食品成分の抗体産生調節に関する研究

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食品成分の抗体産生調節に関する研究

山本, 万里

https://doi.org/10.11501/3063842

出版情報：Kyushu University, 1992, 博士（農学）, 論文博士 バージョン：

権利関係：

食 品 成 分 の 抗 体 産 生 調 節 に 関 す る 研 究

山 本 万 里

1  992 

ミ;欠

第 1章 序 論 … … … 1 0 

第 2 章 食 品 成 分 の ヒ ト 型 ハ イ プ リ ド ー マ 抗 体 産 生 に 及 ぼ す 影 響

第

1

節 緒 言 … … … 1 

6 

第 2 節 実 験 材 料 及 び 方 法 : ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ H  B  4  C  5 を 用 い た 実 験 系 に つ い て … 1 6  第 1項 細 胞 及 び 培 養

第 2 項 細 胞 増 殖 度 の 測 定 第

3

項 ス ク リ ー ニ ン グ 法

第 4 項 抗 体 重 の 測 定 ( E L I S A法 〉

第

3

節 結 果 … … …

20

第 1項 最 適 培 地 の 選 定

第 2 項 単 糖 類 の 細 胞 増 殖 、 抗 体 産 生 に 及 ぼ す 影 響

第

3

項 多 糖 類 〈 食 物 繊 維 〉 の 細 胞 増 殖 、 抗 体 産 生 に 及 ぼ す 影 響

第 4 J頁 ロ ー カ ス ト ビ ー ン ガ ム 及 び ベ ク チ ン の 添 加 量 に よ る 細 胞 増 殖 と 抗 体 産 I

へ の 影 響

/ 

第

5

項 ボ リ フ ェ ノ ル 類 の ラ ッ ト

D N A 

第 6 項

切 断 試 験 と H B Ll  C  5 細 胞 を 用 い た 検 定 と の 比 較

コ ー ヒ ー 酸 の 細 胞 増 殖 、 抗 体 産 生 パ タ ー ン へ の 影 響

第 4 節 考 察 ・ ・ 第 5 節 小括・・

第 3 章 豆 乳 に よ る 抗 休 産 生 増 強 第 1節 緒言・・

第 2 節 実 験 材 料 及 び 方 法 … 第 1項 豆 乳

第 2 項 第 3 項

陰 イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ C 0  n A ア フ ィ ニ テ ィ ク ロ マ ト グ ラ フ ィ

第Ll

r

頁 熱 及 び ト リ プ シ ン 処 理

第 5 項 ゲ ル 絡 過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 第 6 項 S D  S ‑ P A  G E 

36  38 

4 1  4 1 

第 3 節 結 果 … … … 44 第 1項 豆 乳 の 1 P S F 

(Imrnunoglobulin 

Production  Stimulati ng  Factor) 

活 性

之

第 2 項 豆 乳 の 1 P S F 活 性 画 分

第 3 項 豆 乳 1 P S F の 特 性 一 陰 イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る 精 製 一 第 4 項 豆 乳 1 P S F の 特 性 ‑C 0  n A 

に よ る 検 討 一

第 5項 熱、 ト リ プ シ ン 感 受 性

第

6

項 ゲ ル 鴻 過 ク ロ マ ト グ フ ィ ー に よ る 精 製 第 7 項 S D S ‑ P A  G E 

第 4 節 考 察 … 56 

第

5

節 小 括 … … … 58

第 4 章 大 豆 外 皮 ヘ ミ セ ル ロ ー ス (S H H ) に よ る 抗 体 産 生 増 強

第 1節 緒 言 … … 59 

59  第 2 節

第 1項

実 験 材 料 及 び 方 法 … . . .

大 豆 種 皮 ヘ ミ セ ル ロ ー ス (S H H )  の 調 製 法

第 2 J頁 米 ぬ か ヘ ミ セ ル ロ ー ス (R  B  H )  の 調 製 法

第 3 項 大 麦 ガ ム 質 (B  G ) の 調 製 法

第 4 項 レ ク チ ン 結 合 ア ガ ロ ー ス ゲ ル に よ る 分 離 第 5 項 ゲ ル 漉 過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

︑

J

第 6 項 β ー ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ に よ る 消 化

第

3

節 結 果 … … … 63 第 1項

第 2 項

S H H の 1 P S F 活 性

S H H の 特 性 一 熱 、 ト リ プ シ ン 感 受 性 一 第 3 項 S H H の 特 性 一 レ ク チ ン と の 親 和 性 一 第 4 項 ゲ ル 漉 過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る 精 製 第 5 項 S H H 糖 鎖 部 の 酵 素 消 化 に よ る 活 性

へ の 影 響

第 6 項 各 種 ハ イ ブ リ ド ー マ に 対 す る 影 響

第 4 節 考 察 … … … 76 第 5 節 小 括 … … … 78

第

5

章 キ ト サ ン に よ る 抗 体 産 生 増 強 第 1節

第 2節 第 1J頁 第 2 頁工 第

3

項 第

3

節

第 1項 第 2項

緒 言 … … … 7B  実 験 材 料 及 び 方 法 … … … 80 

キ ト サ ン

ア セ チ ル 化 度 の 測 定 分 子 量 の 測 定

結 果 … … … 8 1  キ ト サ ン の

1 P S F

活 性

溶 解 液 の 相 違 に よ る 1 P S F 活 性 へ の 影 響

4

ど

第 3項 脱 ア セ チ ル 化 度 及 び 分 子 量 が 活 性 発 現 に 与 え る 影 響

第 4 項 キ ト サ ン の 抗 体 産 生 増 強 の 特 徴

第 5項 構 成 糖 に よ る キ ト サ ン 活 性 発 現 阻 害

第 4 節 考 察 … … … 92 第 5 節 小 括 … … … 95

第 6 章 ボ リ カ チ オ ン の 抗 体 産 生 増 強 第 1節

第 2 節 第 1項 第 2 項 第 3 項

緒 量

一

一一 ・ ・・・ ・・ ・・ ・・ ・ ・・ ・ ・・ ・ ・・ ・・ ・・ ・・ ・・ ・・ ・・ ・ .・ ..  ...  ...  ...  実 験 材 料 及 び 方 法 …

供 試 物 質

ε ー ボ リ リ ジ ン の ト リ プ シ ン 消 化 ト リ プ シ ン で 消 化 し た ボ リ リ ジ ン の 分 子 量 検 定

96  96 

第 3 節 結 果 … … … 99 第 1項

第 2 J頁 第 3 項

各 種 ボ リ カ チ オ ン の 1 P S F 活 性 ε ー ボ リ リ ジ ン の 特 性

分 子 量 及 び 結 合 塩 の 異 な る ボ リ リ ジ ン の 1 P S F 活 性

第 4 項 ボ リ リ ジ ン の ト リ プ シ ン 消 化 に よ る 1 P S F 活 性 へ の 影 響

C 

第 5 項 境 基 性 ア ミ ノ 酸 及 び ペ プ チ ド の 1 P S F 活 性

第 4 節 考 察 … … … 109  第 5 節 小 括 … … … 113

第 7 章 豆乳、 S H H、 キ ト サ ン の ヒ ト リ ン パ 球 抗 体 産 生 増 強

第 1節 第 2 節

第 1項 第 2 項 第 3 項 第 4 項 第 3 節

第 1項 第 2項 第 3 項 第 4 節 第 5 節

緒 言 … … … 115 実 験 材 料 及 び 方 法 … … … 115

ヒ ト リ ン パ 球 の 調 製

卵 黄 リ ボ タ ン パ ク 質 (

Y L P 

) の 調 製 マ イ ト ジ ェ ン

検 定 方 法

結 果 … … … 118 豆 乳 に よ る 増 強

S H H に よ る 増 強 キ ト サ ン に よ る 増 強

考 察 … … … 123  小 括 … … … 12 4 

第 8 章 キ ト サ ン 及 び ボ リ リ ジ ン に よ る 抗 体 産 生 i曽 強 機 作 の 検 討

ら

第 1節 第 2 節

第 1項 第 2 J頁 第 3 工頁 第 4 項 第 3 節

第 1項 第 2 項 第 3 項 第 4 節 第 5 節

緒 言 … … … 126  実 験 材 料 及 び 方 法 … … … 1 2 6 

膜外、 膜 内 抗 体 重 の 測 定

m 

R N A 転 写 阻 害 剤 を 使 用 し た 実 験 タ ン パ ク 質 合 成 阻 害 剤 を 使 用 し た 実 験 ア セ チ ル コ リ ン エ ス テ ラ ー ゼ 活 性 の 測 定 結 果 … … … 128 

キ ト サ ン の 膜 外 、 膜 内 抗 体 重 の 変 化 ボ リ カ チ オ ン の 翻 訳 安 定 性

膜 損 傷 の 測 定

考 察 … … … 13 5  小 括 … … … 138 

第 9 章 多 糖 類 及 び ボ リ カ チ オ ン に よ る イ ン タ ー ブ エ ロ ン ー β 産 生 調 節

第 1節 緒 言 … … … 140 第 2 節 実 験 材 料 及 び 方 法 … … … 142

第 1J頁 ヒ ト 骨 肉 腫 細 胞 株 を 用 い た ス ク リ 一 一 ン グ 方 法

第 2 項 E L  1 S A 法

第 3 J頁 小 麦 フ ス マ ヘ ミ セ ル ロ ー ス の 調 製

第

3

節 結 果 … … …

14  4 

7 

第 1項 食 物 繊 維 に よ る 1 F N ‑

s

産 生 調 節 第 2 項 ε ー ボ リ リ ジ ン に よ る 1N F ‑

s 

産 生 増 強

第 4 節 考 察 … … . 148 

第

5

節 小 括 … . 149 

第 1 0 章 総 括 … … … 150 

謝 辞 … … … 160 

引 用 文 献 … … … 161 

g 

E L  1 S A 

1 P S F 

1 T E S 

F B S  P B S  P W M  

C 0  n A 

L P S 

S T M  P H A 

S B A  U E A  s  P 

e a 

略 ^三口口^五

酵 素 標 識 免 疫 測 定 法 抗 体 産 生 増 強 因 子

イ ン シ ュ リ ン 、 ト ラ ン ス フ ェ リ ン 、 ヱ タ ノ ー ル ア ミ ン 、 セ レ ナ イ ト 牛 胎 児 血 清

リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 海 水

ポ ー ク ウ ィ ー ド マ イ ト ゲ ン

コ ン カ ナ バ リ ン A リ ボ 多 糖

サ ル モ ネ ラ チ フ ス 菌 イ ン ゲ ン マ メ レ ク チ ン 大 豆 凝 集 素

ハ リ エ ニ シ ダ レ ク チ ン ビ ー 豆 レ ク チ ン

第 1章 序 ^圭U岡^A

KぷhI e rと門 iIsteinに よ り 1975年 に 報 告 さ れ た マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 作 成 技 術 24 )は、 瞬 く 間 に 普 及 し 、 様 々 な 分 野 で 応 用 さ れ る よ う に な っ た 。 そ し て 、

J  a  m  ‑

e s 1 6 ) ら に よ っ て 確 立 さ れ た い ろ い ろ な 抗 原 に 特 異 的 な モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を つ く る ヒ ト ー ヒ ト ハ イ ブ リ ド ー

マ

1 . 5 . 46.54 . 59)は、 さ ら に 幅 広 い 利 用 が 可 能 と な っ た 。

医 学 分 野 で は 、 癌 や 感 染 症 〈 肝 炎 ウ イ ル ス な ど 〉 、 後 天 性 免 疫 不 全 症 な ど の 検 査 、 診断、 治 療 2 6.4 7.63)、 癌 特 異 的 抗 原 の 決 定 、 ア レ ル ゲ ン の エ ピ ト ー プ 解 析 な ど に 使 用 さ れ つ つ あ る 。 そ の よ う な 医 学 分 野 で は 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 精 製 が 重 要 と な る 。 そ の 中 で 無 血 清 培 養 法 は 、 高 い 血 清 を 用 い ず 、 多 種 血 清 タ ン パ ク 質 を 含 ま な い こ と か ら 、 精 製 の コ ス ト を カ ッ ト す る た め 今 後 必 要 な 技 術 と な る で あ ろ う 。 し か し 、 無 血 清 3 8)で 培 養 で き る ヒ ト 培 養 細 胞 で も 、 無 血 清 下 で は 、 血 清 添 加 培 地 に 比 べ 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 生 産 量 が あ ま り に も 少 な く 、 実 用 に は 耐 え ら れ な か っ た 。 そ の た め 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 大 量 培 養 を 目 的 と し 、 無 血 j青 培 養 下 で の ヒ ト モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 産 生 を 増 強 す る 因 子 〈 1 P S F  : ImmunogJobul in  Produclion  Stimulati ng 

/ ρ  

Factor)

の 検 索 が 行 わ れ た 。 そ の 結 果 、 数 種 の ヒ ト 培 養 細 胞 株 が 1 P S F を 生 産 す る こ と が 判 明 し 、 そ の 細 胞 性 1 P S F の 精 製 が 進 め ら れ て き た ^{30.31.54.55.61} 

• 6 8)。 そ し て 、 さ ら に そ の よ う な 1 P S F を 食 品 成 分 中 に 求 め 、 カ ゼ イ ン 、 ラ ク ト フ ェ リ ン 、 卯 黄 リ ボ プ ロ テ イ ン

(Y L P) 

^37，6 7 . 6 9 )中 に 見 い だ し て き た 。 現 在 ま で に 報 告 さ れ て き た 1 P S F は皆、 タ ン パ ク 質 性 I P S F で あ り 、 Y L P は、 動 物 細 胞 の 無 血 清 培 養 に お い て 最 も 重 要 な 細 胞 増 殖 因 子 で も あ る 。

近年、 食 品 の あ ふ れ る 世 の 中 に な り 、 消 費 者 の 晴 好 が 多 様 化 し 、 特 に 安 全 性 、 健 康 増 進 、 天 然 物 な ど の 要 因 を 重 視 す る 傾 向 に な っ て き て い る 。 そ の 中 に あ っ て 、 従来、 健 康 食 品 と 称 さ れ て き た も の が 、 厚 生 省 の 見 直

し な ど に よ り 、 よ り 明 確 に 規 定 さ れ た 機 能 を 持 っ た 食 品 と し て 再 評 価 、 新 評 価 さ れ る と い う 時 代 の 転 換 期 を 迎 え て い る 。 ま さ に そ の 中 に あ っ て 、 食 品 を 正 し く 評 価 す る と い う 研 究 の 進 展 へ の 期 待 が 高 ま っ て い る 。

では、 食 品 の 機 能 と は 何 か 。 食 品 品 質 に つ い て 、 従 来 よ り 言 わ れ て き た の は 栄 養 性 と 晴 好 性 の 2 特 性 だ け で あ っ た 。 栄 養 性 は 、 1 (欠機能、 日 書 好 性 は 2 次 機 能 と 評 価 さ れ 、 そ れ ぞ れ 生 命 の 維 持 に 不 可 欠 な も の 、 人 間 の 感 覚 〈 味 、 香り、 色 等 〉 に 訴 え か け る も の と し て 食

/1 

品 の 中 心 的 な 評 価 と な っ て い た 。 し か し 、 最 近 で は 、 食 品 に 求 め る 概 念 、 も さ ら に 進 み 、 3 ~欠機能を:tí{、定する

よ う に な っ た 。 そ れ は 、 生 体 防 御 、 休 調 リ ズ ム の 調 節 に 関 係 す る 生 体 調 節 機 能 、 疾 病 の 予 防 、 病 気 の 回 復 、 老 化 防 止 、 他 の 食 品 に 機 能 を 付 与 す る 機 能 な ど が 含 ま れる。 例 え ば ど の よ う な 食 品 か と い う と 、 ア レ ル ギ ー 軽 減 化 食 品 、 免 疫 強 化 食 品 、 リ ン パ 球 刺 激 食 品 、 高 血 圧 予 防 食 品 、 糖 尿 病 予 防 食 品 、 抗 腫 蕩 食 品 、 コ レ ス テ ロ ー ル 改 善 食 品 、 血 小 板 凝 固 抑 制 食 品 、 造 血 機 能 調 節 食品、 中 枢 神 経 調 節 食 品 、 末 梢 神 経 調 節 食 品 、 摂 取 機 能 調 節 食 品 、 吸 収 機 能 調 節 食 品 、 過 酸 化 脂 質 抑 制 食 品 、 食 品 劣 化 抑 制 食 品 等 で あ る 。 現在、 代 表 的 な 機 能 性 を 有 す る 食 品 と し て は 高 血 圧 や 糖 尿 病 予 防 、 コ レ ス テ ロ ー ル 改 善 作 用 を 持 つ と し て 食 物 繊 維 、 吸 収 を 調 節 す る と し て カ ゼ イ ン ホ ス ホ ペ プ チ ド 、 過 酸 化 脂 質 発 生 抑 制 と し て ビ タ ミ ン E、 グ ル タ チ オ ン 等 が 注 目 さ れ て き て い る 。 そ の よ う な

3

次 機 能 を 意 識 し た 食 品 の 評 価 を 早 急 に 進 め る こ と が 、 特 に 強 く 求 め ら れ て き た 。

食 品 は 毎 日 摂 取 す る も の で あ り 、 医 薬 と は 大 き く 異 な っ て い る 。 医 薬 品 は 高 度 に 精 製 さ れ た 物 質 で あ る が 、 食 品 は 様 々 な 要 素 (element) が 組 合 わ さ っ た 復 合 体 で あり、 1 _{~欠.._} 3 ~欠機能の多機能を発揮する可能性を秘

/之

め た 物 質 群 で あ る 。 そ の た め 、 そ れ ぞ れ の 食 品 が ど の よ う な 可 能 性 を 秘 め て い る の か 正 し く 評 価 す る こ と が 、 食 品 を 研 究 す る 上 で 益 々 重 要 に な っ て く る こ と は 容 易

に 予 想 し う る 。

毎 日 摂 取 す る 食 品 に は 強 力 な 抗 原 性 物 質 や レ ケ チ ン 等 の 非 特 異 的 免 疫 細 胞 刺 激 物 質 な ど が 含 ま れ て い る 。

こ の よ う な 免 疫 系 刺 激 物 質 に 曝 さ れ な が ら 、 生 体 は 反 応 し つ づ け 生 き て い る 。 3 { 欠 機 能 の 中 で も 、 こ の 免 疫 調 節 機 能 は 、 ヒ ト の 恒 常 性 〈 ホ メ オ ス タ シ ス 〉 と 深 く 関 わ っ た 生 体 機 能 で あ る 。 免 疫 系 は 、 非 常 に 複 雑 な 反 応 を 生 体 内 で 連 鎖 的 に 繰 り 返 し て い る 。 そ れ ら の 系 を 細 か く ば ら ば ら に し て 調 べ る こ と も 必 要 で あ る し 、 そ の 機 能 を 食 品 中 に 見 い だ し て い く こ と も 大 切 に な っ て

くる。 口 に す る も の の 中 に 恒 常 性 を 保 持 で き る 因 子 が 存 在 し て い れ ば 、 ヒ ト は 感 染 症 や 癌 な ど か ら か な り 距 離 を お く こ と が で き る は ず で あ る か ら で あ る 。

そ う し た 食 品 成 分 中 の 生 理 機 能 性 成 分 の l つ で あ る 免 疫 調 節 因 子 の

1

種 で あ る 抗 体 産 生 促 進 因 子 ( 1 

P S 

F ) の 検 索 及 び 作 用 機 作 の 解 明 に 、 前 述 し た モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 産 生 す る ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ が 使 え る の で は な い か と 筆 者 は 考 え た 。

元来、 こ の ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ は 、 癌 特 異 的 モ ノ

/:ヨ

ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 大 量 生 産 を 目 的 に 、 高 い 融 合 効 率 を 持 つ ヒ ト 型 親 細 胞 株 で あ る N A  T ‑ 3  0 と、 肺 ガ ン 患 者 の リ ン パ 球 と を 融 合 さ せ る こ と に よ り 作 製 さ れ た 細 胞 で あ り 、 無 血 清 培 養 が 可 能 で あ っ た 。 浮 遊 細 胞 で 継 代 も 容 易 で 培 養 コ ス ト も 低 い 。 し か し 、 血 清 下 で 培 養 し た マ ウ ス 型 ハ イ ブ リ ド ー マ に 比 べ 、 抗 体 産 生 量、が 著 し く 低 い 。 そ の た め 、 抗 体 産 生 増 強 因 子 が 培 養 液 中 及 び タ ン パ ク 質 中 に 検 索 さ れ て き た こ と は 前 述 の と お り で あ る 。

本 論 文 は 大 き く は 、 次 の 3 つ の 主 題 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し て い る 。

第 ー は 、 抗 体 を 産 生 す る ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ を 食 品 成 分 の 効 率 的 な 安 全 性 の 検 定 や 生 体 調 節 機 能 因 子 の ス ク リ ー ニ ン グ に 応 用 す る こ と が 可 能 で あ る か と い う こ と で あ る 。 まず、 毒 性 物 質 と し て フ ェ ノ ー ル 類 を 用 いて、 ほ 乳 類 D N A 切 断 試 験 と 比 較 し な が ら 、 ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ H B  4 C 5 細 胞 が 簡 易 な 安 全 性 検 定 に 用 い る こ と が 出 来 な い か を 検 討 す る 。 つ ぎ に 、 い く つ か の 食 品 成 分 に つ い て 、 抗 体 産 生 増 強 効 果 を 検 討 し 、 効 果 の 認 め ら れ た 因 子 に つ き 、 よ り 生 体 に 近 い 系 で あ

る ヒ ト リ ン パ 球 に よ る 試 験 を 行 い 、 ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ で の 検 索 と 比 較 す る 。

/~ど

第 二 は 、 現 在 ま で に 多 く の 生 理 活 性 の 報 告 さ れ て い る 多 糖 類 を 中 心 に し て 抗 体 産 生 増 強 因 子 の 検 索 を 行 い 、

そ の 活 性 物 質 の 特 性 を 解 明 す る 。

第 三 は 、 抗 体 産 生 増 強 因 子 の 作 用 機 作 を 考 察 す る 。 ボ リ カ チ オ ン の 中 の キ ト サ ン 及 び ボ リ リ ジ ン が 現 在 ま で に 報 告 さ れ て い る タ ン パ ク 質 1 P S F と は 異 な っ た 増 強 パ タ ー ン 〈 細 胞 増 殖 を 伴 わ な い 抗 体 産 生 増 強 ) を 示 し た の で 、 そ の

2

つ の 物 質 に つ い て 解 析 を 行 う 。 特 lこ、 ボ リ カ チ オ ン は 細 胞 膜 に 対 す る 作 用 が 大 き い と さ れ る の で 、 そ の 点 、 を 中 心 に 検 討 す る 。

本 研 究 は 、 抗 体 産 生 を 調 節 す る 食 品 成 分 を 検 索 し 、 そ れ ら の 特 性 を 明 ら か に し て 、 食 品 成 分 に よ る 生 体 防 御 に 関 す る 基 礎 的 知 見 を 得 ょ う と し て も の で あ る 。

/合

第 2 章 食 品 成 分 の ヒ ト 型 ハ イ プ リ ド ー マ 抗 体 産 生 に 及 ぼ す 影 響

第 1節 緒 百

食 品 成 分 の 機 能 性 や 安 全 性 を 明 ら か に す る こ と は 多 大 の 時 間 や 労 力 を 要 す る 作 業 を 伴 う 。 特 に 実 験 動 物 を 用 い た 試 験 は 、 動 物 愛 護 の 立 場 あ る い は 、 効率、 再 現 性 の 点 、 で 一 次 ス ク リ ー ニ ン グ に は 適 さ な い 。 初 期 ス ク リ ー ニ ン グ だ け で も も っ と 簡 便 で 効 率 的 な 方 法 の 使 用 が 可 能 で あ れ ば 、 か な り の 多 検 体 を 扱 う こ と も 容 易 に なる。

抗 原 特 異 的 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 産 生 す る ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ は 、 ヒ ト が ん 細 胞 株 と ヒ ト B リ ン パ 球 細 胞 の 融 合 に よ り 得 ら れ 1 6)、 ヒ ト 型 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 大 量 生 産 に 用 い ら れ て き た 3 6)。 そ し て 、 無 血 清 培 養 も 可 能 に な り 3 4)、 血 清 タ ン パ ク 質 に 妨 害 さ れ ず 、 抗 体 産 生 増 強 因 子 の 検 索 5 5・6 1)、 精 製 が 容 易 に な っ て き た 。

こ れ ま で 報 告 さ れ て い る 抗 体 産 生 促 進 国 子 の 多 く は タ ン パ ク 質 様 物 質 6 7 • 6 9 ) で あ る が 、 糖 類 に 注 目 し 、 抗 体 産 生 促 進 因 子 の よ う な 機 能 性 成 分 の 検 索 を 行 う 際 、 各 種 市 販 糖 類 が 供 試 細 胞 で あ る ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ

H

/ 6  

B  4 C 5 細 胞 に 与 え る 影 響 を 明 確 に す る 必 要 が あ る と

考 え た 。

食 品 成 分 の 生 体 調 節 機 能 の 1 つ で あ る 抗 体 産 生 増 強 作 用 を ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ で 検 索 す る こ と、 また、

同 じ ハ イ プ リ ド ー マ を 使 用 し て 毒 性 検 定 を 行 う こ と の 2 点 に つ い て 検 討 し た の で 、 以 下 に 述 べ る 。

第 2 節 実 験 材 料 及 び 方 法 : ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ H B 4  C 5 を 用 い た 実 験 系 に つ い て

第 1項 細 胞 及 び 培 養

実 験 に は 、 ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ H B 4 C 5細 胞 を 主 に 用 い た 。 H B 4  C 5 細 胞 は 、 高 い 融 合 率 を 持 つ ヒ ト 型 親 細 胞 株 で あ る N A  T  ‑ 3  0 と、 肺 ガ ン 患 者 の リ ン パ 球 と を 融 合 し て 作 製 さ れ 3 5)、 肺 癌 細 胞 35)及 び 組 織 7 1 ) に 特 異 的 な 免 疫 抗 体 1 g M を 産 生 す る 。 本 細 胞 は 、

ヒ ト 肺 ガ ン 特 異 的 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 1 g M を 産 生 す る。 培 養 に は 、 1 0μg/mlイ ン シ ユ リ ン 、 35μg/mlト ラ ン ス フ ェ リ ン 、 10m門 エ タ ノ ー ル ア ミ ン 、 2.3m門 亜 セ レ ン 酸 ナ ト リ ウ ム

(1 T E S )  

34)を 添 加 し た

E R D F

培 地

〈 極 東 製 薬 〉 を 用 い 、 培 養 は 、 3 7 

o c

^{、 C 0 2 5 % の イ}

/ ケ

ン キ ユ ベ ー タ 内 で 行 っ た 。

第 2 項 細 胞 増 殖 度 の 測 定

細 胞 数 は 細 胞 計 測 機 (Ce11  Counier;  Cou 1 ter  cou‑

nter ZBi)を 用 い て 計 測 し た 。 生 細 胞 率 は 、 ト リ バ ン ブ ル ー で 染 色 さ れ る も の 生 細 胞 と し 、 そ の 総 細 胞 数 に 対 す る 割 合 で 求 め た 。

第 3 項 ス ク リ 一 ン グ 法

通 常 の ス ク リ ー ニ ン グ は 、 P  B S に 溶 解 後 、 適 宜 希 釈 し た サ ン プ ル を 24ウ エ ル プ レ ー ト に 100μl、 400μ￨ 

の E R D F培 地 を 分 注 、 さ ら に 1.OX 105cell_s/ mlの 密 度 に 調 製 し た 細 胞 500μiを ま き こ ん で 、 1 T E S を 添 加 し た 後 、 C 0 2イ ン キ ユ ベ ー タ 内 で 3 7 

o c

^{、 2 日 間 培}

養 す る こ と で 行 っ た 。 培 養 終 了 後 、 培 養 上 清 の 抗 体 量 を 後 述 の E L  1 S A 法 で 測 定 し 、 細 胞 数 を 計 測 し て 、 コ ン ト ロ ー ル と の 相 対 細 胞 数 、 相 対 抗 体 重 、 相 対 抗 体 産 生 量 を 求 め た 。

カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 等 で 精 製 し た 微 量 の サ ン プ ル に つ い て は 、 蒸 留 水 で 溶 解 し 、 9 6 ウ エ ル プ レ ー

/ C Z '  

ト に

100μ!

ず つ 分 注 、

2X 10 5 cel ls/  m l

密 度 の 細 胞 (

1  T  E S ‑ E R D F )  100μl

を ま き こ ん で

6

時 間 情 養 後 、 抗 体 重 の み E L  1 S A 法 で 測 定 す る 方 法 で 検 定 し た 。

第 4 項 抗 体 重 の 測 定 (E L  1 S A 法 〉

抗 体 は 、 抗 ヒ ト 1 g M 抗 体 ( T

a 

g 0 4 3 0 2 )、 ベ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 抗 ヒ ト 1 g M 抗 体 (T 

a 

g 0  4 

5 0 2 ) を 用 い た 。 まず、 9 6 ウ エ ル の E L  1 S A プ レ ー ト に

50mM

炭 酸 緩 衝 液 (

p H 

9.6) で

1 000

倍 希 釈 し た 抗 ヒ ト

1 g  M

抗 体 を

100μl

ず つ 分 注 し て 3

7  o c

^に

¹

時 間 保 温 し て 抗 体 を 結 合 さ せ た 後 、 余 分 の 抗 体 を 捨 て 、

0.05%

の

T

w 

e e  n 20

を 含 む 生 理 リ ン 酸 緩 衝 液 (

T  P  B 

S ) で 3 回 洗 浄 し た 。 つ ぎ に 、 非 特 異 的 吸 着 を 防 ぐ た め、 4 倍 希 釈 し た プ ロ ッ ク エ ー ス 〈 雪 印 乳 業 〉 を 各 ウ エ ル に

300μl

ず つ 添 加 し 、 3 

7  o c

^に

1

時 間 保 温 し た 。 つ い で T P B  S で 3 回 洗 浄 後 、 各 サ ン プ ル の 培 養 上 清 を 適 宜 希 釈 し て

50μ￨

ず つ 添 加 し 、

1

時 間 保 温 し た 。 そ の 培 養 上 清 を 捨 て T P B S で 3 回 洗 浄 し て 、 ブ ロ ッ ク エ ー ス で 1 0 0 0倍 希 釈 し た ベ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 抗 ヒ ト

1 g M

抗 体 を 各 ウ エ ル に

100μ￨

ず つ 添 加 し 、

1

時 間 保 温 し た 。

T P B S

で 3 回 洗 浄 し 、 基 質 溶 液 (

0.03 

% H 2 0 2お よ び 0.3mg/mJ  p‑2

，

2'‑azino‑di ‑(3‑ethyl‑

benzotiazol i ne‑6^・sulfonic acid)‑diammonium  sulf^自 ate含 有 0.1M ク エ ン 酸 緩 街 液 〉 を 各 ウ エ ル に 100μ l添 加 し て 3 7 

o c

で 発 色 さ せ 、 1 .5%シ ユ ウ 酸 で 反 応 、 を 止 め

た後、 マ イ ク ロ プ レ ー ト 用 分 光 光 度 計 を 用 い て 4 1 5

n m 

に お け る 吸 光 度 を 測 定 し た 。 保 温 の 際 に は 乾 燥 を 防 ぐ た め 、 F 

a 

1 

c 

0 

n 

3 0 7 3で シ ー ル し た 。 標 準 品 と し て ヒ ト 血 清 g 

M 

( ミ ド リ 十 字 社 〉 を 用 い 、 検 量 線 (0‑‑‑ 80ng/ m 1) を 作 成 し 、 培 養 上 清 中 の 抗 体 量 を 求 め た 。

第 3 節 結 果

第 1項 長 適 培 地 の 選 定

4 種 類 の 培 地 ( E  R D F、 D ‑ M E M、 D  F、 H 

a 

立1 S  F  1 2 ) を 用 い て 、 H  B 4 C 5 細 胞 生 育 最 適 培 地 を 選 定 し た 。 E  R D F 培 地 以 外 の 培 地 は 日 水 製 薬

〈 株 〉 製 を 用 い た 。 D F 培 地 は 、 D ‑ M  E M と F 1 2  を 1:  1に 混 合 し た も の 、 E R  D F j:音地は、 R P M 

1 6 4  0、 D  ‑ M  E M、 F 1 2 を 2: 1 に 混 合 し 、 ア ミ ノ 酸 、 ビ タ ミ ン を ヲ 虫 イ ヒ し た 培

t

也 で あ る 。

J 乙 ρ

第 1 図は、 1 T E  S 添 加 培 地 、 第 2 図 は F R S  5 %  添 加 培 地 の 細 胞 増 殖 お よ び 抗 体 産 生 量 の 経 日 的 変 化 を 示 し た 。 1 T E  S 添 加 で は 、 最 小 基 礎 栄 養 培 地 で あ る

D ‑ M E M が 細 胞 増 殖 、 抗 体 産 生 と も 最 も 低 か っ た 。

E R D F

は、 ま き こ み 初 期 の 細 胞 増 殖 、 抗 体 産 生 と も 最 も 高 い 値 を 示 し 、 H B 4 C 5 細 胞 を 用 い た 検 定 を 行

う 際 に は 適 し た 培 地 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 5

% 

F  B  S 添 加 で は 、 細 胞 増 殖 に お い て E R  D F が ま き こ み 初 期 の 増 殖 を 促 進 し た が 、 他 に 培 地 に は 大 き な 差 異 は 認 め ら れ な か っ た 。 1 g M 量 で は D ‑ M E M が 最 も 低 く、 細 胞 数 に 比 例 し て

E R D F

が 最 も 高 い 値 を 示 し た 。

動 物 細 胞 の 培 養 に は 通 常 グ ル コ ー ス が 添 加 さ れ て い るが、 細 胞 の 増 殖 や 抗 体 産 生 に グ ル コ ー ス が 最 適 で あ る か ど う か は 不 明 で あ る 。 そ こ で 、 供 試 細 胞 の 糖 質 利 用 性 を 調 べ る た め 、 各 種 糖 類 を 10111門 及 び 20m門 と な る よ

う に グ ル コ ー ス フ リ ー 培 地 及 び グ ル コ ー ス 半 量 生 (10m門〉 培 地 に そ れ ぞ れ 加 え て 細 胞 を ま き こ ん だ 。 数 値 は 、 対 照 区 に 対 す る 相 対 細 胞 数 、 相 対 1 g M 童、 相 対 1 g M  生 産 量 〈 細 胞 10 5個 当 り の 1 g M 量 ) で 表 示 し た 。 第 1 表 に 示 す よ う に 、 グ ル コ ー ス に 比 べ 、 供 試 し た 糖 類 は す べ て 、 増殖、 抗 体 産 生 支 持 能 が 劣 っ た が 、 そ の な か で、 フ ラ ク ト ー ス を 添 加 し た 場 合 は 抗 体 産 生 支 持 能 が

2/ 

ト4

C

コ

.t. 

ト4

し心

ト‑4

0 

ト4

(J..) 

C e l l  d e n s i t y  ( c e l l s / m l )  

円 ︒

^日₍

)

(﹀ )

り・ 玄何 去

り司 間河 口問 り

HH{

一

N

γ口UA

IgM c o n c e n t r a t i o n  ( n g / m l )  

目 ︒ _{円 ︒}

第 1図 ITES

添加各種培地での

HB4C5

細胞の増殖及び抗体産生の経目的変化

(A) 

:細胞数、

(B) 

:抗体重

C e l l  d e n s i t y  ( c e l l s / m l )  

日O

目 ︒

..̲. 

o 

、 。

ト4

(﹀ )

υa 

IgM c o n c e n t r a t i o n  ( n g / m l )  

目 ︒

戸

H

O N  

HOU 

ト4

(切 )

(J..) 

υ1 

︑ 刈

(凶印﹀アω

第

2図 FBS5%添加各種培地での HB4C5細胞の増殖及び抗体産生の経目的変化

(A)  :細胞数、 (B)  :抗体重

O:ERDF 、 ・ :MEM 、ロ: D‑ " MEM 、 6:F12 、 . A DF 培地。

之

3

第

1

表 ヒト型ハイブリドーマ

flB4C5

細 胞 の 増 殖 及 ひ 1 g M抗 体 産 生 に 与 え る 糖 頬 の 影 響

相 対 細 胞 数 * 相対抗体亙:*

1 1 1

対 抗 体生産量本

( 1 0

⁵ '1出当りの抗体蛍〉

( G l c ‑ f r e e  m e d i a )  

G l u c o s e   2 0 m

門 1.

0 0  

1.

0 0  

1.

0 0   G a l a c t o s e  2 0 m

門

0 . 6 4   0 . 3 3   0 . 5 1  

ト

1 a n n o s e2 0 m

卜

1 0 . 4 5   0 . 7 6   1 . 6 8   A r a b i n o s e  2 0 m

門

0 . 4 4   0 . 1 3   O .

:2

D  X y l o s e  2 0 m

門

0 . 4 1   0 . 1 2   0 . 2 0   F r u c t o s e  2 0 m

↑卜

0 . 8 2   0 . 9 3  

1. 

1 

~S 門

a l t o s e2 0 m

門

0 . 5 0   0 . 1 1   0 . 2 2  

R h a m n o s e  2 0 m

ト

1 0 . 4 9   0 . 1 7   0 . 3 ' 1  S a c c h a r o s e   2 0 m

門

0 . 4 4   0 . 1 0   0 . 2 2   G a l a c t u r o n i c  a c i d   2 0 m

門

0 . 6 1   0 . 3 4   0 . 5 5  

ト

1 a n n i 

.10 

120m

門

0 . 4 8   0 . 1 0   0 . 2 0   ( G l c   1 0 m

^門

m e d i a )

G l u c o s e   1 0 m

門 1. 

0 0   1  . 0 0   1 . 0 0   G a l a c t o s e   1 0 m

^門 1.

0 6   0 . 9 f i   0 . 0 1  

ト

1 a n n o s e1 0 m

門

0 . 8 7  

，]

1 5  

1.

1 8   A r a b i n o s e   1 0 m M  

_1. 

1 0  

1.

2 3  

1.

1 1   X y l o s e   1 0 m

門 1.

0 7  

1.

1 8  

_1.

1 0   F r u c t o s e   1 0 m

門 1. 

1 1  

1.

2 6  

1. 

1

 :S

門

a l

.1

o s e 1 0 m

ト

1

_1. 

0 4   O . D G   0 . D 2   R h a m n o s e   1 0 m

門 1.

0 8   0 . 8 D   0 . 8 2   S a c c h a r o s e   1 0 m

^門

0 . 9 G   O . D O   0 . D 3   G a l a c t u r o n i c  a c i d   1 0

lJt

M 

_1.

0 0  

1. 

; : ) 3  

_1. 

5

 :1 ト

1 a n n i  t o   I  1 0 1 1 1

門 1. 

0 8  

1.

4 5   1 . 3 4  

一 一 一 一 一 一

HB4C5

細 胞

( 5

X 

1 0

⁴個

I m l )

は、

lTES‑EHDF

培地中で

2 r J

間 出 義ーした。

*サンプルの替わりに

PBS

を 添 加 し た コ ン ト ロ ー ル に 対 す る 相 対 値。

ユ 4

高 く 保 持 さ れ 、 細 胞 当 り の 抗 体 産 生 は か え っ て 増 大 し た。 こ の 傾 向 は 、 マ ン ノ ー ス に お い て さ ら に 顕 著 で あ り、 相 対 1 g M 産 生 量 は 高 か っ た が 、 細 胞 増 殖 の 阻 害 : が 大 き い の で 実 際 の 使 用 に は 適 さ な い と 判 断 さ れ た 。

グ ル コ ー ス 半 量 培 地 で は 、 増 殖 に 影 響 を 及 ぼ す 糖 質 は 見 い だ さ れ な か っ た が 、 ガ ラ ク ツ ロ ン 酸 及 び マ ン ニ

ト ー ル 添 加 で 抗 体 産 生 が 約 30‑‑‑ 50%増 強 さ れ た 。

第 2 J頁 単 糖 類 の 細 胞 増 殖 、 抗 体 産 生 に 及 ぼ す 影 響

単 糖 類 は 、 平 日 光 純 薬 〈 株 〉 製 を 用 い た 。 単 糖 類 は 、 1お よ び 10m門 の 濃 度 で 添 加 し た E R D F 培 地 に 細 胞 を ま き こ み 、 細 胞 増 殖 お よ び 抗 体 産 生 に 与 え る 影 響 を 調 べ た。

結 果 は 第 2 表 に ま と め た 。 各 種 糖 類 を 20m門 グ ル コ ー ス を 含 む E R  D F 培 地 に 1m、門 10m門 濃 度 で 添 加 し た 場 合 、 多 く の 糖 類 は H B 4  C 5 細 胞 の 増 殖 お よ び 抗 体 産 生 量 に は 影 響 を 与 え な か っ た 。 た だ し 、 10m門 グ ル ク ロ ン 酸 添 加 が 、 細 胞 数 を 、 1 m門 及 び ガ ラ ク ト ー ス 及 び 10m門 マ ン

ノ ー ス の 添 加 が 抗 体 産 生 を わ ず か に 増 強 し た 。

z r ;  

第2表 各 種 糖 類 のHB4C5細 胞 に お け る 増 殖 及 び 抗 体 産生へ の 影響

一 一 一 一 一 一

添加重 相支

1 * ‑

llI

l f

包数 ^{相 対j}J[1本当士 相対抗体外ミ1不当;

( m

〉門

Glucose  1.11  1.12  1.00  10  1.11  0.96  0.8G  Galactose  1.10  1.28  1.16  10  1.05  1.28  1. 21  Mannose  1.00  1.09  1.06  10  1.05  1.32  1.24  Arabinose  0.97  1.03  1.06  10  1.10  0.90  0.81  Xylose  0.D4  0.87  0.D3  10  1.07  0.D6  0.8D  Rharnnose  1.07  1.00 

o .  

a~~

10  1.1G  0.D1  0.78 

Fucose  1.10  0.81  0.7~

10  1.14  0.84  0.74  Fructose  0.99  1.02  1. 0 1 

10  1.04  0.91  0.86  Sorbitol  0.D1  1. 0 1  1. 10  10  1.05  1.25  1.18  ト1anni to I  1.05  1.18  1.11  10  1.05  1.19  1.12  Du I c i to I  0.95  0.86  0.90 

10  1.03  0.7~ 0.71 

Gluconic acid  1.00  0.88  O.BO  10  1.02  0.90  O.QO  Glucuronic acid  0.88  0.68  0.78  10  1.33  0.95  O. 7:~

Galaturonic acid  1.00  0.89  0.81  10  1.01  0.74  0.74 

Cellobiose  0.98  0.85  0.88 

10  1.08  0.82  0.77  Raffinose  1 .04  0.72  0.70  10  1.05  0.67  0.65  Trehalose  1.05  O.Dl  0.88  10  1.04  0.86  0.84  D‑glucosarnine  0.98  0.D6  0.9D  10  0.74  0.81  1. 11  Sorbose  1.01  0.9D  1.00  10  0.84  0.87  0.94 

一 一 一 一 一 一 一 一 一 一一 一

ュ ら

第 3 項 多 糖 類 、 食 物 繊 維 の 細 胞 増 殖 、 抗 体 産 生 に 及 ぼ す 影 響

ア ル ギ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 、 κ ー カ ラ ギ ー ナ ン 、 入 ー カ ラ ギ ー ナ ン 、 カ ー ド ラ ン 、 シ ト ラ ス ベ ク チ ン 、 デ キ ス ト ラ ン 硫 酸 カ リ ウ ム は 和 光 純 薬 ( 株 〉 、 ガ ラ ク ツ ロ ン 酸、 ア ラ ビ ア ガ ム 、 ロ ー カ ス ト ビ ー ン ガ ム 、 ベ ク チ ン 酸 ナ ト リ ウ ム は Sigma社、 グ ル コ マ ン ナ ン は General N u t r i t i 0 n 社、 ア ラ ビ ノ ガ ラ ク タ ン は Extrasynthese社、 ガ ラ ク タ ン は Aldrich Chemical社、 キ サ ン タ ン ガ ム は Jungbunzlauer社 製 を 用 い た 。 キ ト サ ン は 加 ト 吉 ( 株 ) よ り 提 供 を 受 け た 。

第 3 表 に 示 し た よ う に 、 多 糖 類 は 、 顕 著 な 細 胞 増 殖 は 示 さ な か っ た 。 一方、 抗 体 産 生 は カ _{ド ラ ン 、 デ キ} ス ト ラ ン 硫 酸 、 ア ル ギ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 、 キ シ ラ ン で 阻 害 さ れ 、 ロ ー カ ス ト ビ ー ン ガ ム 、 シ ト ラ ス ベ ク チ ン 、 キ サ ン タ ン ガ ム 、 キ ト サ ン で 促 進 さ れ た 。

第 4 項 ロ ー カ ス ト ビ ー ン ガ ム 及 び ベ ク チ ン の 添 加 量 に よ る 細 胞 増 殖 と 抗 体 産 生 へ の 影 響

第 3 項で、 1 P S F 活 性 の 認 め ら れ た 、 ロ ー カ ス ト

2 7  

第3表 各種多熔類のHB^LIC5細 胞 に お け る 増 姑 及 ひ 抗 体 産 生への 彫誉

一 一 一 一 一 一

添加重 相 対 細 胞 数 相 対 抗 体 量 相対抗体生産量:

〈μg/ml)

一 一 一 一

Arab i c gum  100  1.10  0.81  O.日2 1000  1.09  1.23  1.12  Arab i noga I actan  100  1. 00  0.9Q  O.リ!1 1000  1. 07  0.80  0.74  κ‑carrageenan  100  0.94  O.Q!)  1.0;‑)  1000  0.97  0.90  0.Q2 

入‑carrageenan 100  0.99  0.63  0.63  1000  0.86  0.64 

0 . 7

^L}  Chitosan  1. 23  7.30  5.83 

10  0.67  4.41  6.58  Curdlan  50  0.99  0.59  0.59  500  0.83  0.55  0.s6  Dextran sulfate  100  1. 01  0.59  0.58  1000  1. 04  0.44  0.42  Galactan  100  0.95  0.9;)  1.00  1000  0.85  1.04  1.22  Glucomannnan  50  0.94  0.87  0.87  500  0.84 

o . r m  

1.04  LocustLJean  gum  100  1. 35  2.51  1.85  1000  1. 72  5.43  :S. 15  Pect i n  100  0.94  1 . 1/1  1. 21  1000  0.97  2.33  2.40  Pect i c ac i d  100  0.Q2  0.71  0.77  1000  0.8D  0.72  0.80  Sodiuln alginate  100  1. 03  0.70  0.68  1000  1.03  0.7G  0.7 3: Xanthan gum  100  0.93  1.56  1.67  1000  0.B6  1. 51  1.57  Xylan  100  0.98  0.63 

0 . 5

^L} 

1000  0.83  0.53  0.47 

2g 

ビ ー ン ガ ム 及 び ベ ク チ ン の 添 加 量 に 対 す る H I3  4 C 5  細 胞 増 殖 お よ び 抗 体 産 生 量 を 調 べ た 。 第

3

図 に 示 し た よ う に 、 ベ ク チ ン は 、 ほ と ん ど 細 胞 増 殖 作 用 を 示 さ ず 、 500μg / 

m 

1以 上 の 添 加 で は じ め て 抗 体 産 生 の 増 加 が 認 め ら れ 、 lmg/ ml 添 加 で 無 添 加 の 約 2. 5 倍 の { 直 を 示 し た。 ロ ー カ ス ト ビ ー ン ガ ム は 、 高 濃 度 で わ ず か な 細 胞 増 殖 促 進 作 用 を 示 し た 。 また、 200μg / 

m 

1以 上 の 添 加 で 抗 体 産 生 の 増 強 が み ら れ 、 1 m g / m 1の 添 加 で 無 添 加 の 3倍 強 の 値 を 示 し た 。

第 5 項 フ ェ ノ ー ル 化 合 物 類 の ラ ッ ト D N A 切 断 試 験 と H B  4  C 5 細 胞 を 用 い た 検 定 と の 比 較

山 田 ら は 、 精 製

D N A  ( 

i n v i t ro ) 及 び 培 養 ほ 乳 類 細 胞 を 用 い て ボ リ ブ エ ノ ー ル 類 の D N A 切 断 試 験 を 行 い、 多 く の ブ エ ノ ー ル 化 合 物 が D N A 切 断 能 を 有 す る こ と を 確 認 し て き た ^{3 2 • 3 3 • 5 6 • 6 6)} 。 そ こ で 、 ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ 細 胞 を 用 い て 、 D  N A 切 断 試 験 と の 比 較 を 行 い 、 ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ を 用 い た 検 定 法 の 物 質 の 安 全 性 検 定 代 替 へ の 可 能 性 を は か っ た 。

1

共 試 物 質 は 、 カ テ コ ー ル 、 レ ゾ ル シ ノ ー ル 、 ハ イ ド ロ キ ノ ン 、

o 

‑ア ミ ノ フ ェ ノ ー ル 、 旦二一ア ミ ノ ブ ヱ ノ ー ル 、 立 二 フ ェ ニ レ ン

2 f  

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‑+F‑・J4  c'j 

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‑に+←CdLF‑吋.〉J S4 4 

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0 ^4『吋

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O 

'1"'"ー・4 '1"'"田・4

<1.) 

。 I  I  υ 

1 0 0   1 0 0 0  

o  1  1 0  

( μ g / m l )  

胞

絢

5  C  4  B  H  る よ

ン

チhノ

ベ び 及 ム

ガ

ン

ピ' h

ス

a  

カ

一

量

生 る

ロ産

体 な 抗 異 び

量 の及 殖

加 増 添 の

図

つ り

第

6: ベクチン添加時の細胞数、.A:ローカストビーンガム添加

11

寺の細胞数

0: ベクチン添加時の抗体重、・:ローカストビーンガム添加時の抗体量

ジ ア ミ ン 、 旦二ブ エ ニ レ ン ジ ア ミ ン 、 旦二ブ エ ニ レ ン ジ ア ミン、 ビ ロ ガ ロ ー ル 、 没 食 子 酸 、 コ ー ヒ ー 酸 、 o 

‑クマ

リ ン 酸 、 フ ヱ ル ラ 酸 、

L 

‑ドーパ、 ド パ ミ ン 、 エ ビ ネ プ リ ン 、 ノ ル エ ビ ネ プ リ ン 、 メ タ ネ プ リ ン (Sigma)。 基 本 骨 格 は 、 第 4 図に、 官 能 基 は 第 4 表 中 に 示 した。

結 果 は 、 第 4 表 に 示 し た 。 単 純 ボ リ ブ ヱ ノ ー ル 類 の 中 では、 o ‑ 及 び 旦 二 誘 導 体 、 例 え ば カ テ コ ー ル や ハ イ ド ロ キ ノ ン と い っ た 物 質 は 、 強 い D N A 切 断 活 性

v 

i V 0 )  を 刀 て し た が 、 m ‑ 誘 導 体 〈 レ ゾ ル シ ノ ー ル 〉 は 切 断 活 性 は 示 さ な か っ た 。 ア ミ ノ フ 工 ノ ー ル や フ ェ ニ レ ン ジ ア ミ ン の D N A 切 断 活 性 も 立 二 及 び 旦二誘 導 体 で 見 ら れ た が 、 そ の 活 性 は ジ フ ェ ノ ー ル に 比 べ て 低 い も の だ った。 し か し 、 H  B  4  C 5 細 胞 で の 細 胞 増 殖 や 1 g M  産 生 の 阻 害 効 果 で は ジ ブ ヱ ノ ー ル 類 と 同 等 の 強 さ が 観 察 さ れ た 。 ビ ロ ガ ロ ー ル や 没 食 子 酸 と い っ た ト リ ブ エ

ノ ー ル は 、 H  B  4  C  5 細 胞 に は 非 常 に 毒 性 が 強 く 、 _'^、，_‑^ヲ_‑ れ は

D N A

切 断 試 験 (i 

n 

V i t 

r  o 

) で 得 ら れ た 結 果 と 同 様 で あ っ た 。 カ テ コ ー ル ア ミ ン の 場 合 、 す べ て の ジ フ ヱ ノ ー ル 類 は 強 い D N A 切 断 能 (i 

n v 

i t 

r  o 

) を 有 す る 。 そ の 中 で も 、 エ ビ ネ フ リ ン や ノ ル エ ビ ネ プ リ ン は ラ ツ

ト 胎 児 肺 細 胞 の D N A も 切 断 す る が 、 L ‑ ド ー パ は 切 断 し な い 。 こ の カ テ コ ー ル ア ミ ン 類 の 細 胞 D N A 切 断 能

3 1  

Rl 

H  ^R2 

Rs  R3 

R4 

第 4 図 フェニル化合物の基本骨格

3   ， 2