ε ーボリリジン 0 分消化 C:ε ーボリリジン 15 分消化

D:ε ーボリリジン 120 分消化

/08 

した。 そ こ で 、 市 販 の 塩 基 性 ア ミ ノ 酸 及 び ペ プ チ ド に つ い て も 検 討 を 加 え る こ と に し た 。 供 試 物 質 は 、 塩 基

性 ア ミ ノ 酸 と し て 、 L  ア ル ギ ニ ン ( A 

r 

g )、 L ‑ リ ジ ン ( L y 

s 

)、 L ‑ ヒ ス チ ジ ン

(  H 

1 

s 

^)、 塩 基 性 ペ プ チ ド と し て 、 A 

r 

^{g ‑ L y} 

s

、 L y S  ‑ L y 

s

^、 L y 

s ‑

T y 

r ‑

L y 

s

、 A 

r 

^{g ‑ S} 

e  r  ‑

A 

r 

^g、 L y 

s ‑

A 

r 

g ‑ p 

r 

^{o ‑ p} 

r 

^{o ‑ G}  y ‑ P h 

e  ‑

S 

e r ‑

P 

r 

o ‑ P  h 

e  ‑

A 

r 

g 

(  K 

a  d  n ) 

P u 

r  。

_t h 

。

n  D

， 

P 

r  。

t a m  n 

e  ，  H 

i  S  t 

。

_n 

_e 

_m  X  t u 

r  e

を 用 い た ( Sigma) 。 各 添 加 重 と 相 対 細 胞 数 、 相 対 g 

M

量 等 の 結 果 は 、 第

1

8

表 に 示 し た 。 供 試 し た 塩 基 性 ア ミ ノ 酸 及 び ペ プ チ ド 類 は 細 胞 増 殖 に は 影 響 を 与 え な か っ た 。 また、 抗 体 産 生 増 強 に も 、 ほ と ん ど 影 響 を 与 え な か っ た 。

第 4 節 考 察

い く つ か の ボ リ カ チ オ ン に つ い て 1 P S F 活 性 を 調 べ た と こ ろ 、 前 述 し た キ ト サ ン 及 び ε ー ボ リ リ ジ ン に 強 い 活 性 が 認 め ら れ 、 他 の ボ リ カ チ オ ン 〈 ボ リ ア ル ギ

ーン、 ボ リ ガ ラ ク ト サ ミ ン 、 ポ リ エ チ レ ン イ ミ ン 〉 、 塩 基 性 ア ミ ノ 酸 、 数 種 の 塩 基 性 ペ プ チ ド に は あ ま り 強

/ ρ グ

第 1

8

表 HB4C5細胞の増殖及び抗体産生に及ぼす 境基性アミノ酸及びペプチドの影響

一 一 一 一 一 一

添加量 相対細胞数 相対抗体重 相対抗体生産量:

サンプル (μg/ml) 

一 一 一 一

L‑Arginine  10  0.97  0.88  0.D1  100  1.20  1.0::>  0.R8  1000  0.D9  0.06  0.D7  L‑Lysine  10  0.96  0.81  0.8::> 

100  1.0s  0.86  0.81  1000  1.14  0.D6  0.85  L‑Histidine  10  1.00  0.95  0.Q5  100  1.06  O.!)B  O.D 3: 1000  1.08  0.D3  0.87  Arg‑Lys  10  0.02  1. 72  1.B7  100  0.G5  1.42  1.40  1000  0.97  1.1 s  1. l!}  Lys‑Lys  10  0.8G  1.47  1.~W

100  1.08  1 .2 3: 1. 41  1000  0.87  1.47  1.38  Lys‑Try‑Lys  10  1.04  1.00  0.9fi  100  0.G4  0.D7  1.03  1000  0.90  1.05  ] .1G  Arg‑Ser‑Arg  10  1.00  1.28  1.28  100  1.00  0.90  O.QO  1000  1.08  1. 12  1.03  KRPPGFSPFR  5  1.00  0.98  0.9臼

(Ka 11 i d i n)  50  1.00  1.18  1.18  500  1.00  1.23  1 .2 3: Protamine  0.1  1.08  1. 81  1 . ()7  0.94  1.88  2.00 

10  0.25  0.12  0.48 

Histone lI1ix.  0.1  0.97  1.03  1.06  1.08  1.10  1.01  10  0.94  1.65  1. 75  Purothionin  0.05  1.03  1.05  1.02  0.5  1.14  1.G8  1.47 

5  0.39  0.23  0.59 

官 一一一ー一一 一 一 一 一

い 活 性 は 見 い だ さ れ な か っ た 。 そ の た め 、 ε ー ボ リ リ ジ ン に つ い て 検 討 を 加 え た 。

まず、 ε ー ボ リ リ ジ ン の 結 合 塩 及 び 分 子 量 に よ る l

P S F

活 性 へ の 影 響 を 調 べ た 。 ε ー ボ リ ー

L

ー リ ジ ン

• H C  1塩 (M W:  約 4

，

OOOD

a 

) が 最 も 活 性 が 強 か っ た。 こ れ に 近 い 分 子 量 を 持 つ ボ リ ‑D ー リ ジ ン ・ H B 

r

塩 (

M W:

約

3

，

800D a 

)、 ボ リ ー

L

ー リ ジ ン ・

H B 

r塩 (M W:  約 3

， 800D

a ) に つ い て み る と 、 ε ー ボ リ

‑ L ー リ ジ ン ・ H C 1塩 (M W: 約 4

，

OOOD a ) は lμ g/^門L添 加 で 強 い 活 性 を 示 し て い る の に 、 ボ リ ‑D ー リ ジ ン ・ H B 

r

塩 (M W: 約 3

， 800D a 

) 及 び ボ リ ‑L ‑

リ ジ ン ・ H B r塩 (M W:  約 3

， 800D

a ) は、 高 い 濃 度 ( 1 0 0μg/rnl) 添 加 で の み 、 抗 体 産 生 増 強 が 見 ら れ た 。 こ れ は 、 結 合 塩 の 違 い に よ る も の と 考 え ら れ る 。 つ ぎ に、 分 子 量 が 大 き く な る と 毒 性 が 強 く な る 傾 向 に あ っ た の で 、 ボ リ ‑D ー リ ジ ン ・ H B r塩 (M W: 約 13 

， 

0 

00 D  a 

)、 ボ リ ー

L

ー リ ジ ン ・

H B  r

塩 (

M W: 

約

26

， 500D 

a )、 ボ リ ‑

L

ー リ ジ ン ・

H B 

r塩 (

M W:

約 35

，

OOOD 

a 

) に つ い て は 、 添 加 量 を 少 な く し た の だ が 、

こ れ ら は 、 iμg / r  In 添 加 で の み 抗 体 産 生 が 見 ら れ 、 ^，L‑^、ョ

れ ら に よ り 、 1 P S F 活 性 発 現 に は 分 子 量 は 小 さ く 〈

> 

10

，

OOOD 

a 

)、 か つ 結 合 塩 は 糧 酸 塩 が 過 し て い る と

/ /  ! 

考 察 さ れ た 。 また、 リ ジ ン 結 合 を 選 択 的 に 切 る 酵 素 で あ る ト リ プ シ ン で 消 化 し た と こ ろ 、 1 2 0分 間 の 消 化 で も 1 P S F 活 性 の 低 下 は 見 ら れ ず 、 分 子 量 の 決 定 は で き な か っ た も の の か な り 小 さ な ペ プ チ ド で も 抗 体 産 生 増 強 効 果 は 存 続 す る こ と を 意 味 し て い る 。 生 体 内 で 吸 収 さ れ る 場 合 、 高 分 子 物 質 で は 吸 収 効 率 が 落 ち る こ と が 予 想 さ れ る 。 低 分 子 で あ れ ば あ る ほ ど 体 内 に 取 り 込 ま れ る 可 能 性 が 強 く 、 実 用 と し て 利 用 し て い け る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。 か な り 消 化 し で も 1 P S F 活 性 は 残 存 し て い る こ と か ら 、 今後、 リ ジ ン ペ プ チ ド ( n 

> 

2 ) に つ い て も 検 討 を 加 え る 必 要 が あ る と 考 え ら れ

た。

また、 ε ー ボ リ リ ジ ン は 1 0 0 

O C

処 理 で 1 P S F 活 性 を 失 っ た が 、 8 0 

O C

で は 活 性 が 8 0 % 程 度 残 存 し て い る の で 、 他 の タ ン パ ク 質 性 1 P S F と 異 な り 、 熱 に は 強 い 構 造 を 持 っ て い る と 考 え ら れ る 。

ε ー ボ リ リ ジ ン は 抗 菌 性 53)、 ウ イ ル ス 感 染 防 止 8、) バ ク テ リ ア 増 殖 阻 止 18)、 エ ー リ ツ ヒ 腫 痕 増 殖 阻 止 2 5 . 5 0 ) な ど の 効 果 が 報 告 さ れ て い る 物 質 で あ る 。 重 合 度 1

o  ‑ ‑

30の L ー リ ジ ン の ホ モ ボ リ マ ー で 体 内 で は 必 須 ア ミ ノ 酸 の L ー リ ジ ン と な る 。 ボ リ リ ジ ン の ア ミ ノ 基 が ボ ジ テ ィ ブ に 荷 電 す る カ チ オ ン 系 界 面 活 性 剤 の 作 用 に よ

//2 

り 抗 菌 効 果 を 発 揮 す る 。 枯 草 菌 、 乳 酸 菌 、 酵母、 大 腸 菌 の 発 育 抑 制 に 有 効 で 、 熱 安 定 性 が 高 い と さ れ る 。 抗 菌 剤 と し て の 使 用 量 は 生 米 重 量 の 0.3‑‑ 1.0%で、 一 般 食 品 に も 使 用 さ れ て い る 物 質 で あ る 。 界 面 活 性 剤 は 、 細 胞 膜 に 対 し て 穴 を 開 け る よ う な 作 用 49 ) が あ る こ と も 報 告 さ れ て お り 、 ε ー ボ リ リ ジ ン の 作 用 も そ う し た 膜 に 対 す る 効 果 が 関 与 し て い る 可 能 性 が あ る と 考 え ら れ る。 次 章 で は 、 ε ー ボ リ リ ジ ン 及 び キ ト サ ン の 細 胞 膜 へ の 影 響 を 中 心 に 検 討 を 加 え て い く 。

第

5

節 小 括

数 種 の ボ リ カ チ オ ン に つ い て 1 P S F活 性 を 調 べ た 。 ボ リ ア ル ギ ニ ン 及 び ボ リ ガ ラ ク ト サ ミ ン は 、 同 じ 様 な 構 造 を 持 つ ε ー ボ リ リ ジ ン 及 び キ ト サ ン の よ う な 強 い 活 性 は 示 さ な か っ た 。 また、 ポ リ エ チ レ ン イ ミ ン は 全 く 抗 体 産 生 増 強 を 示 さ ず 、 強 い 毒 性 を 有 し て い た 。 塩 基 性 ア ミ ノ 酸 及 び A

r 

g ‑ L y 

s

、 L y 

s ‑

L y 

s 

、

L y 

s ‑

T y 

r ‑

L y 

s

、 A

r 

^g ‑ S 

e  r ‑

A 

r 

^g、 L y 

s ‑

A 

r 

g ‑ P 

r 

0  ‑ P 

r 

0  ‑ G  1 y  ‑ P h 

e ‑ S e r ‑ P r 

0  ‑

P h e  ‑ A r 

g 

( K   a 1 1 

i 

d 

i 

n) 

と い っ た 塩 基 性 ベ プ チ ド も 活 性 は 示 さ な か っ た 。 ε 

ー ボ リ リ ジ ン に つ い て 結 合 塩 及 び 分 子 量 に よ る 1 P  S  F 活 性 へ の 影 響 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 1 P S F 活 性 発 現 に は 分 子 量 は 小 さ く (

> 

10

，

OOOD a )、 か つ 結 合 塩 は 塩 酸 塩 が 適 し て い る と 判 断 さ れ た 。 また、 ト リ プ シ ン 消 化 で は 、 1 2 0分 間 処 理 し で も 1P S F 活 性 は 低 下 せ ず 、 か な り 低 分 子 の ペ プ チ ド で も 抗 体 産 生 増 強 効 果 を 有 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。

//与

第 7章 豆乳、 S H H、 キ ト サ ン の ヒ ト リ ン パ 球 抗 体 産 生 増 強

第 1節 緒 言

こ れ ま で の 実 験 は 、 主 に ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ H B  4  C 5 細 胞 を 用 い て 行 っ て き た 。 ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ を 用 い て 食 品 成 分 の 生 体 内 抗 体 産 生 調 節 因 子 の 検 索 が 可 能 で あ れ ば 、 非 常 に 効 率 的 で あ る 。 し か し 、 ヒ ト 型 ハ イ ブ リ ド ー マ は 、 抗 原 特 異 的 な 特 殊 な 細 胞 で あ り 、

こ れ を 使 用 し て 検 定 す る こ と に 疑 問 を 抱 か れ る の は 必 至 で あ る 。 そ こ で 、 よ り ヒ ト に 近 い 系 で あ る ヒ ト 末 梢 血 リ ン パ 球 を 用 い て 、 ヒ ト 型 ハ イ プ リ ド ー マ 細 胞 に よ

る 検 定 と の 比 較 を 行 い 、 そ の 信 頼 性 を 検 討 し た 。

第 2 節 実 験 材 料 及 び 方 法

第 1項 ヒ ト リ ン パ 球 の 調 製 39)

ヒ ト リ ン パ 球 は 、 末 梢 血 リ ン パ 球 を 使 用 し た 。 調 製 法 は 次 の 通 り で あ る 。 まず、 健 常 人 か ら 供 試 さ れ た 末 梢 血 は 無 菌 的 に 真 空 採 血 管 に 採 集 し 、 リ ン パ 球 分 離 培

//合一

地

(Lympho c yt e s e rar e tion  m e dium: C a ぃ p l e

社 )

L 1 

^III 

I

に

5 

m l

の 末 梢 血 を 重 層 し た 。 し ば ら く 放 置 し た 後 、 遠 心 分 離 (

400 X 

g

，  30m i  n 

) し て 中 間 に 浮 遊 し た 白 濁 し た 部 分 を パ ス ツ ー ル ピ ペ ッ ト で 採 取 し 、 P  B  S を 加 え て 遠 心 分 離 す る こ と で 洗 浄 し た 。 さ ら に も う 一 度、 E R D 

F

で 洗 浄 し 、

5 % F B S ‑ E R D F

で 懸 濁 し て 、

5ml

デ ィ ッ シ ユ に 適 宜 ま き 、 1 日 培 養 し た 。 付 着 性 細 胞 を デ ィ ッ シ ユ に 付 着 さ せ 、 翌 日 に 浮 遊 し て い る リ ン パ 球 を 実 験 に 使 用 し た 。

第 2 項 卵 黄 リ ボ タ ン パ ク 質 (Y L  P ) の 調 製

市 販 鶏 卵 か ら 黄 身 だ け 取 り 出 し 、 肢 を ピ ン セ ッ ト で 剥 離 し た 。 少 量 の P B S で 希 釈 し て 〈 卵 黄 5 個 に 約

20 m l  

添 加 〉 、 よ く 混 和 し た 。 混 和 液 を パ ス ツ ー ル ビ ベ ッ

ト で 遠 心 管 に 移 し 、 バ ラ ン ス を と り 、 ス イ ン グ ロ ー タ ー で 超 遠 心 分 離 し た

(45 ， 000rpmX 20hr)

。 遠 心 分 離 後 、 上 層 の 黄 色 の 部 分 を 採 り 、 少 量 の P B  S で 希 釈 し て 氷 冷 し な が ら 、 撹 持 混 和 し た 。 1

. 2

、

o 

^.8、

o  .  4 5

、

o  .  22μ 

m の フ ィ ル タ ー で 順 次 漉 過 し 、 タ ン パ ク 質 含 量 を プ ロ テ イ ン ア ッ セ イ 法 (810‑ RAD) で 測 定 し 、 培 養 液 へ の 添 加 量 は

5μg/ m  1

と し た 。

//6 

第 3 項 マ イ ト ジ ェ ン

マ イ ト ジ ェ ン と し て 、 リ ボ 多 糖 ( L  P S )、 ア メ リ カ ヤ マ ゴ ボ ウ レ ク チ ン 〈 ポ ー ク ウ ィ ド マ イ ト ジ ェ ン P W M )、 イ ン ゲ ン マ メ レ ク チ ン ( P H A )、 タ チ ナ タ マ メ レ ク チ ン 〈 コ ン カ ナ バ リ ン A; C 0  n A )、 サ ル モ ネ ラ チ フ ス 菌 ( S T M )、 大 豆 凝 集 素 ( S B A )  

、 ハ リ エ ニ シ ダ レ ク チ ン H ( U E A l l )、 P 

e a 

〈ビ 一 豆 レ ク チ ン 〉 を 使 用 し 〈 豊 年 製 油 〉 、 添 加 量 は 各 々

10ng/ml

と し た 。

第 4 項 検 定 方 法

2 4 ウ エ ル プ レ ー ト に 各 サ ン プ ル を 適 宜 希 釈 し て 添 加し、 第 1項 の よ う に 調 製 し た リ ン パ 球 を lX

10

⁶

cell 

s/rnl  ( 1 T E  S ‑ E  R D F あ る い は 、 5 % F B E ‑ E R  

D F

で 懸 濁 し た 細 胞 〉 の 細 胞 密 度 で ま き こ み 、

5

日 間

培 養 し た 。 培 養 後 、 各 抗 体 重 を E L  1 S A 法 で 測 定 し た。 抗 一 抗 体 は T

a 

g 0 製 〈 抗 1 g A 抗 体 は T

a 

g 0 

4 3 0  1、 P  0 D  ( ベ ル オ キ シ ダ ー ゼ 〉 標 識 抗 1 g A  抗 体 は T a g 0 4 5  0  1、 抗 1 g G抗 体 は T a g 0 4 

3 0 0

、

P 0 D

標 識 抗

1 g G

抗 体 は

T a g o 4 5 0 0 )

を 用 い た 。 1 g E の 測 定 で は 、 感 度 が 低 い た め 、 ア ビ ジ ン ー ビ オ チ ン 結 合 を 利 用 し て 増 感 し た 。 す な わ ち 、

ビ オ チ ン 標 識 抗 1 g E抗 体 で 、 上 清 中 の 1 g E を ラ ベ ルし、 P 0 D 標 識 ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン を 結 合 さ せ た 。

第 3節 結 果

第 1項 豆 乳 に よ る 増 強

豆 乳 は 500倍 希 釈 液 を 用 い た 。 試 験 は 無 血 清 条 件 下 で

行い、 リ ン パ 球 刺 激 因 子 で あ る

L P  S

、

P  V V   M

、

P  H 

A、 C 0  n A の 4 種 の マ イ ト ジ ェ ン を そ れ ぞ れ 10ng/m  1 添 加 し た 。 結 果 は 第 1 9 表 に 示 し た 。 まず、 細 胞 数 を 見 て み る と 、 豆 乳 を 添 加 し た 場 合 、 細 胞 数 の 践 存 率 が 無 添 加 よ り 大 で あ っ た 。 また、 豆 乳 と マ イ ト ジ ェ ン を 同 時 に 添 加 し た 場 合 、 細 胞 数 は 増 加 し 、 特 に そ の 効 果 は C 0  n A で 大 き か っ た 。 つ ぎ に 、 抗 体 産 生 を 見 て み ると、 豆 乳 は マ イ ト ジ ェ ン 無 添 加 で 1 g M 産 生 を 約 7 倍 増 強 し た 。 マ イ ト ジ ェ ン を 同 時 に 添 加 し た 場 合 、 細 胞 数 が 増 加 し て い る に も 関 わ ら ず 抗 体 産 生 は 増 加 し な か っ た 。 1 g M 産 生 で は 、 マ イ ト ジ ェ ン と 豆 乳 を 添 加

/  /3 

第 19表 ヒト末梢血リンパ球細胞増鎚及び抗体産生に 及 ぼ す 豆 乳 、 マ イ ト ジ 工 ン の 影 響 1 ) 

細 胞 数

( X 10⁵ ce 1 1 s/l1ll ) 

None  6.00  LPS 2)  7.40  PHA 2)  6.54  ConA  2)  6.38  SOYlllill(3)  7.48  Soym i I k‑LPS  10.84  Soym i 1 k‑PHA  15.32  Soym 1 i k‑ConA  18.56 

抗 休 量 (ng/rnl) Ig門 IgG

5  124  8  154  12  51!  3  30  38  180  38  175  16  75  10  144 

1 )リンパ球(Q.5XI0⁵ cells/ml)は、 ITES‑:FRDF沼地中で51‑'問培養した⁰ 2) LPS(リボボリサッカライド〉及ひ、ConA(コンカナパリンT..)の添加!量は

50μg/ml、PIIA(ポークウィートマイトジュ:ン〉の添加量は101/ζ111110 3)豆乳は500倍希釈して培地へ添加した。

I/f 

し た 場 合 、 L P S 以 外 で は 豆 手 し に よ る 増 強 効 巣 が 打・ち 消 さ れ た 。 また、 豆手しは 1 g G 産 生 を 若 干 増 強 し た 。 豆 乳 +C 0  n A で は 細 胞 数 が 非 常 に 増 加 し た が 、 1 g  M 産 生 は 増 強 し な か っ た 。

第 2

r

夏 S H H に よ る 増 強

S H H 

( 大 豆 種 皮 ヘ ミ セ ル ロ ー ス 〉 は 、

500μg 

/日JJ添 加 し た 。 結 果 は 第 2 0 表 に 示 し た が 、 S H 11 は 1 g G、

1 g E の 産 生 増 強 は 示 さ ず 、 1 g M のみ、 無 血 清 条 件 下 で コ ン ト ロ ー ル の 2.5倍強、 血 清 条 件 下 で 1. 5倍 強 の 産 生 増 強 を 示 し た 。 マ イ ト ジ エ ン 添 加 ・無 血 清 下 で は 、

1 g M で、 S H H は L P S で の 抗 体 産 生 を 増 強 し 、 g G で は ほ と ん ど 変 化 は な か っ た 。 マ イ ト ジ ヱ ン 添 加

・血 清 条 件 下 で は 、 1 g M で、 S H H は L P  S で の 産 生 を 増 強 し 、 P 'vV M で の 産 生 増 強 を 弱 め 、 1 g G で、 マ イ ト ジ エ ン 添 加 の み の 産 生 量 を か え っ て 減 少 さ せ た 。

第 3

r

頁 キ ト サ ニ ノ に よ る 増 強

キ ト サ ン は

lμg/

1II

1

添加、 各 マ イ ト ジ 工 ン は 、 1 

0  n  g  / 

rnJ 添 加 し 、 結 果 は 第 2 1表 に 示 し た 。 キ ト サ ン は 無 血

ノ ユ 。

ヒト末梢血リンパ球の細胞増殖及び抗体産生に}ぶます S Hli、 マ イ ト ジ ェ ン の 影 響 1) 

抗 体 重 (n~ミIml)

I g

門

I g C I g E  

第

20

表

細 胞 数

(x 10⁵ ce 11 

s / m  

1) 

ρU71

代 り 勺

f﹁

J A 1 7 I ρ υ ρ h

ドキュメント内 食品成分の抗体産生調節に関する研究 (ページ 111-124)