の 測 定 を 行 っ た 。
A M D
添 加 重 等 を 変 え て 試 験 し た と ころ、 ε ー ボ リ リ ジ ン は 細 胞 内 抗 体 重 と 関 わ り な く 積 極 的 に 膜 外 に 抗 体 を 放 出 し 、 キ ト サ ン は 膜 内 抗 体 重と あ る 程 度 関 連 し つ つ 、 膜 外 に 抗 体 を 放 出 す る こ と を 促 進 す る 効 果 の あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 また、 キ ト サ ン、 ε ー ボ リ リ ジ ン と も A M D を 添 加 し で も 抗 体 重 が コ ン ト ロ ー ル よ り 増 加 し て い た の で 、 翻 訳 安 定 性 を 持 っ と 考 え ら れ る 。
また、 ア セ チ ル コ リ ン エ ス テ ラ ー ゼ で は 、 は っ き り し た 結 果 が 得 ら れ な か っ た の で 、 今 後 検 討 し た い 。
生 理 活 性 ペ プ チ ド の 1種 で あ る グ ラ ミ シ ジ ン
s
(シク ロ ー (Va卜 Orn‑Leu‑D‑Phe‑PrO)2) は、 強 い 抗 菌 活 性 を 持 っ た 環 状 デ カ ペ プ チ ド で 、 抗 菌 活 性 は 、 感 受 性 菌 の 細 胞 膜 の 透 過 性 増 大 に 起 因 し て い る と さ れ て い る 。 グ ラ ミ シ ジ ン S は、 添 加 量 が 増 加 す る に 従 い 、 膜 構 造 が 大 き な 歪 を う け 、 つ い に 安 定 な 構 造 を 維 持 で き な く な っ て 膜 損 傷 を 生 じ る 。 こ れ に よ り 透 過 性 が 増 加 し 、 膜 の 断 片 も 遊 離 し て く る 21)。 ペ プ チ ド 処 理 後 に 遠 心 分 離 し た 上 清 の リ ン 脂 質 や 膜 酵 素 ア セ チ ル コ リ ン エ ス テ
ラ ー ゼ の 遊 離 が 認 め ら れ て い る 。 ペ プ チ ド が 膜 に 侵 入 す る と 不 安 定 な 構 造 に な る 、 こ れ は 次 の 様 に 考 察 さ れ て い る 。 親 水 性 残 基 が ベ フ チ ド の 親 油 性 膜 内 部 を 横 切
る 速 度 を 遅 延 さ せ 、 ペ プ チ ド を 2 重 膜 の 外 側 方 向 に 優 先 的 に 蓄 積 さ せ る 。 こ の ア ン バ ラ ン ス な 蓄 積 が 膜 構 造 に 歪 を 起 こ さ せ る と し て い る 。 し か し 、 こ の よ う な 膜 と 相 互 作 用 す る 生 理 活 性 ペ プ チ ド は 、 疎 水 性 ア ミ ノ 酸 基 と 親 水 性 ア ミ ノ 酸 基 と を 反 対 に 向 け た 両 親 媒 性 構 造 を と っ て い る こ と が 多 い 。 こ の 理 論 が す ぐ ボ リ カ チ オ ン に 応 用 で き る わ け で は な い 。 だが、 ボ リ リ ジ ン 処 理 に よ り 細 胞 膜 に 選 択 的 な 穴 の 形 成 が 見 ら れ る 〈 タ バ コ 〉 こ と も 報 告 さ れ て お り 4 9)、 今 後 こ れ ら の 研 究 に ヒ ン ト を 得 て ε ー ボ リ リ ジ ン 及 び キ ト サ ン が 細 胞 膜 に ど の よ う な 影 響 を 与 え 、 最 終 的 に は 抗 体 産 生 を 増 強 し て い く の か さ ら に 研 究 を 進 め る 必 要 が あ る 。
第 5 節 小 括
キ ト サ ン は 、 培 養 初 期 よ り 膜 外 の 抗 体 重 を 増 大 さ せ た。 こ れ は 、 キ ト サ ン が 抗 体 の 膜 透 過 性 を 促 進 し て い る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。 し か し 、 ア ク チ ノ マ イ シ ン
D
を 用 い た 転 写 阻 害 実 験 で は 、 ε ー ボ リ リ ジ ン は 細 胞 内 抗 体 量 と 関 わ り な く 、 積 極 的 に 膜 外 に 抗 体 を 放 出 し 、 キ ト サ ン は 膜 内 抗 体 重 と あ る 程 度 関 連 し つ つ 、 膜 外 に 抗 体 を 放 出 す る こ と を 促 進 す る 効 果 の あ る こ と が 示 唆/9
8"さ れ た 。 また、 キ ト サ ン 、 ε ー ボ リ リ ジ ン と も A M D を 添 加 し で も 抗 体 重 が コ ン ト ロ ー ル よ り 増 加 し て い た ので、 翻 訳 安 定 性 を 持 っ と 考 え ら れ る 。
第 9 章 多 糖 類 及 び ボ リ カ チ オ ン に よ る イ ン タ ー フ エ ロ ン
P
産 生 調 節第 1節 緒 言
イ ン タ ー フ エ ロ ン ( r F N ) 2 3 ) は ウ ィ ル ス 感 染 、 抗 原 感 作 お よ び 種 々 の 化 学 誘 起 剤 に よ っ て 細 胞 か ら 合 成
さ れ る 一 群 の タ ン パ ク お よ び 糖 タ ン パ ク で あ る 。 イ ン タ ー ブ エ ロ ン は 種 々 の 刺 激 に 応 じ て ほ と ん ど 全 て の 真 核 細 胞 か ら 生 産 さ れ 、 同 種 お よ び 異 種 の 細 胞 に 作 用 す る こ と が で き る 。 イ ン タ ー フ エ ロ ン の 作 用 は 動 物 種 に 特 異 的 で あ る 。 イ ン タ ー フ エ ロ ン は そ れ ら の 抗 原 特 性 物 理 化 学 的 特 徴 等 に よ っ て
3
種 〈α ，s ，
γ ) に 分 類 さ れる。 白 血 球 は 主 と し て 1 F N‑α
を、 線 維 芽 細 胞 は1 F N ‑
s
を， T ‑ リ ン パ 球 は 1 F N ‑ γ を 生 産 す る 。 /1 F N は き わ め て 多 面 的 な 生 物 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質 で あ る が 抗 ウ ィ ル ス 作 用 6o )が 最 も よ く し ら べ ら れ て い る 。 ヒ ト が ウ ィ ル ス 感 染 を 受 け る と 、 そ の 細 胞 か
ら ウ ィ ル ス の 侵 入 を 示 す タ ン パ ク 質 で あ る 1 F N が 生 産 ・分 泌 さ れ 他 の 細 胞 へ と 伝 達 さ れ る 。 1 F N 自 身 に は 抗 ウ ィ ル ス 活 性 は な い が 、 そ れ を 生 産 し た 細 胞 の み な ら ず 伝 達 を 受 け た 細 胞 に お い て 数 種 類 の 抗 ウ ィ ル ス
/ L l O
タ ン パ ク 質 の 合 成 を 促 進 し 、 間 按 的 に 抗 ウ ィ ル ス 状 態 へ と 誘 導 す る 。
イ ン タ ー フ エ ロ ン は 生 体 防 御 を 構 成 す る 凶 子 と し て は 侵 入 し た 抗 原 に 対 し て 非 特 異 的 に 作 用 す る 非 特 異 的 液 性 因 子 の 一 つ で あ る 。 し た が っ て 一 般 に は 異 物 侵 入 後 の 一 連 の 生 体 防 御 反 応 の 初 期 に 異 物 侵 入 局 所 に 現 わ れる。 イ ン タ ー ブ エ ロ ン は 極 め て 多 様 の 生 理 機 能 を 有
し て お り 7， 9 ， 1 5 • 2 7 ， 6 2)、 抗 原 に 対 す る T 細 胞 応 答 、 サ プ レ ッ サ ー 細 胞 活 性 の 制 御 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 、 ナ チ ユ ラ ル キ ラ ー (N K ) 細 胞 の 活 性 の 誘 導 ま た は 増 強 を 行 う こ と が 知 ら れ て い る 。 具 体 的 に は 、 細 胞 構 造 の 変 化 、 酵 素 誘 導 お よ び 阻 害 、 内 因 性 物 質 の 量 的 変 動 ・ 放 出 へ の 影 響 、 タ ン パ ク 質 の 誘 導 合 成 、 キ ラ ー T 細 胞 の 活 性 化、 ヘ ル パ ー T 細 胞 の 活 性 化 、 B 細胞、 N K 細胞、 キ ラ ー T 細胞、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 等 の Fcレ セ プ タ ー を 有 す る 細 胞 の 機 能 調 節 、 N K細 胞 に 対 す る が ん 細 胞 の 低 抗 性 獲 得 、 N K 細 胞 活 性 の 増 強 、 ADCC(antibody depend ent cel I ‑med iated cytotoxici ty)の 増 強 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 貧 食 能 昂 進 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ の が ん 細 胞 障 害 性 の 増 強 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 抗 原 提 示 能 へ の 影 響 (I F N ‑
γ に よ る マ ク ロ フ ァ ー ジ の 抗 原 提 示 能 の 誘 導 ) 、 キ ラ ー T細 胞 へ の 作 用 、 B 細 胞 の 抗 体 生 産 へ の 作 用 、 サ プ レ
ツ サ ー T 細 胞 の 分 化 の 調 節 、 好 塩 基 球 へ の 作 用 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 分 化 誘 導 、 赤 血 球 系 細 胞 の へ モ グ ロ ビ ン 生 産 細 胞 へ の 分 化 誘 導 の 促 進 ( 低 濃 度 ) と 抑 制 〈 高 濃 度 〉 、 キ ラ ー T 細 胞 の 分 化 誘 導 、 N K細 胞 の 分 化 誘 導 、 抗 体 生 産 細 胞 へ の 分 化 の 抑 制 、 筋 肉 細 胞 の 分 化 誘 導 、 脂 肪 細 胞 の 分 化 阻 害 な ど 生 体 の 恒 常 性 ( ホ メ オ ス タ シ ス 〉 に 多 面 的 に 関 わ っ て い る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 食 品 成 分 に よ っ て 体 内 1 N F レ ベ ル が 調 節 で き れ ば 、 食 品 成 分 が 生 体 防 御 を 始 め と す る 体 調 調 節 に 寄 与 す る こ と に なる。 そ の よ う な 理 由 か ら 食 品 成 分 中 の 1 F N 産 生 増 強 因 子 を 倹 索 す る こ と は 意 味 の あ る こ と と 考 え る 。
第 2 節 実 験 材 料 及 び 方 法
第 1項 ヒ ト 骨 肉 腫 細 胞 株 を 用 い た ス ク リ ー ニ ン グ 方 法
細 胞 は 、 ヒ ト 骨 肉 腫 細 胞 株 Osteosarcoma 門G‑63を 使 用 し た 。 本 細 胞 は 、 p 0 1 y ( 1 )
・
p 0 1 y ( C ) 刺 激 に よ り 1 F N ‑‑/ 3 を 産 生 2 9 ) し、 樹 立 細 胞 株 で あ り 初 代 培 養 細 胞 及 び 正 常 繊 維 芽 細 胞 と 比 較 す る と 生 体 内 で の 分 化 機 能 発 現 程 度 が 低 い が 、 遺 伝 的 に は 均 ー で あり、 細 胞 増 殖 も 早 く 、 取 扱 い も 非 常 に 簡 単 で、 再 現 性 も 高 い と い う 利 点 を 持 つo ス ク リ ー ニ ン グ 法 は 次 に 述 べ る と お り で あ る 。 門G‑63を 5 % の F B S を 添 加 し た D M E M培 地 に 2 X 105cells/mlの 細 胞 密 度 で 懸 濁 し 、 供 試 物 質 〈 各 ウ エ ル に 25μ1) を 添 加 し た 24ウ ヱ ル プ レ ー
ト に 500μ!ず つ ま い た 。 3 7
o c
、 5 % C 0 2下 で 2 日 間 培 養 し た 後 、 培 養 上 清 を 除 去 し 、 各 ウ エ ル に 5μg/mlのp 0 1 y ( 1 )
・
p 0 1 y ( C ) (Sigma) 及 び 5μg/mlの シ ク ロ ヘ ミ シ ミ ド 〈 和 光 純 薬 〉 含 育 2 % F B S ‑ D M E M 4 7 5 μ ￨を 壁 面 を す べ ら す よ う に 添 加 し 、 4 時 間 培 養 し た 。 終 濃 度 4ttg/mlの ア ク チ ノ マ イ シ ン D を さ
ら に 添 加 し 、 1時 間 培 養 し た 。 培 養 上 清 を 除 去 し た 後 、 P B S で 2 回 洗 浄 し 、 2
%
F B S ‑ D M E M を 5 0 0 μ 1 /ウ エ ル ず つ 添 加 し て さ ら に 1 2 時 間 培 養 し た 。 培 養 上 清 を 採 取 し 、 1 F N ‑s
の 含 量 を つ ぎ に 述 べ るE L 1 S A 法 で 測 定 し た 。
第 2 項 E L 1 S A 法
マ イ ク ロ プ レ ー ト に は 、 50m M 炭 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液 (p H 9.6) で 2000倍 希 釈 し た マ ウ ス 抗 ヒ ト 1 F N ‑
P
抗 体 〈 ヤ マ サ 醤 油 〉 を 100μlず つ 分 注 し て 4o c
で 1/ L f 3
小 麦 フ ス マ ヘ ミ セ ル ロ ー ス (W B H )は、 第 4 章 ・ 晩 放 置 し た 。 プ ロ ッ ク エ ー ス で プ ロ ッ キ ン グ し た 後 、 培 養 上 清 を 50μ￨ず つ 加 え 、 3 7
o c
1時 間 放 置 、 洗 浄 後 、2000倍 希 釈 ラ ビ ッ ト 抗 ヒ ト IF N ‑
f 3
抗 体 (L E E ) を 100μ￨ず つ 添 加 、 3 7o C
1時 開 放 置 、 洗 浄 後 、 ベ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 ヤ ギ 抗 ラ ビ ッ ト I g G 抗 体 (B I 0・RA D ) を 100μlず つ 分 注 し た 。 洗浄、 基質、 測 定 に つ い て は 第 2 章 ・ 第 2 節 ・ 第 4 項 で 記 述 し た 方 法 で 行 っ た 。第 3 項 小 麦 フ ス マ ヘ ミ セ ル ロ ー ス の 調 製 法
第
2
節 ・ 第2
項 に 記 述 し た 米 ぬ か へ ミ セ ル ロ ー ス 調 製 法 と 問 機 の 方 法 で 調 製 し た 。第 3 節 結 果
第 1項 食 物 繊 維 に よ る I F N ‑ β 産 生 調 節
通常、 正 常 繊 維 芽 細 胞 を 用 い て 、 I F N 産 生 を 行 わ せ る 場 合 、 合 成 二 本 鎖 R N A の p 0 1 y ( I )
・
p 01 y ( C ) を イ ン デ ユ ー サ ー と す る 超 誘 発 法 が 利 用 さ れる。 p 0 1 y ( I )
・
p 0 1 y ( C ) で 刺 激 す る 際に シ ク ロ ヘ キ シ ミ ド を 同 時 に 加 え て レ プ レ ッ サ ー タ ン パ ク 質 合 成 を 阻 害 し な が ら 、 1 F N の n1 R N A 合 成 を 行 な わ せ 、 1 F N の m R N A が 蓄 積 し た と こ ろ で 、 ア ク チ ノ マ イ シ ン D で リ プ レ ッ サ ー タ ン パ ク 質 n1 H N A の 合 成 を 不 可 逆 的 に 阻 害 し な が ら 、 1 F N タ ン パ ク 質 の 合 成 を 開 始 さ せ 、 産 生 力 価 を 上 昇 さ せ て や る 方 法 を 採 用 し た 2 9)。
供 試 物 質 と し て は 、 キ シ ラ ン 、 ベ ク チ ン 、 小 麦 フ ス マ ヘ ミ セ ル ロ ー ス (
W B H
)、 米 ぬ か へ ミ セ ル ロ ー ス ( R B H )、 大 豆 外 皮 へ ミ セ ル ロ ー ス (S H H ) を 用 いた。 R B H 及 び S H H は 第 4 章 で 調 製 し た も の を 用 いた。 第 2 5 表 に 示 し た よ う に 、 W B H 及 び R B H を 除 い た 他 の 食 物 繊 維 は 1 F N ‑f 3
産 生 に 影 響 は 与 え な か っ た 。 W B H は 1 F N ‑s
産 生 を 抑 制 し 、 R B H は 抑 制 す る 傾 向 を 示 し た 。第 2 項 ε ー ボ リ リ ジ ン に よ る 1 N F 一 β 産 生 増 強
供 試 材 料 と し て は 、 前 章 ま で に 強 い 1 P S F活 性 の 観 察 さ れ た キ ト サ ン 及 び ε ー ボ リ リ ジ ン を 用 い た 。 第
2 6 表 に 示 し た よ う に ε ー ボ リ リ ジ ン 〈 酵 素 処 理 な し 〉 の み に 4 倍 強 の 1 F N ‑ β 産 生 増 強 が 認 め ら れ た 。 ε
/μ~-第
25
表 ヒト培養細胞インターブエロン産生に及ぼす影響m e a n
::t S • E •インターフエロン
‑ f 3
食物繊維 (IU/ml)
コントロール 117. 9::t5. 0
キシラン 91. 2::t1. 3 (lmg/ml)
ベクチン 96. 8::t5. 2 (lmg/ml)
小麦フスマヘミセルロース 47. 6::t2. 4 (500μg/m 1)
米ヌカヘミセルロース 65. 6::t2. 9 (500μg/m 1)
大豆外皮ヘミセルロース 107. 2::t4. 6 (500μg/m 1)
/ t . ; 6
第26表 インターフエロン産生に及ぼすボリカチオンの影響
ボリカチオン
コントロール
キトサン
( 1μg / m 1)
εーポリリジン・酵素処理0分 ( 1μg/m 1)
mean:t S. E. インターフエロンー β
( 1 U / m 1 )
117. 9:t5. 0 85. 2:t6. 4
455. 6:t22. 2
εーボリリジン・酵素処理 120分 290. 2:t22. 9 ( 1μg/m 1)
f 牟 7
ー ボ リ リ ジ ン で も 120分 の 酵 素 ( ト リ プ シ ン 〉 処 理 を 行 う と 増 強 活 性 は 、 3 倍 弱 に 低 下 し た 。
第 4 節 考 察
抗 体 産 生 で は 、 キ シ ラ ン は マ イ ナ ス 、 ベ ク チ ン 及 び S H H は プ ラ ス に 調 節 し て い た が 、 そ れ ら の 物 質 は I F N ‑ β 調 節 機 能 は 示 さ ず 、 抗 体 産 生 調 節 を 示 さ な か っ た R B H 及 び W B H が 1 F N ‑ { J 産 生 で 抑 制 調 節 を 示 し た こ と は 、 食 品 成 分 毎 に 機 能 を そ れ ぞ れ 分 担 し あ っ て い る よ う で 、 薬 品 と し て で は な く 、 い ろ い ろ な 成 分 を 食 品 と し て ヒ ト が 摂 取 す る 意 義 を 強 く 感 じ て 興 味 深い。 また、 生 体 機 能 調 節 は 、 プ ラ ス に も マ イ ナ ス に も 働 く 。 そ の た め 、 1 F N ‑
s
産 生 を 抑 制 ( マ イ ナ ス 作 用 〉 す る 成 分 も 将 来 、 積 極 的 に 見 い だ し て い か ね ば な ら な い と 考 え る 。ボ リ カ チ オ ン の 中 で も 特 に 1 P S F 活 性 の 強 い キ ト サ ン 及 び ε ー ボ リ リ ジ ン に つ い て 1 F N ‑ β 産 生 増 強 効 果 を 検 定 し た と こ ろ 、 ε ー ボ リ リ ジ ン に の み 増 強 効 果 が 認 め ら れ た 。 ボ リ リ ジ ン に つ い て は 、 子 豚 に poly ( I ) (