第 2項 溶 解 液 の 相 違 に よ る 1 P S F 活 性 へ の 影 響
キ ト サ ン は 、 水 に は 難 溶 性 の 物 質 で あ り 、 無 機 酸 に 可 溶 で あ る 。 そ の た め 、 供 試 溶 液 の 調 製 に は 、 希 塩 酸 を 使 用 し た 。 キ ト サ ン は 、
10mg/ml
の 濃 度 で ま ず 希 塩 酸 に 溶 解 し た 後 、P B S
で 適 宜 希 釈 し て ス ク リ ー ニ ン グ に 供 し た 。 溶 解 す る 無 機 酸 の 種 類 に よ っ て 結 果 が 異 な る 可 能 性 も あ っ た の で 、 まず、3
種 の 無 機 酸 (10%
乳 酸、5%
酢酸、o . 1 N
塩 酸 〉 に キ ト サ ン を 溶 解 し 、H B
4 C 5 細 胞 の 培 養 液 に 添 加 し て そ の 影 響 を 調 べ た 。 第 1 1表 に 示 し た よ う に 、 無 機 酸 の 種 類 で は 、 細 胞 増 殖 及 び 抗 体 産 生 に 相 違 は 見 ら れ な か っ た 。 た だ し 、 3 種 の 無 機 酸 に 溶 解 し て 、 放 置 し て 長 時 間 経 過 す る と 、
o .
1 N 泡 酸 に 溶 解 し た キ ト サ ン は 徐 々 に 活 性 に 上 昇 し て い く 傾 向 を 示 し た 。 今 後 は 、 す べ て 上 述 の よ う に 希 埠 敵 に 溶 解 し た サ ン プ ル を 用 い た 。
第 3 項 脱 ア セ チ ル 化 度 及 び 分 子 量 が 活 性 発 現 に 与 え る 影 響
キ ト サ ン の 生 理 活 性 の 1 つ で あ る マ ク 口 フ ァ ー ジ 活 性 化 能 4o )では、 そ の 化 学 修 飾 度 及 び 脱 ア セ チ ル 化 度 の
8 3
1 0 % L a c t a t e
ハU eEE'A 0.9;:) 1. 151.13 5.22
1. 11 !
4 . 5 4
第 11表 溶 解 す る 無 機 酸 の 違 い に よ る キ ト サ ン の IPSJ7活性への影響
無 機 酸 キ ト サ ン 添 加 量
〈μg/m1)
相 対 細 胞 数 相 対 抗 体 童 相 対 抗 体 生 産 量
5 % A c e t a t e 0 . 1
1. 04 1.141.18
5 . 3 4
1.13
4 . 6 8
O. 1 N HC I ハυ ‑EEEA 1. 04 1.17
1.17
5 . 4 3
1.12
4 . 6 4
ち ヰ
相 違 が 活 性 に 大 き な 影 響 を 与 え る と 報 告 さ れ て い る 。 そ こ で 、 キ ト サ ン の 脱 ア セ チ ル 化 度 及 び 分 子 量 の 速 い が 1 P S F活 性 に 与 え る 影 響 を 調 べ た 。
結 果 は 、 第 1 2 表 に 示 し た 。 まず、 99.6%脱 ア セ チ ル 化 キ ト サ ン は 、 1 μ g / m I 添 加 で は 1 P S F 活 性 は な
く、 1 0 μ g / m I 添 加 で 若 干 の 活 性 が 見 ら れ た 。 また、 7 3 .5、 79 .2、 88.6、 89.2、 90 .1、 及 び 90.8%の 脱 ア セ チ ル 化 度 で は 、 そ れ ぞ れ 、 同 様 の 強 い 1P S F 活 性 を 示
した。 さ ら に 、 調 べ た 分 子 量 サ イ ズ (100k D a ""'350 k D a ) 聞 で も 1 P S F 活 性 に 違 い は 見 ら れ な か っ た 。 た だ し 、 C M ー 〈 カ ル ボ キ シ ル メ チ ル ) ー キ チ ン は 、
1 P S F 活 性 を 示 さ な か っ た 。
キ ト サ ン に は 、 い く つ か の キ ト サ ン オ リ ゴ 糖 (
D ‑
グ ル コ サ ミ ン オ リ ゴ マ ー 〉 が 市 販 さ れ て い る 。 抗 菌 性 は、 こ の よ う な オ リ ゴ 糖 に 見 い だ さ れ て い る た め 、 '、ヲ'‑ れ ら オ リ ゴ 糖 の 1 P S F 活 性 を 調 べ た 。 キ ト サ ン オ リ ゴ 糖 は 、 生 化 学 工 業 ( 株 〉 の キ ト サ ン オ リ ゴ 糖 n = 5
7、 同 時 に キ チ ン オ リ ゴ 糖 (N ー ア セ チ ル グ ル コ サ ミ ン オ リ ゴ マ ー ) n=5""'7 も 供 試 し た 。 結 果 は 、 第 1 3 表 に 示 し た 。 各 オ リ ゴ 糖 は 、 1 0 μ g / " I ' を 添 加 し た が、 さ ら に 高 い 濃 度 で 添 加 し た 場 合 も 含 め 、 1 P S F 活 性 は 認 め ら れ な か っ た 。
s t
第 12表 分子量及び脱アセチル化度の異なるキトサンの IPSP活性への影響
分 子 量 脱 ア セ チ ル 化 度 (I<Da) (DA%) 70門 400 73.2
80門 520 79.2
90門 330 88.6
100L 120 99.6
LL 130 89.2
u
100 90.8Z 300 91.1
V 350 90.1
C門‑chitin
。
添加1量:
〈μg/ml)
0.1 10 0.1
10 0.1
10 O. 1 10 0.1
10 0.1
10 0.1
10 0.1
10
0.1 10
相 対 細 胞 数 キ日文~tiL
I
本註1.05 1.27 0.94 1.02 1.36 0.82 1.00 1.19 0.47 1.07 0.89 0.93 1.10 1.39 0.54 0.96 1. 01 0.49 0.99 1.03 0.38 1.12 1.09 0.40
1.01 1. 01 1.09
86
1.20 8.20 4.08 1.13 8.44 3.62 1.09 6.13 2.53 1.12 0.89 2.63 1.55 10.3
2.01 1.47 6.61 4.00
1. 41 6.54 3.56 1. 32 6.63 3.64
1.10 0.94 0.93
相 対 抗 体 生 産 笠
1. 14 6.45 4.34 1. 10 6.20 4.40 1.0G 5.15 5.::38
1.04 1.00 2.82 1.40 7.41 3.72 1.53 0.54 8.16 1.42 6.35 D.36 1.18 6.08 9.10
1.08 0.93 0.85
第 13表 HB4C5細胞の増殖及び抗体産生へ及ぼす キトサンオリゴマー及びキチンオリゴマーの影響
Chitosan; Pentamer(n=5) Hexamer (n=6) Heptamer(n=7)
Chitin;
Pentamer(n=5) Hexame r~ (nご6) Heptamer(n=7)
相対細胞数
1.03 1. 0 1
0 . 9 2
0 . 9 9
1.0 1
1.0 2
各サンプルは、 10μg/ml添加した。
相対抗{本量
1. 03
0 . 9 2 1 . 0 0
0 . 9 0
0.93 1.0 2
C Z 7
相対抗体生産量
1. 00
0 . 9 1
1.0 8
0 . 9 1
0 . 9 2
]. 00第 4 項 キ ト サ ン の 抗 体 産 生 増 強 の 特 徴
キ ト サ ン の 抗 体 産 生 に 対 す る 効 果 を 経 時 的 に 調 べ た の が 第 1 9 図 で あ る 。 (A ) は 細 胞 数 、 ( B ) は 抗 体 量 の 変 化 を 表 し て い る 。 キ ト サ ン は 、 脱 ア セ チ ル 化 度 89.2%、 分 子 量 は 13 0 k D
a
の も の を 使 用 し て い る 。 後、 キ ト サ ン と 記 述 す る 際 に は 、 本 キ ト サ ン を 使 用 し た も の と す る 。 キ ト サ ン 無 添 加 の コ ン ト ロ ー ル で は Pノ色、プフ
B S を 替 わ り に 添 加 し た 。 細 胞 数 で は 、 5 μ g / m I添 加 で 顕 著 な 抑 制 が 見 ら れ た の に も か か わ ら ず 、 抗 体 産 生 では、 培 養 初 期 か ら 増 強 効 果 が 認 め ら れ た 。
次に、 培 養 初 期 の 抗 体 産 生 量 を 第 2 0 図 に 示 し た 。 キ ト サ ン は 500ng/ml添 加 し て い る 。 キ ト サ ン 添 加 の 場 合、 培 養 開 始 12時 間 以 降 、 急 激 な 抗 体 産 生 増 強 力 三 認 め ら れ た 。 こ の 段 階 で は 、 ま だ 細 胞 増 殖 は 起 こ っ て い な い の で 、 キ ト サ ン は 、 抗 体 の 産 生 を 活 発 に す る の か 、 あ る い は 抗 体 の 細 胞 外 移 動 を 活 発 に す る の か 、 後 続 の 章 で さ ら に 考 察 を 進 め た い 。
次に、 キ ト サ ン を 熱 処 理 し た 後 の 活 性 を 第 2 1 図 に 示す。 キ ト サ ン は 、 1 0 0
O C
処 理 に よ っ て も 活 性 の 劇 的 な 減 少 は 見 ら れ な か っ た 。28
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