⁾

. 従って, hAGP

に特異的に結合する

UCN-01

の

hAGP

バリアント に対する結合性を評価することは, UCN-01 の臨床応用に際しての有用な基礎資料 になるものと思われる. そこで, hAGP の

2

つのバリアント, F1*S体と

A

体に対

する

UCN-01

の結合性を検討した.

hAGP

Native-hAGP F1*S A

Binding percentage (%) 96.33 ± 1.26 95.08 ± 0.3 95.23 ± 0.45 Table 4 Binding percentage of UCN-01 to hAGP variants at pH 7.4

The concentrations are: [Native-hAGP]=[F1*S]=[A]=[UCN-01]= 20 µM.

All values are mean ± S.D. (n=3).

 Table 4 に示すように, 2 つのバリアント間において, 結合性の差異は認められ なかった. 上述したように, 2つのバリアント間において, hAGPの

183

個のアミ ノ酸残基のうち

22

残基が異なっているが, 

UCN-01

の結合性に変化はなかったため,

UCN-01

と

hAGP

の結合には保存されているアミノ酸残基の関与が考えられる.

3-3 化学修飾 hAGP

における

UCN-01

の結合性評価

 前述したように, UCN-01 は

hAGP

分子に異常に強く結合する. UCN-01 の結合 に関わり合っているアミノ酸を明らかにすることは, ひいては

UCN-01

の強い結合 性のメカニズムを解くことにつながるものと考えられる. 蛋白質などの生体高分子 と薬物の相互作用部位解明の研究手段としては, X 線結晶構造解析などの分光学的 手法が考えられるが, hAGP 分子上のリガンド結合部位の特定がほとんどされてい ない現状では, これらの方法を使うことはできない

. これに比べ化学修飾法は古

典的であるものの, 薬物結合に関与するアミノ酸残基を簡便に予測することができ る. すなわち

, 特定のアミノ酸残基が化学修飾を受けたとき , 蛋白質の薬物結合

性に変化が認められれば, そのアミノ酸残基は薬物と蛋白質との結合に関与すると 見なすことができる. そこで, 

hAGP

のリガンド結合に関与すると言われている^28, 50-52)

,

リジン（Lys）, ヒスチジン（His）, トリプトファン（Trp）及びチロシン（Tyr）

の

4

つのアミノ酸残基をそれぞれ

, フェニルイソシアネート, ジエチルピロカル

ボネート（DEP）, 2-ヒドロキシ

-5-ニトロベンジルブロマイド（ HNBB）及びテト

ラニトロメタン（

TNM）を用いて化学修飾した , いわゆる修飾 hAGP

を調製し

,

UCN-01

との結合性を検討した. Table 5に修飾

hAGP

の修飾残基数を示す.

Reacted

amino acid Reagents Number of modified residues per mol

Trp (3) Tyr (12) His (3) Lys (14)

HNBB TNM

DEP

Phenyl isocyanate Lys 3.53 His 0.55 Trp 0.22 Tyr 0.65 Lys 0.46 His 1.75 Trp 0.52 Tyr 0.35 Lys 0.23 His 0.25 Trp 1.37 Tyr 0.53 Lys 0.25 His 0.45 Trp 0.66 Tyr 1.68 Table 5 Number of reacted amino acid residues in hAGP

( ): total number in hAGP DEP: diethylpyrocarbonate

HNBB: 2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide TNM:tetranitromethane

 

 その結果, 予測したように

, それぞれの化学修飾剤により , 4

つのアミノ酸残 基が特異的に修飾されていることが判明した. 次に, UCN-01の修飾

hAGP

に対す る結合率を測定した結果, Table 6 から分かるように, 4 つのアミノ酸残基をそれ ぞれ修飾した

hAGP

に対する

UCN-01

の結合は, これらのアミノ酸修飾化に伴って 有意に低下した. 特に, アミノ酸修飾化に伴うリガンド結合性の低下は

Trp

修飾体 で顕著であった. これらの結果より, UCN-01と

hAGP

の結合には, Trp 残基が重 要な役割を演じていることに加えて, His, Lys 及び

Tyr

残基も関与していること が示された. さらに, hAGPに

3

つ存在する

Trp

残基は

hAGP

のバリアント, F1*S 及び

A

体においてすべて保存されているため, UCN-01の

hAGP

バリアントに対す る同程度の結合性は（Table 4）, Trp残基の関与を支持する結果と考えられる.

Table 6 Binding percentage of UCN-01 to native and chemically modified hAGP at pH 7.4

Chemically modified hAGP

Native- hAGP His Lys Trp Tyr

Binding

percentage (%) 96.33 ± 1.26 70.44 ± 2.68 * 75.97 ± 1.56 * 56.97 ± 2.06 * 73.70 ± 1.01 * The concentrations: [UCN-01]=[Native-hAGP]=[Chemically modified hAGP]=20 µM.

All values are mean ± S.D. (n=3).

*Statistically significant compared with native-hAGP; p<0.01.

3-4 UCN-01

と

hAGP

の結合における

Trp

残基の影響

 hAGPは, その構造中に

3

個の

Trp

残基を

25, 122

及び

160

位に有しており, そ れらをとりまく環境は大きく異なると考えられている

. 例えば, 25

位は蛋白質内 部に, 

160

位は溶媒に露出, 

122

位はその中間に位置していると考えられている^{28, 53)}

.

一般に, 

Trp

残基の蛍光特性はそれをとりまくミクロ環境に影響されることから, 蛋 白質の立体構造を知る上での有用なプローブとして期待されている.

UCN-01

の

hAGP

結合における

Trp

残基の関与の可能性が高いことから, Trp に

由来する

hAGP

の蛍光性について修飾

hAGP

と比較検討した. その結果, Fig. 12 に示すように蛍光極大波長の長波長シフトと蛍光強度の減少が観察された. 修飾さ れた

Trp

残基数がほぼ

1

であることと, Trp 残基修飾に際し変性剤を用いていない ことより, 表面に露出している

160

位の

Trp

残基が修飾されたものと考えられる. す なわち, Fig. 12で観察された蛍光強度の減少には, 160位の

Trp

残基が関わってい ることが推察される.

300 400

Wavelength (nm)

Intensity

-900 -1400

Native-hAGP Trp modified hAGP

Fig. 12 Fluorescence spectra of Trp residues of native and Trp modified hAGP at pH 7.4

The concentrations are:[hAGP]=[Trp modified hAGP]=1 µM. Excitation was 295 nm, and emission was monitored from 300 to 400 nm.

 

 興味深いことには, 同様な現象が

hAGP

に

UCN-01

を添加することにより観察さ れた. これらの蛍光消光は

UCN-01

濃度依存的であった（Fig. 13）. UCN-01 添加 による

hAGP

分子の蛍光消光は, UCN-01 分子と

hAGP

分子とのエネルギー移動に よるものと考えられる. 従って, UCN-01結合には

160

位の

Trp

残基が深く関わっ ている可能性が示唆された

. しかしながら , これらのアミノ酸残基の特定につい

ては, さらに検討が必要と考えられる.

Relative fluorescence intensity

[UCN-01/hAGP]

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

0.5 1

0

Fig. 13 Fluorescence quenching titration curve of UCN-01 binding to hAGP at pH 7.4 Concentration is:[hAGP]=1 µM. [UCN-01]=0~3 µM.

第

4

節 小括

 本章では, UCN-01 がどのような結合様式に基づいて

hAGP

に強固に結合してい るのかを明らかにするために, UCN-01, UCN-02及び

Staurosporine

の

hAGP

に対す る結合性, UCN-01 と hAGP との結合に及ぼす塩濃度, 脂肪酸添加及び

pH

の影響 を検討した. 次いで, hAGP のリガンド結合に重要な役割を果たしていると考えら れるアミノ酸残基を化学修飾し, これらの修飾

hAGP

に対する

UCN-01

の結合性を 未処理

hAGP

と比較検討した. 以下に得られた知見を要約する.

1）

UCN-01

の C-7 位の水酸基の脱離した Staurosporine 及び水酸基が

α-配置した

UCN-02

の

hAGP

に対する結合定数を算出した結果, 

UCN-01

に比べて, Staurosporine

及び

UCN-02

の結合性はそれぞれ

1/25

及び

1/200

に低下した. UCN-01の C-7 位の 置換基の重要性は, PKD1 や

Chk1

と

UCN-01

との

X

線結晶構造解析の結果からも 報告されており, 本研究で行った

UCN-01

の

hAGP

に対する結合においてもその重 要性が示唆された. 興味深いことに, 

UCN-01

の C-7 位の水酸基がα-配置した UCN-02 においては

1/200

もの結合定数の低下が観察され, UCN-01 の

hAGP

に対する特異 的な結合には C-7 位の置換基に加えてその配向性が重要な役割を演じていることが 明らかになった.

2）UCN-01

の

hAGP

結合に及ぼす塩濃度及び脂肪酸添加の影響について検討した結

果, UCN-01 の結合性は

NaCl

及び脂肪酸添加により濃度依存的に減少したことよ り, UCN-01 と

hAGP

との結合には静電的及び疎水性相互作用が関与していること が示唆された. また, UCN-01の

hAGP

結合に及ぼす

pH

の影響について検討した ところ, 

pH

の上昇に伴って結合率は増大し, 

pH 7.4

において最大となった. 

UCN-01

の構造と

hAGP

の等電点（pI=2.7）から考え合わせて, pH 7.4 での最大結合率はゲ スト-ホスト間の解離現象が程よく絡み合って静電的及び疎水性相互作用が強化され たものと考えられる. さらに, hAGP 自身の

CD

スペクトルの

pH

プロファイルか ら, 三次構造に若干の変化が観察された. これらの結果より, pH に伴う

UCN-01

結合の変化は, ホスト

-ゲスト間の複雑な解離状態に伴う相互作用の強化や hAGP

のコンフォメーション変化を反映したものと推察された.

3）hAGP

からシアル酸を除いたアシアロ

hAGP

に対する

UCN-01

の結合性を検討し

た結果, hAGP とアシアロ

hAGP

との間には, UCN-01 の結合に有意な差異は認め られなかったことより, UCN-01 の

hAGP

に対する結合にはシアル酸は関与してい ないものと考えられた. また, hAGP の

2

つのバリアント, F1*S 体と

A

体におい

て

UCN-01

の結合性を検討したところ, これらの結合性に有意な差異は認められな

かった. hAGPは

183

個のアミノ酸残基からなり, 2つのバリアント間において

22

残基が異なっているが, UCN-01 の結合性に変化はなかったため, 保存されている アミノ酸残基が

UCN-01

の結合に関与していることが推察された.

4）UCN-01

の

hAGP

分子上の薬物結合サイトを評価するために

, Lys, His, Trp

及び

Tyr

残基をそれぞれフェニルイソシアネート, DEP, HNBB 及び

TNM

を用い て化学修飾した

hAGP

を調製し, UCN-01との結合性を検討した. その結果

4

つの

アミノ酸残基の修飾化に伴って, いずれも

UCN-01

の結合性は低下し, 特に

Trp

残 基修飾により顕著に低下した. この結果より, UCN-01 と

hAGP

の結合には, Trp 残基が重要な役割を演じていることに加えて, His, Lys 及び

Tyr

残基も関与して いることが示された. また, hAGPに存在する

3

つの

Trp

残基は

hAGP

のバリアン ト, F1*S 及び

A

体においてすべて保存されているため, UCN-01 の

hAGP

バリア ントに対する同程度の結合性は, Trp 残基の関与をさらに支持する結果と考えられ る. また, 未修飾

hAGP

と修飾

hAGP

の蛍光スペクトルを測定した結果, 修飾

hAGP

において蛍光極大波長の長波長シフトと蛍光強度の減少が観察された. 修飾された

Trp

残基数がほぼ

1

であることと, Trp 残基修飾に際し変性剤を用いていないこと を考え合わせると, 表面に露出している

160

位の

Trp

残基が修飾されたものと考え られる. すなわち, Trp 修飾

hAGP

で観察された蛍光強度の減少は, 160 位の

Trp

残基が関わっていることが推察される. また, 同様な現象が

hAGP

に

UCN-01

を添 加することにより観察され, UCN-01 の

hAGP

に対する結合における

Trp

残基の重 要性がさらに示唆された.

 本章で得られた結果より, UCN-01 の

hAGP

に対する強固な結合性には, C-7 位 の置換基及びその配向性と

hAGP

分子上の

Trp

残基が重要な役割を演じていること が明らかになった. また, hAGP分子上の

25, 122

及び

160

位に存在する

Trp

残基 のなかで, 溶媒に露出している

160

位の

Trp

残基の関与が示唆された. 今後, 修 飾された残基の特定化などの課題は残すものの, UCN-01 の

hAGP

に対する特異的 な結合の鍵となる

UCN-01

の C-7位の置換基と

160

位の

Trp

残基の重要性を明らか にすることができた.

第 3 章 光アフィニティラベル法及び hAGP の立体構造モデルを用     いた hAGP 分子上の UCN-01 の結合部位の検索

第

1

節 序

 受容体や抗体, 酵素などの機能性蛋白質は, 特定の物質（リガンド）を認識し, 独 自の機能を発現している

. リガンドがどのような蛋白質を認識するのか , または

蛋白質構造中のリガンド結合部位がどこにあるのかを解析する方法として, 大きく 分けると分子生物学的手法と蛋白質化学的手法の

2

つがある. 前者, 特に遺伝子 工学的手法を用いた部位特異的変異法は

, 遺伝子の変異により , 蛋白質分子上の

アミノ酸残基を他の性質の異なるアミノ酸残基に置換し, 蛋白質の機能変化を見る ことで薬物結合部位を同定するもので, アミノ酸残基の置換により立体構造変化を 引き起こす可能性があるものの, アミノ酸残基レベルで結合部位を同定できるとい う点で非常に優れている. 一方, 後者の光アフィニティラベル法は

, リガンドに

光反応基を導入し, 光照射によりニトレン

, カルベンといった反応性の高い化学

種を発生させ, 薬物結合部位とその近傍を特異的に化学修飾するものである³⁴⁾

. ま

た, リガンド結合部位が空間的な広がりを持つ部分から構成されている場合でもそ の全容を明らかにすることができる

. 現在まで , 光アフィニティラベル法は , P

糖蛋白質^{54, 55)}

,  Ca

チャネル^{56, 57)}及び GABA^A（

γ -aminobutyric acid A）レセプター

^{58, 59)}

の基質認識部位を同定するために威力を発揮してきた

. この 2

つの手法は, お互 いの欠点を相補うような関係にあり, 両手法で得られる結果を総合することで

, X

線結晶構造解析で得られる「静的情報」に加え, 薬物結合を理解するために必要な

「動的情報」を獲得できる. しかしながら, X 線結晶構造解析や

NMR

解析などに よって

hAGP

の立体構造が未だ明らかにされていない現状では, これらの情報を得 ることは非常に困難である.

 このような背景下

,  UCN-01

の

hAGP

分子上の結合部位の同定を行うために

,

[

³

H]UCN-01（Fig. 14）を光ラベル化剤として, 光アフィニティラベル法により検討

を行った. まず, 

[

³

H]UCN-01

を光照射により

hAGP

分子上に光ラベル化を行った. 次 に, ラベル化された

hAGP

の糖鎖の除去を行った後

, トリプシンを用いて消化を

行い, アミノ酸レベルでの

UCN-01

の結合部位の検索を行った

. さらに, 光アフ

ィニティラベル法により同定したアミノ酸残基を置換させた, 変異

hAGP

を作成し, ラベル部位の同定を行った

. 最後にこれらの結果をもとに , ドッキングシュミレ

ーションを行った.

H N

N N

O

H H CO

3

NHCH

₃

HO O

H

3

C 7

*

Fig. 14 Chemical structure of [

³

H]UCN-01

*:

³

H-labeled position.

第

2

節 光アフィニティラベル法による hAGP 分子上の

[

³

H]UCN-01

の結合部     位の同定

2-1 [

³

H]UCN-01

の光ラベル化剤としての有用性

 まず, [³

H]UCN-01

の光ラベル化剤としての有用性を検討した. 通常, 光アフィ ニティラベルを行う場合は, リガンドに光反応基を導入して光ラベル化剤として用 いるが, [³

H]UCN-01

は代表的な光反応基である ³⁴⁾

C=O

基を有しているため, 光反 応基の導入を行わずに用いた. hAGPと[³

H]UCN-01

を氷上でインキュベート後, 光 照射したときの電気泳動と放射活性の解析結果を

Fig. 15

に示す. 電気泳動で流し たゲルを PVDF（polyvinylidene difluoride）膜に転写し, 

CBB（Coomassie Brilliant Blue

R250）染色した結果, hAGP

のバンドに光照射による断片化は見られず, 単一バン

ドとして得られた. また, この膜をイメージングプレートに

48

時間コンタクトし て放射活性の強さを解析したところ

, 光照射を行った場合のみ放射活性のバンドが

観察され, 光照射により, [³

H]UCN-01 と hAGP

との間に共有結合が形成されてい ることが確認できた

. また, 共有結合形成の時間依存性について検討を行ったと

ころ, 時間依存的に放射活性のバンドは強くなり, 

30

分でプラトーに達した（Fig. 16）

.

この結果より, [³

H]UCN-01

は

hAGP

に共有結合しており, 光ラベル化剤として有 用であることが確認できたので

, 今後の操作では, 光照射時間をプラトーに達す

る

30

分間とし, 光アフィニティラベルを行った.

1 2 1 2

97 66 45 20.1 14.4 kDa

97 66 45 20.1 14.4

PVDF membrane kDa Autoradiogram

Fig. 15 Photolabeling of hAGP with [

³

H]UCN-01

Lane 1: Sample taken just prior to photoirradiation. Lane 2: Sample taken after 30 min

photoirradiation (>300 nm). 50 µM hAGP and 0.08 µM [

³

H]UCN-01 were incubated for 60

min prior to photoirradiation.

0 5 10 15 20 25 30 0

50 100 150 200 250 300

Photoincorporation time (min)

Radioactivity, PSL (a.u.)

45 kDa

Autoradiogram

0 5 10 15 20 25 30 time (min)

Fig. 16 Time course of [

³

H]UCN-01 photoincorporation

50 µM hAGP and 0.08 µM [

³

H]UCN-01 were incubated for 60 min prior to photoirradiation.

The incubation mixture was irradiated for each time and separated with 10% SDS-PAGE.

2-2 光アフィニティラベル法による各種薬物の[

³

H]UCN-01

結合への阻害効果

 超遠心分離法を用いた置換実験の結果より, hAGP 分子上の

UCN-01

の結合部位 は, ステロイドホルモン

, 酸性薬物及び塩基性薬物の結合部位とオーバーラップ

していることが報告されている ⁶⁰⁾

. そこで, [

³

H]UCN-01

による光ラベル化の特異 性を確認するために

, 光アフィニティラベル法を用いて置換実験を行った . 置換

剤として, ステロイドホルモン類のプロゲステロン

, 酸性薬物のワルファリン及

び塩基性薬物のプロプラノロールを用いた. さらに, cold UCN-01, UCN-01の

C-

7

位の水酸基が

α -配置した UCN-02

及び水酸基の脱離した

Staurosporine

も置換剤と して用いた. [³

H]UCN-01

を光ラベル化する際, 置換剤を過剰量加え, hAGP のバ ンドの放射活性がどの程度阻害されるか検討した（Fig. 17）.

45 kDa

Autoradiogram

1 2 3 4 5 6 7

0 50 100 150 200 250

*

*

*

*

*

*

Radioactivity, PSL (a.u.)

Fig. 17 Photolabeling of hAGP with [

³

H]UCN-01 in the presence of competitors 50 µM hAGP and 0.08 µM [

³

H]UCN-01 were incubated for 60 min prior to photoirradiation in the presence of 250 µM competitors. The incubation mixture was irradiated for 30 min and separated with 10% SDS-PAGE.

Lane 1: no competitor, Lane 2: cold UCN-01, Lane 3: Staurosporine, Lane 4: UCN-02, Lane 5: warfarin, Lane 6: progesterone, Lane 7: propranolol.

 置換実験の結果, すべての

UCN-01

誘導体により, 結合定数に依存した

60%以

上の強い阻害効果が観察された

. また, プロゲステロンによって 58%の阻害効果

が観察され, ワルファリン及びプロプラノロールの阻害効果はそれぞれ

16%及び 26%

となった（Table 7）. 各薬物により阻害効果の程度に差異が観察された

. これは,

UCN-01

の結合部位と各薬物の結合部位のオーバーラップしている領域の差異のた

めと考えられる. 一方, cold UCN-01, UCN-02 及び Staurosporine においては, 結 合定数に依存した阻害効果が観察されたため, これらの誘導体は

UCN-01

と同じ領 域に結合するものと考えられる.

Cold UCN-01

^a

Staurosporine

^a

UCN-02

^a

Warfarin

^b

Progesterone

^b

Propranolol

^b

Ka (M

^-1

) 2.88 × 10

⁸

1.13 × 10

⁷

1.48 × 10

⁶

1.08 × 10

⁶

1.00 × 10

⁵

2.98 × 10

⁵

Inhibition (%) 86.38 68.54 61.52 16.43 58.71 26.26 Competitors

Table 7 Binding affinity constant and inhibition percentage by the competitors

a

Binding constant data taken from Ref. 61.

b

Binding constant data taken from Ref. 62.

2-3 hAGP

の脱糖化

UCN-01

の

hAGP

上の詳細な結合部位の同定を行うため, ラベル化後の

hAGP

を

酵素を用いて消化を行い, 最後にアミノ酸解析を行う必要がある

. しかしながら, hAGP

はその分子内に

15, 38, 54, 75

及び

85

位に糖鎖が結合しており（Fig. 18）, その糖鎖含量は分子量の約

45%と他の糖蛋白質のなかでも極めて高いため, 酵素消

化やアミノ酸解析に影響を及ぼすことが推察される. そこで, hAGP に

5

本存在す る糖鎖を

N-glycosidase F recombinant（PNGase F）を用いて脱糖を行った. その結果 ,

24 kDa  付近に単一バンドとして現れ, ほぼ完全に hAGP

の糖鎖を除去することが

できた（Fig. 19）. また, 糖鎖除去後の

hAGP

は, 未処理

hAGP

と同様に放射活 性を持っているため, UCN-01 の結合に

hAGP

の糖鎖は関与していないものと考え られる.

Fig. 18 Glycosylation position of hAGP

●

: glycans

15 38 54 75 85

hAGP

0 183

43 29 18.4 14.3 6.2 kDa

3

43 29 18.4 14.3 6.2 kDa

3

PVDF membrane Autoradiogram

1 2 1 2

Fig. 19 Deglycosylation of hAGP by PNGase F

  

Lane 1: untreated hAGP. Lane 2: deglycosyled hAGP.

2-4 逆相 HPLC

によるラベルペプチドの粗精製

 hAGPの糖鎖を除去した後, Lysとアルギニン（Arg）残基の

C

末端を認識して消 化するトリプシンを用いて

hAGP

の断片化を行った

. 次に, 不要な試薬である界

面活性剤やトリプシンを除去するために, 逆相

HPLC

によってラベルペプチドの精 製を行った. 逆相

HPLC

により分離した溶離液を

30

秒ごとに分取して, 各フラク ションを液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した結果

, 10.5~11.5

分のフラクションが高い放射活性を持っており

, [

³

H]UCN-01

がラベル化されてい るペプチドが溶出しているものと考えられる（Fig. 20A, 20B）. そこで, この２つ のフラクションを分取, 濃縮後, Capillary HPLCのサンプルとした.

0 200 400 600 800

0 10 20 30 (min)

dpm

0 10 20 30

A)

B)

(min)

Fig. 20 Reverse-phase HPLC separation of tryptic peptides of hAGP photolabeled with [

³

H]UCN-01

An aliquot of 20 µL of the tryptic peptides were applied on a C

18

-column and eluted at 1 mL/min using an aqueous acetonitrile gradient in the presence of 0.1% TFA (from 5 to 95%

acetnitrile over the course of 40 min).

A), UV-absorption (210 nm); B), radioactivity of the reverse-phase fractions (200 µL) was determined by scintillation counting.

2-5 Capillary HPLC

によるラベルペプチドの

N

末端アミノ酸解析

 逆相

HPLC

により精製後, さらに

Capillary HPLC

を用いてラベルペプチドの分離 を行った. Capillary HPLCは, 分離した溶離液を直接

PVDF

膜にブロットするため, ブロットされた膜を切り取り

, アミノ酸解析を行うことができる . 溶離液をブロ

ットした

PVDF

膜の放射活性を測定した結果, 84~85 分で観察されたピークが高い 放射活性を持っていることが明らかになった（Fig. 21A, 21B）. そこで, 非標識の

UCN-01

を用いて同様に光アフィニティラベルを行い, 酵素消化と精製を行った. 放 射活性に対応するピーク部分を切り取り, マイクロシークエンサーによる

N

末端ア ミノ酸解析を行った. その結果, N 末端から

SDVVYTDXK

というペプチドが同定 された（Fig. 22）. hAGP 分子は

183

個のアミノ酸からなり（Fig. 23）, Edman 分 解により同定されたペプチドは

153

位の

Ser

残基から

161

位の

Lys

残基に相当する. さ らに, この

1~9

サイクルのうち

8

サイクル目, つまり

160

位の

Trp

残基だけが全く 同定されなかった（Fig. 22）. 通常, Edman 分解においてアミノ酸が同定できなか った場合は, 糖化, 酸化及びリガンドによる修飾が考えられる. 本研究において, 糖 は用いておらず, ペプチド分離後は酸化の影響を考慮して早急にアミノ酸解析を行 った. さらにアミノ酸解析は

, 放射活性に対応するピークを切り取って行ったた

め, [³

H]UCN-01

による光ラベル化がおこっているため

, アミノ酸が同定できなか

ったものと考えられる.

Retention time (min)

0 30 60 90 120 150 180

A)

B)

Fig. 21 Chromatogram of capillary HPLC (A) and autoradiogram of blotted PVDF membrane (B)

After purified peptides using reverse-phase HPLC, an aliquot of 10 µL of the evaporating sample was applied on a C

18

-column and eluted at 5 µL/min using an aqueous acetonitrile gradient in the presence of 0.1% TFA (from 5 to 95% acetonitrile over the course of 200 min).

The blotted membrane from the capillary HPLC separation was in contact with an imaging

plate for 48 h prior to autoradiography analysis.

Number of cycle

Yield of PTH-amino acid ( pmol )

1 2 3 4 5 6 7 8 9

S

¹⁵³

D

¹⁵⁴

V

¹⁵⁵

V

¹⁵⁶

Y

¹⁵⁷

T

¹⁵⁸

D

¹⁵⁹

X

K

¹⁶¹

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Fig. 22 N-terminal amino acid sequence analysis by the Edman degradation method

QIPLCANLVP VPITNATLDQ ITGKWFYIAS

AFRNEEYNKS VQEIQATFFY FTPNKTEDTI

FLREYQTRQD QCIYNTTYLN VQRENGTISR

YVGGQEHFAH LLILRDTKTY MLAFDVNDEK

NWGLSVYADK PETTKEQLGE FYEALDCLRI

KKDKCEPLEK QHEKERKQEE

GES

10 20 30

40 50 60

70 80 90

100 110 120

130 140 150

160 170 180

PKSDVVYTDW

Fig. 23 Amino acid sequence of the photolabeled region of hAGP

2-6 光アフィニティラベル法による変異 hAGP

分子上の[³

H]UCN-01

の結合性評価

 化学修飾の結果より, UCN-01 の

hAGP

に対する特異的な結合には, Trp 残基が 関与する可能性が示唆された（Table 6）. しかし, hAGP 分子中には

25, 122

及 び

160

位に

Trp

残基が存在するため, Trp 修飾により観察された結合率の顕著な減 少が, いずれの

Trp

残基修飾によるものなのかは明らかではない. そこで光ラベル

化における

Trp

残基の重要性を明らかにするために, 多くの組換え型蛋白質発現系 に用いられているメタノール資化酵母であるピキア酵母を用いて

,  recombinant

hAGP（rhAGP）を作成した. 25, 122

及び

160

位の

3

つの

Trp

残基をそれぞれア

ラニン（Ala）残基に置換させた, W25A, 

W122A

及び

W160A

を精製後, これまで と同様に[³

H]UCN-01 を加えて光照射を行った. その結果, W25A

及び

W122A

の放 射活性は, Wild タイプと比べて有意な差異は認められなかったが, W160A におい て, 有意な減少が観察され, 

160

位の

Trp

残基を

Ala

残基に置換させることにより, 放 射活性において約

80％の減少が観察された（Fig. 24）. これまで化学修飾やドッキ

ングモデルを用いた検討により, 25²⁸⁾及び 122 位⁶³⁾の

Trp

残基の関与は示唆されて いるものの, 160 位の

Trp

残基の関与は報告されていない. そのため, 本項で同定 した 160 位の

Trp

残基は, hAGP に特異的に結合する UCN-01 の新規の結合部位と 考えられる.

0 50 100 150 200

Wild-type W25A W122A W160A Autoradiogram

* 45 kDa

Radioactivity, PSL (a.u.)

Fig. 24 Photolabeling of wild type, W25A, W122A and W160A with [

³

H]UCN-01 50 µM rhAGP and 0.08 µM [

³

H]UCN-01 were incubated for 60 min prior to photoirradiation.

The incubation mixture was irradiated for 30 min and separated with 10% SDS-PAGE.

*Statistically significant compared with wild type; p<0.01.

第

3

節 hAGP と UCN-01, UCN-02及び

Staurosporine

とのドッキングシュミ     レーション

3-1  hAGP

と

UCN-01

とのドッキングモデル

 現在, hAGP の立体構造は明らかにされていないが, Kopecky らは, hAGP と同 じリポカリンファミリーに属する

4

つの蛋白質の

X

線結晶構造解析の結果を鋳型に して, 

hAGP

の立体構造モデルを構築した⁶³⁾

. そこで, このモデルを用いて,  UCN-01

のドッキングシュミレーションを行った. リガンドである

UCN-01

は, 細胞の癌化 に関与する

Chk1

との

X

線結晶構造解析の結果を用いた ⁶⁴⁾

. これまでの結果より,

UCN-01

は明らかに

160

位の

Trp

残基と相互作用していると考えられるため, hAGP

の立体構造モデルにおいて, 

160

位の

Trp

残基付近の結合ポケットの検索を行った. そ の結果, hAGPの分子表面に

Type I

と

Type II

の

2

つの結合ポケットの存在が明ら かになった（Fig. 25）.

Type I

Type II Trp160

Fig. 25 Type I and II docking models of UCN-01 and hAGP

 また, Table 8 には, Type I及び

II

モデルにおける

5Å

以内の

donor

と

acceptor

の 相互作用様式を示す. Type I のモデルにおいて, UCN-01 は 43 位のグルタミン酸

(Glu43)

や

Tyr50

との水素結合が観察された. 一方, Type IIモデルにおいて

UCN-

01

は, Trp160との水素結合やスタッキング相互作用が観察され, さらに

Lys135

や

Lys161

との静電的相互作用, 加えて

Tyr157

とのスタッキング相互作用が観察され

た. 化学修飾の結果（Table 6）と光ラベル化における

160

位の

Trp

残基の関与を考 え合わせると, Type IIにおけるアミノ酸残基のすべてが化学修飾の結果と一致して おり, 160 位の

Trp

残基との相互作用も観察されている. そのため, Type II モデ ルが実験結果とよく一致したモデルと考えられる.

Donors Acceptors Interactions Distance (Å)

Type I

Lys135 Trp160

Lys161 Lys161 Tyr157

UCN-01 (-O-) UCN-01 (C=O)

UCN-01 (OH) UCN-01 (C=O) UCN-01

Electrostatic Hydrogen bonding

Electrostatic Electrostatic Stacking

4.760 2.878

4.727 4.350 4.204 Table 8 Interaction and distance between donors and acceptors in the model of type I and II (UCN-01-hAGP)

Type II

UCN-01 (NH

₂⁺

) Glu43 Hydrogen bonding 2.793

Tyr50 UCN-01 (C=O) Hydrogen bonding 2.770

Trp160 UCN-01 Stacking 2.878

実験結果とよく一致した

Type II

モデルの結合ポケットは, 28 位のイソロイシン

（Ile28）, 

131

位のプロリン（Pro131）, 

Glu132,  Lys135,  138

位のロイシン（Leu138）,

Tyr157,  Trp160

及び

Lys161 残基で構成されており（Fig. 26）,  Trp160

残基は

UCN-01

の

C=O

基と水素結合しており, また, Lys161 残基は

UCN-01

の

C=O

基と

C-7

位 の

OH

基との静電的相互作用が観察された（Table 8）. さらに, UCN-01の糖部分 の酸素原子は, Lys135 と静電的相互作用をしており, Type II ドッキングモデルに おいて, 160位の Trp 残基に加えて, 新たに, Lys135, Tyr157及び

Lys161

の重要 性が明らかになった. Lys, Trp 及び

Tyr

残基は化学修飾により

UCN-01

の結合率 の低下が観察された（Table 6）. この結合率の低下はドッキングモデルにおいて観 察された UCN-01 と Lys, Trp 及び

Tyr

残基との水素結合, 静電的相互作用及びス タッキング相互作用が

, 化学修飾により消失したためと考えられる . また, 化学

修飾により

His

残基の重要性も明らかになっているが, ドッキングモデルにおいて, 相互作用は観察されなかった. アミノ酸解析により同定したペプチドには, 

His172 が

最も近くに存在しているが, 本項で用いた

hAGP

の立体構造モデルは, 170番目以 降のアミノ酸残基は正確な立体構造を構築できていないため, 相互作用が観察され なかったものと考えられる.

UCN-01 _Lys135

Trp160

Lys161

Pro131 Ile28 Tyr157

Glu132

Leu138

Fig. 26 Amino acid residues in a surface cleft around Trp160 that interacts with UCN-01 exhibited in type II docking model

Dotted line: electrostatic interaction. Arrow: hydrogen bonding.

3-2  hAGP

と

UCN-02

及び

Staurosporine

とのドッキングモデル

UCN-01

に加えて, Type IIモデルにおける, UCN-02及び

Staurosporine

のドッキ ングシュミレーションを行った. UCN-01, UCN-02 及び

Staurosporine

は, それぞ れ

C-7

位の置換基が異なっているため

, ドッキングモデルには C-7

位の置換基と

hAGP

のアミノ酸残基との相互作用に差異が認められた. Type II モデルにおいて,

UCN-01

の C-7位の

ß-OH 基は Lys161

と相互作用をしているのに対して（Table 8）,

UCN-02

の

C-7

位の

α

-OH 基は

Glu132

との相互作用が観察された（Table 9）

. 

一方, 

C-7

位に OH 基を有していない

Staurosporine

では, これらの相互作用が観察されなかっ た.

 UCN-01, UCN-02 及び

Staurosporine

の

hAGP

に対する結合定数は, UCN-01 >

Staurosporine > UCN-02

の順で低下することが明らかになっている（Table 2）

.  UCN-01

の芳香環は

Trp160

とスタッキング相互作用しており, この相互作用は, Trp160 と 同じ方向にある Lys161 と

UCN-01

の C-7 位の

OH

基との静電的相互作用により強 められるものと考えられる. 一方, UCN-02 の C-7 位の

OH

基は, Trp160 と反対

側で

Glu132

と水素結合しているため（Fig. 27）, Trp160 とのスタッキング相互作

用が弱まり

, 結合性が低下するのではないかと考えられる . また, Staurosporine

は

C-7

位に

OH

基が存在しないため, 芳香環と

Trp160

とのスタッキング相互作用 に変化はないものと考えられる（Fig. 28）.

Donors Acceptors Interactions Distance (Å)

Lys135 Lys161 Lys157

UCN-02 (-O-) UCN-02 (C=O) UCN-02

Electrostatic Electrostatic Stacking

5.612 3.443 4.350 Table 9 Interaction and distance between donors and acceptors in the model of type II (UCN-02-hAGP and Staurosporine-hAGP)

UCN-02 (OH) Glu132 Hydrogen bonding 2.705

Trp160 UCN-02 (C=O) Hydrogen bonding 3.116

UCN-02

Staurosporine

Trp160 Staurosporine (C=O) Hydrogen bonding 2.866 Lys135 Staurosporine (-O-) Electrostatic 4.802 Lys161 Staurosporine (C=O) Electrostatic 4.312

Lys157 Staurosporine Stacking 4.200

Trp160

UCN-02

Glu132

Lys135

Leu138

Ile28 Pro131

Lys161

Tyr157

Fig. 27 Amino acid residues in a surface cleft around Trp160 that interacts with UCN-02 exhibited in type II docking model

Dotted line: electrostatic interaction. Arrow: hydrogen bonding.

Staurosporine

Lys135

Leu138

Ile28 Pro131

Tyr157 Lys161

Trp160

Glu132

Fig. 28 Amino acid residues in a surface cleft around Trp160 that interacts with Staurosporine exhibited in type II docking model

Dotted line: electrostatic interaction. Arrow: hydrogen bonding.