酵母細胞の耐塩性に関する研究

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

酵母細胞の耐塩性に関する研究

渡部, 保夫

https://doi.org/10.11501/3059408

出版情報：Kyushu University, 1991, 博士（農学）, 論文博士

酉 孝 定 ま 潟

s

1J包 a:>而 討 培 孟 守 生 む ご 巳 母 す 一 る 初 子 ラ 宅

議室

E

音s {:!長 茅ミ

1  9  9  1 

目 次

緒 章

第 1章 耐塩性酵母 Zygosaccharomycesrouxiiの脂質組成に及ぼ

す食塩の影響 13 

1・1 緒言 13 

1・2 実験方法 14 

1・2・1 使用菌株 14 

1・2・2 使用培地 14 

1 . 2・3 培養方法 14 

1・2・4 脂質の14Cラベリング 15 

1.2・5 細胞形態観察 15 

1・2・6 細胞脂質の抽出 15 

1・2 .7 脂質分析 16 

1・2・8 二次元薄層クロマトグラフィー及び燐脂質に含まれ

る放射活性の測定 20 

1・3 結 果 20 

1・3・1

z .  

rouxiiと

s .

cerevisiae細胞の生育に及ぼす食

塩の影響 20 

1.3・2 Z.  rouxii細胞の形態に及ぼす食塩の影響 22  1・3・3 Z.  rouxii細胞の脂質組成に及ぼす食塩の影響 24  1・3・4 S.  cerevisiae細胞の脂質組成に及ぼす食塩の影響 27  1・3・5 Z.  rouxii ATCC 42981株以外の4菌株の脂質組成 29  1・3.・6

z . .  

rouxi i細胞の脂質組成に及ぼす培養時間の影響 29  1・3・7 Z.  rouxii細胞の脂質組成に及ぼす培地転換の影響 32 

1・3・8 燐脂質の極性基の組成に及ぼす食塩の影響 1・4 考察

1・5 小括

W A 1 υ n u d p h J u   n︽υ

町︑ u a n T

第2章 耐塩性酵母 Zygosaccharomyces目 些ii細胞のリノール酸

合成に及ぼす食塩の影響 47 

2・1 緒言 47 

2・2 実験方法 47 

2・2・1 使用酵母株及び使用培地 47 

2・2・2 培養方法 48 

2 ・2 ・3 脂質抽出及び脂肪酸分析 48  2 ・2 ・4 脂質のパルス・ラベリングと放射性脂質抽出 48  2 ・2 ・5 脂肪酸の不飽和度による分析 50 

2・3 結 果 51 

2・3・1

Z .

白 区ii細胞の培養と生育度 51  2 ・3 ・2 燐脂質に含まれる脂肪酸残基の合成に及ぼす食塩の

影響 52 

2 ・3 ・3 トリアシルグリセロール、ステロールエステル、遊 離脂肪酸に含まれる脂肪酸残基の合成に及ぼす食塩

の影響 55 

2 ・3 ・4 高濃度食塩による18:2合成抑制の検討 2・4 考 察

2・5 小括

門司

υ 4 1 4 4 n τ v h d n h u n h u  

第3章 好塩性酵母 Candidaversatilisの脂質組成に及ぼす食塩

の影響 65 

3・1 緒言 65 

3・2 実験方法 66 

3・2・1 使用菌株及び培地組成 66 

3・2・2 培養方法 66 

3・2・3 生育度検定 66 

3 .2・4 脂質抽出 67 

3・2・5 脂質分析 67 

3 .2・6 膜区分の調製 68 

3・2・7 酵素活性の測定 68  3・2・8 タンパク質の定量 69 

3・3 結 果 70 

3 .3・1

c ̲ .  

versatilis細胞の生育に及ぼす食塩の影響 70  3・3・2 細胞形態に及ぼす食塩の影響 73  3 .3・3 脂質組成に及ぼす食塩の影響 73  3 .3・4 燐脂質の脂肪酸組成に及ぼす食塩の影響 75  3・3・5 燐脂質組成に及ぼす食塩の影響 75 

3.3・6 細胞膜区分の純度 78 

3・3・7 細胞膜区分の脂質組成に及ぼす食塩の影響 78 

3・4 考 察 81 

3・5 小括 86 

第4章 酵母細胞の易熱性抗原タンパク質TLAa及びTLAbの同定 88 

4・1 緒言 88 

••••••

••••••

‑ ‑ E ・E・

4・2 実験方法 89 

4・2・1 使用菌株 89 

4・2・2 抗 血 清 90 

4・2・3 TLAaの精製 90  4・2・4 TLAbの精製 91  4・2・5 オクタロニー免疫二重拡散試験 91  4・2・6 SDS‑ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS‑PAGE) 92  4・2・7 イムノフ。ロッティング 92  4・2・8 TLAaのアミノ酸組成分析 93  4・2・9 TLAa及びTLAbのN‑末端アミノ酸配列の決定 93  4・2・10 TLAaのエノラーゼ活性測定 93  4・2・11 TLAbのGAPDH活 性 測 定 93  4・2・12 _{タンパク質の定量 94} 

4.3  _{結 果 94} 

4・3・1 TLAa、エノラーゼ、 HSP48のアミノ酸組成の比較 94  4・3・2 _TLAaと酵母エノラーゼの免疫学的性質の比較 96  4・3・3 TLAaのN‑末端アミノ酸配列 96  4・3・4 TLAaのエノラーゼ活性 96  4・3・5 TLAbと酵母GAPDHの免疫学的性質と分子量比較 101  4・3・6 TLAbのN‑末端アミノ酸配列 101  4.3・7 _{TLAbのGAPDH活 性 103} 

4・4 考 察 103 

4・5 小括 107 

第5章 酵母細胞の易熱性抗原タンパク質TLAaとTLAbのストレスに

対する応答 109 

5・1 緒言 109 

5・2 実験方法 110 

5・2・1 使用菌株及び使用培地 110 

5・2・2 培養方法 110 

5・2・3 TLAa及びTLAbのイソタンパク質量の測定 111  5・2・4 タンパク質量の測定 112 

5・3 結果 112 

5.3・1 TLAaイソタンパク質量に及ぼす生育条件の効果 112  5・3・2 TLAbイソタンパク質量に及ぼす生育条件の効果 118 

5・4 考察 125 

5・5 小括 131 

第6章 耐塩性酵母 ZygosaCCharOIDYCes回 些 斗 の 生 育 に 及 ぼ す 薬

剤の効果 133 

6・1 緒言 133 

6・2 実験験方法 134 

6・2・1 使用菌株及び使用培地 134  6・2・2 培養方法 134  6・2・3 生育度測定 135 

6・3 結果 135 

6・3・1 アジ化ナトリウムの効果 135  6・3.・2 パナジン酸の効果 135  6・3・3 CCCPの効果 137 

v 

6・3・4 培 地pHの効果 6・4

6・5

考 察 小括

第7章 耐 塩 性 酵 母 Zygosaccharomyces旦 旦 斗 細 胞 膜 に 局 在 す る プロトンATPaseの性質

7・1 緒 言

7・2 実 験 方 法

7 .2・1 使 用 菌 株 及 び 使 用 培 地 7・2・2 培 養 方 法 及 び 生 育 度 測 定 7・2・3 酵母細胞のグルコース処理 7・2・4 部分精製細胞膜区分の調製 7・2・5 クルード(Crude)膜 区 分 の 調 製 7・2・6 ATPase活 性 の 測 定

7 . 2・7 タンパク質量の定重

7.3 

_{結 果}

7・3・1 部分精製細胞膜区分のATPase活性に及ぼす阻害剤の

140  140  144 

146  146  147  147  147  147  148  148  149  150  150 

効 果 151 

7・3・2 細 胞 膜ATPase活性に及ぼすpHの効果 155  7・3・3 細 胞 膜ATPase活性に及ぼすこ価陽イオンの効果 155  7・3・4 細 胞 膜ATPase活性の基質特異』性 157  7・3・5 細 胞 膜ATPase活性に及ぼすウアパインの効果 157  7・3・6 細 胞 膜ATPase活性に及ぼすナトリウム、カリウム

イオンの効果 161 

7・3・7 クルード膜区分中の細胞膜活性に及ぼすグルコース の効果

7・3・8 クルード膜区分中の細胞膜活性の培養中の経時的変

7・4 7・5

考察 小括

化

第

8

章 耐塩性酵母

Z y g o s a c c h a r o m y c e s

旦 旦

i i

細胞膜プロトン

8・1 8・2

A T P a s e

遺伝子のクローニングと解析 緒 言

実験方法

8・2・1 使用菌株、使用培地および培養方法

8・2・2

E .

旦

l i

細胞からのプラスミド

D N A

とアガロースゲル からの

D N A

断片の回収

8・2・3 プロープの調製および免疫的検出法 8・2・4 高分子量

D N A

の調製とサザン分析

8・2・5

f̲.担旦 i i

細胞の細胞膜プロトン

A T P a s e

遺伝子の クローニング

8・2・6

D N A

の塩基配列の決定 8・2・7 全

R N A

の調製とノーザン分析

8・2・8 細胞膜タンパク質のSDSポリアクリルアミドゲル電気 泳動

8・3 結果

161 

163  163  171 

173  173  174  174 

175  176  179 

180  182  183 

186  186 

8

・

3

・

1 f ̲ .   r o

旦

i i

プロトン

A T P a s e

遺伝子クローンの単離 186 

VII 

8・3・2

8.3・3 8・3・4 8・3・5 8・4 考察 8・5

総 括 謝 辞 参 考 文 献

小 括

Z. 

r o u x i i

プロトンATPase遺伝子の塩基配列とそれ から推定されるアミノ酸配列

他種の細胞膜プロトンATPaseとのアミノ酸配列比較 プロトンATPase機能領域の比較

プロトンATPase遺伝子の発現

190  193  198  198  200  206 

208  222  223 

緒 章

酵 母 は 分 類 学 上 の 厳 密 な 名 称 、 で は な く 、 大 部 分 が 球 形 や 卵 形 な ど の 単 細 胞 で 生 活 環 を 過 ご し 、 主 と し て 出 芽 に よ っ て 増 殖 す る 真 菌 類 に 属 す る 真 核 微 生 物 の 総 称 で あ る 。 これらは、 S chizosaccharom y‑ 立主主属・ Saccharomyce s属・ Zygosaccharomyce s属・ Hansenul a属

. p ichi a属・ Debaryomyce s属 な ど の 子 袋 胞 子 を 形 成 す る 酵 母 、 S porobolomyce s属・ Buller a属 な ど の 担 子 菌 類 系 の 酵 母 、 Rodot0‑

E旦よ主属・ Candid a属 .K loecker a属 な ど の 胞 子 を 形 成 し な い 酵 母 に 分 け ら れ る ( 図

1)

(1)。 酵 母 は 、 古 く か ら 応 用 微 生 物 学 上 極 め て 重 要 な 微 生 物 群 で 、 清 酒 ・ ぶ ど う 酒 ・ ビ ー ル な ど の 酒 類 や 味 噌 ・ 醤 油 な ど の 調 味 料 の 醸 造 、 ア ル コ ー ル 製 造 、 製 パ ン 、 さ ら に は ビ タ ミ ン 類 や 核 酸 関 連 物 質 の な ど の 発 酵 に 用 い ら れ る 。 子 嚢 胞 子 を 形 成 す る 酵 母 の う ち Saccharomyces  cerevisiae は ビ ー ル ・ ワ イ ン ・ 清 酒 ・ パ

ンの製造に、 S accharomyces  uvarumは ビ ー ル 製 造 、 _~.

  c ̲

erevisiae  v ar.  e llipsoideu sは ワ イ ン 製 造 に 、 Z ygosaccharomyces  rouxi i は 醤 油 ・ 味 噌 の 製 造 に 用 い ら れ て い る 。 一方、 S accharomyce ~ Q̲主主主主‑

u rianu sの よ う に ビ ー ル に 、 Z ygosaccharomyces  japonicu sの よ う に醤油に、

z

 ̲ygosaccharomyces  melli sの よ う に ジ ャ ム や 糖 密 に 繁 殖 し 、 食 品 の 品 質 を 悪 化 さ せ る 有 害 菌 も あ る 。 無 胞 子 酵 母 の う ち 、

c 

andida  utili sや Candida  lipolytic aは 飼 料 酵 母 と し て 用 い ら れ 、

C andida  verstili sは 醤 油 ・ 味 噌 の 製 造 に 用 い ら れ る 。 このように、

酵 母 は 細 菌 や 糸 状 菌 な ど と と も に 日 本 の 伝 統 的 食 品 製 造 に お い て 重 要 な 位 置 を 占 め て い る 。 多 数 の 酵 母 種 の う ち 、 _特に、~.

  c ̲

erevis i‑ 主 主 は 生 理 学 的 ・ 生 化 学 的 研 究 の た め の モ デ ル 真 核 細 胞 と し て 重 要 視

1 

FUMY

∞

^TA 

(真正菌門)

AS

∞

MY

∞

TINA (子嚢菌亜門)

L 

^{Hemiascαnycetes} 

r ‑ ‑ ‑

Spermophthorac閃

L ̲  Endomycetale一 寸 「

L ̲ ̲  Saccharαnycetaceae十一

BASIDIOMY

∞

^{TINA (担子菌類亜門)}

i  山 …

_Tremellales 

D印T四OMY

∞

^{TINA(不完全菌実庖}

E

門)

Cryptococcaceae 

Sporobolomycetaceae 

Fig.  1.  Classification of Yeasts. 

Schizosaccharomycetoideae

一一‑

Nadsonioideae 

Lipomycetoideae 

r ‑

… 一

Schizosaccharymyces 

[ ~hodospororidium

Leucosporidium 

Kloeckera  Rhodotor叫a (Torulopsis) 

し

Bullera Sporobol畑 氏 自

This figure was made by referring to "The Yeasts" ed. by N.J.W. Kreger‑van Rij (1984). 

N 

さ れ て い る 。 こ の 理 由 と し て 、 生 化 学 な ど の 近 代 科 学 の 発 展 し た 欧 米 で 、 本 菌 種 が 最 も 一 般 的 に パ ン 製 造 や ブ ド ウ 酒 発 酵 な ど に 使 用 さ れ た こ と に よ る と 思 わ れ る 。 今 日 、 本 酵 母 を 用 い て 得 ら れ た バ イ オ サ イ エ ン ス ・ バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー に お け る 研 究 成 果 や 情 報 は 他 の 酵 母 と は 比 べ る こ と が で き な い ほ ど 膨 大 に な っ て い る 。

酵 母 細 胞 は 細 胞 表 層 に 強 固 な 細 胞 壁 を 有 し て い るo 最 も 良 く 分 析 の 進 ん で い る

Sa c c h a r o r n y c e   s

属 酵 母 の 細 胞 壁 は 、 外 層 か ら マ ン ナ ン ー タ ン パ ク 質 複 合 体 か ら な る マ ン ナ ン 層 、 ア ル カ リ 可 溶 性 の β ‑グ ル カン層、 ア ル カ リ 不 溶 性 β ‑グ ル カ ン 層 か ら 成 っ て お り 、 キ チ ン 及 び 少 量 の 脂 質 を 含 ん で い る (2 ， 3 ) 。 マ ン ナ ン 層 は 、 マ ン ノ ー ス の α‑

1 ，2、 α‑1 ， 3及 び α‑1，6結 合 で 重 合 し た マ ン ナ ン が タ ン パ ク 質 ( イ ン ベ ル タ ー ゼ 、 酸 性 ホ ス フ ァ タ ー ゼ な ど の 酵 素 タ ン パ ク 質 を 含 む ) の ア ス パ ラ ギ ン に ジ

‑ N ‑

ア セ チ ル キ ト ピ オ ー ス を 介 し て 結 合 し た マ ン ナ ン タ ン パ ク 質 、 ま た セ リ ン あ る い は ス レ オ ニ ン にQ‑グ ル コ シ ド 結 合 し た マ ン ナ ン タ ン パ ク 質 か ら 成 っ て い る (

4 

) 。 酵 母 の 血 清 学 的 分 類 に 使 用 さ れ る 抗 血 清 ( 抗 体 ) は こ の マ ン ナ ン 部 分 を 認 識 し て い る と 言 わ れ て い る (5 ) 。 ア ル カ リ 可 溶 性 グ ル カ ン 層 は β‑1，3結 合 し た グ ル コ ー ス の 長 い 鎖 に β‑1，6結 合 し た グ ル カ ン が 挿 入 し て い る 構 造 を な し て い る (3 ) 。 ア ル カ リ 不 溶 性 グ ル カ ン 層 は グ ル コ ー ス の β‑1，6結 合 を 主鎖とし、 こ れ に β‑1，3結 合 し た 分 岐 鎖 か ら 構 成 さ れ て お り 、 細 か い 微 繊 維 が 編 目 状 に 絡 み 合 っ た 構 造 で あ り 、 こ の 構 造 体 が 細 胞 墜 に 剛 性 を 与 え て い る と 考 え ら れ て い る (6 。)

細 胞 壁 の 内 側 に あ っ て 、 細 胞 内 外 の 環 境 を 隔 て て い る 細 胞 膜 は 、 図

2

に 示 し て い る

Singer

と

Nicolson

の 涜 動 モ ザ イ ク モ デ ル に 従 え ば、 主 に 燐 脂 質 の 単 位 層 膜 ( 燐 脂 質 の 脂 肪 酸 部 分 を 内 側 に 向 け 、 燐

3 

a) 

キ

ー } 一 一 一 一 一 〕 ー

Protein

+ 

唱D

‑Acyl  chain  group 

‑Polar head  group 

、Protein

、Phospholipid

Fig.  2.  Fluid Mosaic Model  of Cell Membranes. 

This  figure was  cited  from Scienc~ ，立~，

7 2 0 ‑ 7 3 1   ( 1 9 7 2 )  

reported  by  S.J.  Singer  and  G.L.  Nicolson. 

脂 質 の 極 性 基 を 外 側 に 向 け た 構 造 ) に 多 く の 種 類 の タ ン パ ク 質 が 埋 ま っ た 構 造 で あ る (7 。) 細 胞 膜 に は 、 全 ス テ ロ ー ル の 約 60% に 相 当 す る 多 量 の ス テ ロ ー ル が 含 ま れ る (8 ) 。 従 っ て 細 胞 膜 で は 特 に ス テ ロ ー ル の 機 能 が 重 要 で あ る と 考 え ら れ て い る (9 ) 。 細 胞 膜 の タ ン パ ク 質 は 、 膜 タ ン パ ク 質 と 呼 ば れ 、 こ れ ら の 大 部 分 が 細 胞 膜 の 疎 水 領 域 に 強 固

に 組 込 ま れ て い る 。 ま た 、 金 属 イ オ ン の 透 過 に 係 わ る イ オ ン チ ャ ネ ル と 呼 ば れ る タ ン パ ク 質 や 電 気 化 学 ポ テ ン シ ャ ル 形 成 に 関 与 し 、 プ ロ ト ン ポ ン プ と 呼 ば れ て い る Mgイ オ ン 依 存 性 ATPase(10‑12)は、 細 胞 膜 を 貫 い て 存 在 し て い る (13，14)。 細 胞 膜 の 機 能 は エ ネ ル ギ ー 源 と し て糖質、 細 胞 構 成 成 分 と し て ア ミ ノ 酸 な ど の 窒 素 化 合 物 及 び 燐 酸 や 金 属 イ オ ン な ど を 取 り 込 み 、 い ろ い ろ な 代 謝 産 物 ( 例 え ば 、 ア ル コ ー ル ) を 体 外 に 排 出 し て い る と 考 え ら れ て い る 。 こ れ ら の 物 質 の ほ とんどは、 ATPな ど の エ ネ ル ギ ー を 使 っ た 能 動 輸 送 な ど の 特 異 的 な 機 構 に よ り 輸 送 さ れ る (8 )。例えば、 ア ミ ノ 酸 はATPを エ ネ ル ギ ー と し

て 、 細 胞 内 外 に 形 成 さ れ た 電 気 化 学 的 ポ テ ン シ ャ ル ( プ ロ ト ン 勾 配 ) に従って、 プ ロ ト ン の 細 胞 内 流 入 に 伴 う シ ン ポ ー ト と 呼 ば れ る 機 構 に よ り 取 り 込 ま れ る と 言 わ れ て い る (15，16)。 こ の よ う に 細 胞 膜 は 物 質 透 過 を 制 御 し 、 細 胞 内 を 外 部 環 境 か ら 隔 て る 重 要 な 構 造 体 で あ る 。

酵 母 細 胞 膜 の 内 側 に は 、 酸 化 的 燐 酸 化 や ト リ カ ル ボ ン 酸 サ イ ク ル な ど エ ネ ル ギ 一 生 産 機 能 を 有 す る こ 枚 の 単 位 膜 ( 二 重 膜 ) に 包 ま れ た ミ ト コ ン ド リ ア 、 細 胞 の 遺 伝 情 報 を 担 っ て い る 染 色 体 DNAな ど を 含 む 二 重 膜 に 包 ま れ た 核 、 各 種 加 水 分 解 酵 素 を 含 む マ イ ク ロ ボ デ ィ ー 及び液胞、 タ ン パ ク 質 合 成 に 関 与 す る リ ボ ソ ー ム 、 リ ボ ソ ー ム を 表 面 に 付 着 し た 粗 面 小 胞 体 、 リ ボ ソ ー ム の 付 着 し て い な い 滑 面 小 胞 体 、

タ ン パ ク 質 な ど の 分 泌 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た す ゴ ル ジ 体 、 細 胞

5 

内 部 の 構 造 維 持 や 細 胞 分 裂 の 際 に 重 要 な 働 き を す る 細 胞 骨 格 (サ イ ト ス ケ ル ト ン ) な ど の 構 造 体 を 含 ん で い る 。 残 り を 占 め る の が 細 胞 質 で 解 糖 系 な ど の 酵 素 が 存 在 し て い る 。 酵 母 の こ の よ う な 細 胞 内 構 造 体 ( オ ル ガ ネ ラ ) は 、 酵 母 が 表 層 に 細 胞 壁 を 有 す る こ と 以 外 、 高 等 動 物 細 胞 の そ れ と 大 差 な い 。 こ の こ と は 、 酵 母 細 胞 が 高 等 生 物 の モ デ ル と 云 わ れ る 理 由 で あ る 。 従 っ て 、 酵 母 に お い て 解 明 さ れ た 機能は、 若 干 の 修 正 を 加 え ね ば な ら な い と は 言 え 、 高 等 動 物 細 胞 に お い て も 適 用 で き る こ と が 多 い 。 ま た 、 酵 母 は 他 の 真 核 生 物 と 比 べ て 生 育 速 度 が 早 く 、 簡 単 な 培 地 で 迅 速 に 増 殖 す る た め 、 短 期 間 で 多 量 の 細 胞 が 容 易 に 得 ら れ る の で 、 真 核 生 物 の 実 験 材 料 と し て 適 し て

い るo

Z .   rouxi i

、

c .

 ̲y

ersatili s

、

Candida  etchels e

、

Pi c h i  

_~

mis

旦、

D  ebaryomyces  hanseni i

な ど の 醤 油 ・ 味 噌 の 製 造 過 程 で 見 い だ さ れ る 酵 母 は 生 育 条 件 が 他 の 酵 母 の そ れ と 著 し く 異 な る 。 古 来 よ り 利 用 さ れ て き た 伝 統 的 な 調 味 料 は 製 造 過 程 に お い て 多 量 の 食 塩 が 使 用 さ れるため、 こ れ ら の 酵 母 は 耐 塩 性 を 有 す る 。 ま た 高 濃 度 の 糖 質 環 境 下 で 生 育 で き る 耐 糖 性 も 有 し て お り 、 こ れ ら 酵 母 の う ち 幾 種 類 か

は 高 濃 度 の 糖 を 含 む 食 品 ( 例 え ば ジ ャ ム ・ チ ョ コ レ ー ト ・ 蜂 蜜 な ど ) の 腐 敗 菌 と し て も 見 い だ さ れ て い る 。 一 般 的 に 、 こ れ ら の 酵 母 は 高 い 浸 透 圧 下 で 生 育 で き る た め 、 耐 浸 透 圧 性 酵 母 と 呼 ば れ て い る 。 一 方 、 酵 母 の 代 表 と 言 わ れ る

Q .   c ̲ erevisia e

は、 上 記 の よ う な 高 濃 度 食 塩 や 糖 質 を 含 む 環 境 下 で は 生 育 で き な い 浸 透 圧 感 受 性 で あ る 。 飽 和 濃 度 の 食 塩 を 含 む 環 境 に お い て も 生 育 で き る

Z . rouxi i

な ど の 酵 母 は 、 進 化 の 段 階 で そ の よ う な 環 境 に 適 応 す る た め に 生 理 的 に 特 殊 な 機 構 を 獲 得 し た も の と 考 え ら れ る 。 本 研 究 で は 、 酵 母 の 耐 塩 性 機

構 を 論 述 す る ( 耐 塩 性 と の 関 連 が あ る の で 、 併 せ て 耐 浸 透 圧 性 機 構 に も 言 及 し て い る ) が 、 そ の 機 構 の 全 容 を 明 ら か に で き れ ば 、 ア ル コ ー ル 発 酵 な ど に 用 い ら れ る 非 耐 塩 性 酵 母 の 耐 塩 性 化 や 、 将 来 、 塩 化 の 進 ん で い る 土 壌 に 生 育 可 能 な 非 耐 塩 性 の 食 料 植 物 ヘ 耐 塩 性 の 付 与 が で き る な ど 応 用 ・ 利 用 が 期 待 さ れ る 。 こ れ ら 耐 塩 性 ・ 耐 浸 透 圧 性 酵 母 の 持 つ 生 理 機 能 や 環 境 適 応 機 構 と し て 、 現在、 明 ら か に さ れ て い る こ と を 以 下 に 要 約 す る 。

わ が 国 で は

z .

rouxi iな ど の 醤 油 ・ 味 噌 酵 母 は 伝 統 的 に 利 用 さ れ ており、 製 造 過 程 の 短 縮 化 な ど 産 業 的 な 要 求 か ら 、 こ れ ら 酵 母 の 発 酵 産 物 (17)や 最 適 生 育 条 件 (18‑21)に つ い て 多 く の 研 究 者 に よ り 追 究

さ れ て い る 。 こ れ ら 酵 母 の 特 徴 的 な 発 酵 産 物 と し て 、 ま ず 後 述 の よ う な グ リ セ ロ ー ル な ど の ポ リ オ ー ル が あ げ ら れ る (22)。また、 醤 油 や 味 噌 酵 母 の 発 酵 過 程 で 生 ず る 香 気 成 分 と し て 、

Z .  

^{rouxi iで は2‑}

フ ェ ニ ー ル エ タ ノ ー ル を 、 C andid a属 酵 母 で は4ー エ チ ル グ ア ヤ コ ー ル・ 4‑エ チ ル フ ェ ノ ー ル ・ 2‑フ ェ ニ ー ル エ タ ノ ー ル を 生 産 す る (23‑

25)。 官 能 試 験 で 優 れ た 市 販 醤 油 は 4‑エ チ ル グ ア ヤ コ ー ル を 多 く 含 む と 言 わ れ て い る 。 また、 C andid a属 酵 母 で は 酢 酸 を 生 産 し 、 生 産 さ れ た 酢 酸 が 香 味 に 関 係 し て い る こ と が 知 ら れ て い る (23‑25)。 耐 浸 透 圧 性 酵 母 の 生 育 条 件 の 検 討 か ら 高 濃 度 食 塩 培 地 で は そ れ ら 酵 母 の 最 適 生 育 温 度 は 高 温 度 側 に シ フ ト し (26)、 最 適 生 育pHが 狭 ま る こ と が 明 ら か に さ れ て い る (27，28)。

こ れ ら の 酵 母 の 耐 浸 透 圧 性 機 構 に つ い て は 醤 油 ・ 味 噌 酵 母 の 発 酵 生 産 物 と 生 育 環 境 中 に 含 ま れ る 高 濃 度 食 塩 や 糖 質 に 由 来 す る 浸 透 圧 に 関 連 し て 検 討 さ れ て い る 。 仮 に 培 地 の 食 塩 や 糖 質 に 由 来 す る 浸 透 圧 に 抗 し て 細 胞 内 の 浸 透 圧 が 変 化 し な い と す る と 、 細 胞 膜 を 墳 と し

7 

て そ の 両 側 で 浸 透 圧 差 が 起 こ り 、 細 胞 膜 に 物 理 的 力 が 掛 か る こ と に な る 。 植 物 細 胞 で は そ の よ う な 条 件 に お か れ る と 細 胞 膜 が 細 胞 壁 か ら外れ、 内 側 に 縮 ん だ 原 形 質 分 離 と 呼 ば れ る 現 象 を 起 こ す 。 しかし、

高 濃 度 の 食 塩 な ど を 含 ん だ 環 境 で 生 育 で き る 耐 浸 透 圧 性 酵 母 は そ の よ う な 現 象 を 示 さ ず 、 旺 盛 に 生 育 す る 。 従 っ て 、 耐 浸 透 圧 性 酵 母 は 細 胞 外 環 境 の 浸 透 圧 に 答 応 し て 細 胞 内 浸 透 圧 を 上 昇 さ せ る 機 構 が 存 在 す る と 考 え ら れ 、 そ の 機 構 と し て 、 前 述 の ポ リ オ ー ル 生 産 と の 関 係 が 示 さ れ た 。 高 濃 度 の 食 塩 培 地 で 培 養 し た 耐 浸 透 圧 性 酵 母 は 、 グ リ セ ロ ー ル ・ D‑マ ン ニ ト ー ル ・ エ リ ス リ ト ー ル ・ D‑ア ラ ピ ト ー ル な ど の 多 価 ア ル コ ー ル ( ポ リ オ ー ル ) を 多 量 に 生 産 す る 。 生 産 効 率 を 利 用 さ れ る 糖 の 重 量 比 で 表 示 す る と 、

C  andida  mannitofacien s

と

C .   versatili s

で は グ リ セ ロ ー ル ・

D ‑

マ ン ニ ト ー ル を そ れ ぞ れ

6 0 %

と 46%(29) 、~.旦li旦でグリセロール・ D- マンニトール・エリスリトー

ル を

42%(17)

、Z̲.

I o  u x  

i i で グ リ セ ロ ー ル ・

D ‑

ア ラ ビ ト ー ル を

4 0 % ( 1 7

，

3 0 )

、

1 2 .

.[主主主で D‑ア ラ ピ ト ー ル を

2 0

先 生 産 す る と 計 算 さ れ た

( 

17) 。浸透圧感受性酵母である~.  c̲

erevisiae

で は 、 通 常 そ の 効 率 は2か ら 8%で あ る の で (1 7 ) 、 耐 浸 透 圧 性 酵 母 で は 生 産 性 が 非 常 に 高 い こ と に な る 。 耐 浸 透 圧 性 酵 母

1 2 . h  anseni i

を 用 い た

Gustafsson

と

Norkrans

^{の研究は、} 生 産 さ れ た ポ リ オ ー ル に よ る 浸 透 圧 が 培 地 中 の 食 塩 の 浸 透 圧 に ほ ぼ 一 致 し て い た こ と を 示 し 、 こ れ ら ポ リ オ ー ル が 浸 透 圧 の 調 節 を 行 っ て い る こ と を 証 明 し た (3 1 ) 。 ポ リ オ ー ル 生 産 機 構 に つ い て は 、 ペ ン ト ー ス サ イ ク ル の 中 間 体 で あ る Dー リ プ ロ ー ス ー

5‑燐 酸 が ホ ス フ ァ タ ー ゼ に よ り 脱 燐 酸 化 さ れD‑リ プ ロ ー ス と な り 、 NADPH依 存 性 酸 化 還 元 酵 素 ( ポ リ オ ー ル デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ ) に よ り D‑ア ラ ビ ト ー ル と な る こ と 、 ま た 解 糖 系 初 期 の 中 間 産 物 で あ る ジ ヒ

ド ロ キ シ ア セ ト ン 燐 酸 がNADH依 存 性 ポ リ オ ー ル デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ に よ り 還 元 さ れ グ リ セ ロ 燐 酸 と な り 、 ホ ス フ ァ タ ー ゼ に よ り 脱 燐 酸 化 さ れ グ リ セ ロ ー ル と な る こ と が 明 ら か に さ れ て い る (32 。)

耐 塩 性 酵 母 の 耐 塩 性 機 構 を 考 え る 場 合 、 S taphylococcus  aureu s、 Micrococcus  h alodenitrifican s、Halobacterium  cutirubru mな ど の 耐 塩 性 ・ 耐 浸 透 圧 性 細 菌 類 に 関 す る 成 果 が 参 考 に な る で あ ろ う 。 H alobacterium属 の 細 菌 は4M以 上 の 食 塩 を 含 む 培 地 で 生 育 可 能 で あ

り 、 極 め て 耐 塩 性 ( 耐 浸 透 圧 性 ) で あ る 。 また、 こ れ ら 耐 塩 性 細 菌 の う ち 生 育 の た め に 一 定 以 上 の 食 海 を 要 求 す る 好 塩 性 を 示 す も の も あ る 。 畝 本 は こ れ ら 耐 塩 性 ・ 好 塩 性 細 菌 を 四 種 類 に 分 類 し て い る ( 33 ) 。 第 一 の グ ル ー プ は 非 好 塩 性 細 菌 で 、

Q .

.e:ureu sな ど はOMから 3.8M食 塩 濃 度 の 範 囲 で 生 育 可 能 で あ る ( 但 し 最 適 生 育 食 塩 濃 度 はOM から O.5Mで あ る ) 。 第 二 は 海 洋 細 菌 で 、 Vibrio  alginolyticu sな ど はO.2Mか ら 1.8M食 塩 濃 度 で 生 育 可 能 で あ る ( 最 適 生 育 濃 度 O.3Mから 1 

. 0  

M)。 第 三 は 中 度 好 塩 性 細 菌 で 、 f 1 .

h 

alodenitrifican sな ど は O.3Mから 4Mの 範 囲 で 生 育 で き る ( 最 適 生 育 濃 度 O.8Mから 1. 6M ) 。 第 四 は 高 度 好 塩 性 細 菌 で 、

H .   c ̲

utirubrumな ど は 2.5Mから 4M以 上 の 範 囲 で 生 育 で き る ( 最 適 生 育 濃 度3.4M以 上 ) 。 上 記 の 酵 母 類 の 場 合 の ポ リ オ ー ル 生 産 に よ る 耐 性 機 構 と は 異 な り 、 こ れ ら 耐 塩 性 ・ 耐 浸 透 圧 性 細 菌 は 浸 透 圧 を 調 節 す る た め に 有 機 酸 ・ ア ミ ノ 酸 ・ カ リ ウ ム イ オ ン ・ ナ ト リ ウ ム イ オ ン ・ 塩 素 イ オ ン な ど の 物 質 を 細 胞 内 に 蓄 積 す る(33 ) 。 こ れ ら の 物 質 が 浸 透 圧 調 節 剤 と し て 選 択 さ れ 、 か つ 有 効 に な る 理 由 に つ い て は BrownのCompatible solute説 が 有 名 で あ る (34， 35)。即ち、 あ る 物 質 が 細 胞 内 に 多 量 に 蓄 積 し た と き 、 そ の 物 質 が 細 胞 内 の 酵 素 反 応 を 阻 害 す る と た と え 浸 透 圧 が 調 節 さ れ た と し て も そ

9 

の 細 胞 は 生 育 で き な い 。 そ れ で 、 多 量 に 細 胞 内 に 蓄 積 し で も 細 胞 代 謝 に 悪 影 響 を 及 ぼ さ な い 物 質 が 有 効 に な る 。 上 記 の 物 質 は 細 胞 内 に 高 濃 度 存 在 し て も 酵 素 作 用 を 機 能 的 に 保 つ 物 質 で あ り 、

Compatible  solute

と 呼 ば れ て い る 。

こ れ ま で に 述 べ た よ う に 酵 母 の 耐 塩 性 は 、 浸 透 圧 と ナ ト リ ウ ム イ オ ン な ど の イ オ ン 分 布 の 調 節 の 二 面 性 に よ っ て 成 り 立 っ て い る と 言 う こ と が で き る 。 耐 塩 性 酵 母 の 浸 透 圧 調 節 に 関 す る 研 究 は 、 耐 浸 透 圧 性 機 構 を よ く 説 明 し て い る と 考 え ら れ る が 、 食 塩 に 対 す る 耐 性 機 構 ( 耐 塩 性 機 構 ) を 説 明 す る に は 不 十 分 で あ る と 考 え る 。 そ の 根 拠 と な る 事 例 と し て 、

z . .   rouxi  i

の 塩 感 受 性 変 異 株 の 中 に 、 耐 塩 性 は 失ったが、 な お 耐 糖 性 ( 耐 浸 透 圧 性 ) を 示 す 株 が 得 ら れ た こ と が 上 げ ら れ る

( 3 6

，

3 7 )

。 こ の こ と は 、

Z .   rouxi  i

の 耐 塩 性 と 耐 浸 透 圧 性 が 別 々 の 機 構 に よ り 制 御 さ れ て い る こ と を 示 唆 し て い る 。 食 塩 は 水 溶 液 中 で は ナ ト リ ウ ム と 塩 素 イ オ ン か ら 成 っ て お り 、 また、 耐 塩 性 酵 母 は 、 高 濃 度 食 塩 環 境 下 で も 細 胞 内 ナ ト リ ウ ム イ オ ン 濃 度 を 低 く 抑 え て い る の で (38、39)、 食 塩 に よ る 浸 透 圧 以 外 に 両 イ オ ン に 対 す る 細 胞 の 応 答 を 考 慮 す る 必 要 が あ る 。

本 論 文 で は 耐 塩 性 酵 母 細 胞 の 持 つ 食 塩 に 対 す る 耐 性 機 構 の 解 明 を 目的とし、 以 下 に 述 べ る 順 序 と 理 由 で 、 ① 細 胞 脂 質 の 変 化 、 ② 解 糖 系 酵 素 の 変 化 、 ③ 細 胞 内 イ オ ン 分 布 に 関 係 す る と 推 定 さ れ る 細 胞 膜

ATPase

の 性 質 に つ い て 追 究 し た 。 当 然 、 食 塩 に 対 す る 耐 浸 透 圧 性 に つ い て も 考 慮 に い れ て 研 究 を 進 め た 。

( 1 ) ナ ト リ ウ ム や 塩 素 イ オ ン が 影 響 す る 部 位 と し て 細 胞 膜 が 考 え ら れ る 。 上 述 の 通 り 細 胞 膜 は 燐 脂 質 、 ス テ ロ ー ル な ど の 脂 質 か ら な る 単 位 膜 に タ ン パ ク 質 が 埋 も れ た 構 造 で あ る の で 、 ナ ト リ ウ ム と

塩 素 イ オ ン あ る い は 食 塩 自 体 が 脂 質 単 位 膜 の 流 動 性 な ど に 影 響 を 及 ぼ す と 考 え ら れ る (40)。それ故、 耐 塩 性 酵 母 細 胞 は そ れ ら の 影 響 を 緩 和 す る た め に 適 応 機 構 を 持 つ も の と 推 察 さ れ る 。 しかしながら、

培 地 食 塩 濃 度 と 細 胞 脂 質 の 関 係 を 検 討 し た 研 究 は 、 Mogiら の 脂 肪 酸 組 成 の 分 析 (4 1 )がある程度で、 ほ と ん ど 行 わ れ て い な か っ た 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、 ま ず 耐 塩 性 酵 母

Z .

rouxi i及 び

c .

y ersatilis  を 実 験 材 料 と し て 培 地 食 塩 濃 度 に 依 存 し た 細 胞 脂 質 組 成 の 変 化 を 検 討 し た ( 第 1章 、 第 2章 、 第 3章)。

( 2 ) 非 耐 塩 性 酵 母 に 分 類 さ れ て い る ̲ s . ̲Q erevisia e細 胞 の 解 糖 系 酵 素 エ ノ ラ ー ゼ 、 グ リ セ ロ ア ル デ ヒ ド ‑3‑燐 酸 脱 水 素 酵 素 に 対 す る 抗 血 清 ( 抗 体 )

( 4 2 )

を用いて、 い ろ い ろ な ス ト レ ス に よ る 両 酵 素 の 量 的 変 化 を 検 討 し た 結 果 、 両 酵 素 の ア イ ソ ザ イ ム の 発 現 が 食 塩 ス ト

レ ス に よ っ て 特 異 的 に 制 御 さ れ て い る こ と を 見 い だ し た ( 第 4章、 第 5章)。 これは、 解 糖 系 酵 素 の 発 現 が 食 塩 ス ト レ ス に 依 存 し て 制 御 さ れ る こ と を 示 す 最 初 の 知 見 で あ るo

( 3 ) 細 胞 は 物 質 の 能 動 的 輸 送 の た め に 細 胞 膜 の 内 側 と 外 側 で ナ ト リ ウ ム イ オ ン ・ カ リ ウ ム イ オ ン ・ プ ロ ト ン の 濃 度 勾 配 を 形 成 し て い る (43 )。従って、 濃 度 勾 配 形 成 に 関 与 す る 酵 母 細 胞 膜 の ATPase

( マ グ ネ シ ウ ム イ オ ン 依 存 性 ATPaseで あ る と い わ れ て い る

(12‑14))

の 作 用 も 耐 塩 性 酵 母 の 耐 塩 性 に お い て 重 要 で あ る と 考 え ら れ る が 、 こ の 酵 素 に つ い て の 検 討 は こ れ ま で ほ と ん ど 行 わ れ て い な か っ た 。 耐 塩 性 酵 母 の 生 育 に 対 す る い ろ い ろ な 薬 剤 の 影 響 を 検 討 し 、 耐 塩 性 酵 母 の 高 濃 度 食 塩 を 含 む 培 地 で の 生 育 に と っ て プ ロ ト ン 勾 配 が 重 要 で あ る こ と を 示 唆 す る 結 果 を 得 た ( 第 6章)。 さらに、

Z .

rouxii  の 細 胞 膜 プ ロ ト ン ATPaseの 酵 素 的 性 質 を 検 討 し 、 非 耐 塩 性 酵 母 ̲ s. 

4 .

. 

1 〆

c erevisiaeの そ れ と は 異 な る 特 性 を 持 つ こ と を 見 い だ し た (第 7 章)。 また、

S .  

^{̲Q erevisiae}細 胞 膜 プ ロ ト ン ATPase遺 伝 子DNAを 用 い た ク ロ ス ハ イ プ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 法 に よ り

Z .

rouxi iの 細 胞 膜 プ ロ トン ATPaseの 遺 伝 子 を 単 離 し 、 構 造 解 析 を 行 い 、 そ の タ ン パ ク 質 の 構 造 や 性 質 を 推 定 し 、 耐 塩 性 と の 関 係 を 言 及 し た ( 第 8章)。

第 1章

耐 塩 性 酵 母 Zygosaccharomyces  rouxi iの 脂 質 組 成 に 及 ぼ す 食 塩 の 影 響

1・ 1 緒 言

わ が 国 の 伝 統 的 な 調 味 料 で あ る 味 噌 や 醤 油 は 高 濃 度 の 食 塩 (NaCl) を 含 む 大 豆 食 品 で あ る 。 耐 塩 性 酵 母 Zygosaccharomyces  rouxi i (旧 名 Saccharomyces rouxi i ) は 、 高 濃 度 食 塩 存 在 下 で 生 育 で き る た め 、

こ れ ら の 食 品 の 発 酵 段 階 に 関 与 す る 主 発 酵 性 酵 母 で あ る (46)。 一 般 的 に 、 高 濃 度 食 塩 条 件 は 生 物 が 生 存 す る 上 で 非 常 に 過 酷 な 環 境 で あ るので、 そ の よ う な 環 境 下 で 生 育 可 能 な 本 酵 母 は 高 濃 度 食 塩 に 対 し で あ る 種 の 防 御 機 構 を 獲 得 し て い る と 考 え ら れ る 。

一般に、 細 胞 が 高 濃 度 食 塩 培 地 で 生 育 す る 場 合 、 細 胞 内 の 浸 透 圧 を 何 等 か の 方 法 で 高 め な い 限 り 細 胞 膜 の 内 側 と 外 側 で 浸 透 圧 差 が 起 こ り 、 細 胞 膜 に 物 理 的 な 力 が 掛 か る こ と に な る 。 そ の 差 を 緩 衝 す る 機 構 と し て 、 本 酵 母 を 含 む 耐 塩 性 酵 母 は 細 胞 内 に グ リ セ ロ ー ル 、 ア ラ ビ ト ー ル な ど い わ ゆ る ポ リ オ ー ル を 蓄 積 し 、 細 胞 膜 に か か る 浸 透 圧 差 に 起 因 す る 物 理 的 力 を 緩 和 す る (31，34，35，46，47)。 こ の 機 構 は 食 塩 に よ る 浸 透 圧 と い う 物 理 的 影 響 に 対 す る 適 応 現 象 を よ く 説 明 し ている。

耐 塩 性 酵 母

Z .

rouxi iは 古 来 よ り 利 用 さ れ て い る た め 、 本 酵 母 の 発 酵 生 産 物 (17)や 最 適 生 育 条 件 (18‑21)な ど に つ い て 多 く の 研 究 が な さ れ て い る 。 また、 酵 母 細 胞 の 生 育 に 及 ぼ す 培 養 温 度 や 培 地 の ア ル コ ー ル 濃 度 な ど の 環 境 因 子 の 影 響 に つ い て 、 細 胞 膜 脂 質 と の 関 連 性 に 重 点 を お い た 多 く の 研 究 も な さ れ て き た 。 し か し な が ら 、 耐 塩 性

13 

酵 母 の 培 地 食 塩 濃 度 に 依 存 し た 細 胞 脂 質 の 変 化 に 関 す る 研 究 は こ れ ま で ほ と ん ど な さ れ て い な い 。 そこで、 本 章 で は 耐 塩 性 機 構 を 追 求 す る 本 論 文 の 最 初 と し て 、 耐 塩 性 酵 母

z .

rouxi i細 胞 の 脂 質 組 成 と 培 地 食 塩 濃 度 の 関 係 を 検 討 し た 次 第 を 記 述 す る 。 な お 、 本 章 の 大 部 分 の 内 容 は 既 に 学 会 誌 に 報 告 し て い る (44，45)。

1・2 実 験 方 法 1・2 ・ 1 使 用 菌 株

耐 塩 性 酵 母 と し て は 、 主 と し て

Z .

rouxi i ATCC42981株 を 使 用 し 、 ま た 比 較 と し て IAM4028、 S84、 G10‑1、 S2‑B ( 全 て 野 生 型 ) の 4 菌 株 を 使 用 し た 。 非 耐 塩 性 酵 母 と し て は 、 S accharomyces  cerevisiae  0‑11‑4株 ( 野 生 型 ) を 使 用 し た 。

z .

rouxi i ATCC42981株 は 農 林 水 産 省 食 品 総 合 研 究 所 か ら 、

Z .

rouxi i S84、 G10‑1 お よ び S2‑B株 は 新 潟 県 食 品 研 究 所 か ら (27)、.s. .Q erevisiae  0‑11‑4株 は 三 共 株 式 会 社 か ら 供 与 さ れ た 。 こ れ ら の 酵 母 細 胞 は 、 2%(w/v)寒 天 を 含 む 下 記 の 組 成 の YM斜 面 培 地 で4⁰Cで 保 存 し た 。

1・2 ・2 使 用 培 地

使 用 し た 培 地 の 組 成 は O.3%(w/v)酵 母 エ キ ス 、 O.3%(w/v)麦 芽 エ キ ス、 O.5%(w/v)ポ リ ペ プ ト ン 、 l%(w/v)グ ル コ ー ス で あ り 、 こ の 培 地 を 以 下YM培 地 と 呼 ぶ 。 YM培 地 に は 必 要 に 応 じ て 1Mか ら 3Mま で の 食 塩 を 添 加 し た 。 培 地 の pHは 食 塩 添 加 後 に 塩 酸 溶 液 に よ り pH4.8に 調 節 し た。但し、

Z .  

rouxi i S2 ‑B株 用 のYM培 地 は pH 4.6に 調 節 し た (27)。

1・2 ・3 培 養 方 法

Z.  rouxi i細 胞 は 以 下 の 方 法 に よ り 培 養 し た 。 前 培 養 と し て 、 保 存 用 斜 面 寒 天 培 地 か ら 一 白 金 耳 の 酵 母 細 胞 を YM培 地 (

5  m  1 

)に接種し、

30⁰Cで 二 日 間 静 置 培 養 し た 。 本 培 養 と し て 、 前 培 養 液 を OM、 1M、 2M、 3Mの 食 塩 を 含 む YM培 地 (95ml)に移し、 30⁰

C

で 振 と う (95回/分)培養し た。 40時 間 培 養 後 、 細 胞 を 遠 心 分 離 (1000xg，10分 間 ) に よ り 集 菌 し 、 水で三度洗浄した。~. ~ erevisia e細 胞 の 培 養 は 本 培 養 液 と し て OM、 0.3M、 0.6M、 1.0Mの 食 塩 を 含 むYM培 地 を 用 い た 以 外 、

z .

rouxi i培 養 と 同 様 で あ っ た 。 両 酵 母 細 胞 の 生 育 度 は ト ー マ 血 球 測 定 盤 を 用 い た 細 胞 数 の 計 測 及 び 培 養 液 の 濁 度 (660nm)の 計 測 に よ り 見 積 っ た 。 特 定 の 食 塩 濃 度 の 培 地 で 培 養 し た 細 胞 を 異 な る 食 塩 濃 度 の 培 地 ヘ 転 移 す る 方 法 は 以 下 の 通 り で あ る 。 即 ち 、 30⁰Cで 定 常 期 ( 約42時 間 )

ま で 振 と う 培 養 し た 細 胞 培 養 液 (100ml)の 一 部 (30ml)か ら 細 胞 を 集 菌 し 、 各 濃 度 の 食 塩 を 含 む YM培 地 (50ml)に懸濁し、 30⁰

C

で 振 と う 培 養 した。

1・2 ・4 脂 質 の Ia Cラ ベ リ ン グ

細 胞 脂 質 の 放 射 性 ラ ベ リ ン グ は 細 胞 を 2.5μC iの (1‑¹⁴C)酢 酸 ナ ト リ ウ ム (New England  Nuclear， 59mCi/mol) を 含 む YM培 地 で 振 と う 培 養 す る こ と に よ り 行 っ た 。

1・2 ・5 細 胞 形 態 観 察

各 種 の 食 塩 濃 度 の 培 地 で 培 養 し た

Z .

rouxi i細 胞 の 形 態 観 察 は 顕 微 鏡 下 で 行 い 、 写 真 撮 影 し た 。

1・2 ・6 細 胞 脂 質 の 抽 出

15 

酵 母 細 胞 は 細 胞 表 層 に 強 固 な 細 胞 壁 を 持 つ た め 、 直 接 有 機 溶 媒 抽 出 の 試 料 と し て 利 用 で き な い 。 そ こ で 、 酵 母 細 胞 を 以 下 に 示 し た 方 法 で 処 理 す る こ と に よ り 細 胞 壁 を 除 去 し た 。 即 ち 、 集 菌 し て 得 ら れ 一 定 量 の 細 胞 を 4mlの チ モ リ ア ー ゼ 緩衝 液 [0 . 8M塩 化 カ リ ウ ム 、

o  . 

1 

H

亜 硫 酸 ナ ト リ ウ ム を 含 む

O . l M

ト リ ス 一 塩 酸 緩 衝 液

( p H 7.5)J

に 懸 濁

し、 0.9mgの チ モ リ ア ー ゼ 6000を加え、 30⁰

C

、 45分 間 イ ン キ ユ ペー ト す る こ と に よ り 酵 母 細 胞 を ス フ エ ロ プ ラ ス ト 化 し た 。 細 胞 脂 質 は ス ブ エ ロ プ ラ ス ト か ら 図 3 に 示 し た BlighとDyerの 方 法 (48) に 従 い 抽 出

した。

1 . 2・7 脂 質 分 析

中 性 脂 質 は 以 下 の よ う に 分 離 し た 。 1. 2

・

6に 示 し た よ う に 抽 出 し た 細 胞 脂 質 溶 液 ( ク ロ ロ ホ ル ム 溶 液 ) を 漉 縮 乾 国 後 、 200μlの ク ロ ロ ホ ル ム / エ タ ノ ー ル 混 合 液 (2:1，v/v)に 溶 解 し た 。 そ の 脂 質 溶 液 1μlを イ ア ト ロ ス キ ャ ン ( ヤ ト ロ ン ラ ボ ラ ト リ ー 社 製 、 TH‑l0型 ) 用 ク ロ マ ロ ッ ド に ス ポ ッ ト し た 。 溶 媒 を 除 去 し た 後 、 そ の ク ロ マ ロ

ッ ド 上 の 脂 質 を n‑ヘ キ サ ン / エ ー テ ル / ギ 酸 混 合 液 (90:10:1，v/v)を 用 い て 分 離 し た 。

燐 脂 質 は 以 下 の よ う に 分 離 し た 。 脂 質 溶 液 50μlを シ リ カ ゲ ル プ レ ー ト ( メ ル ク 社 製 、 5cmx 20cm) に ス ポ ッ ト し た 。 そ の プ レ ー ト 上 の 脂 質 を 上 記 の

n ‑

ヘ キ サ ン / エ ー テ ル / ギ 酸 混 合 液 を 用 い て 分 離 し た 。 燐 脂 質 は ス ポ ッ ト 原 点 、 に 残 存 す る の で 、 そ の 区 分 の シ リ カ ゲ ル を プ

レ ー ト か ら か き 取 り 、 ク ロ ロ ホ ル ム / エ タ ノ ー ル 混 合 液 で シ リ カ ゲ ル か ら 燐 脂 質 を 抽 出 し た 。 溶 媒 を 除 去 し た 後 、 燐 脂 質 を 50μlの ク ロ

ロ ホ ル ム / エ タ ノ ー ル 混 合 液 に 溶 解 し 、 1μlを ク ロ マ ロ ッ ド に ス ポ

Sample  solution  (1  volume) 

Lower  phase 

(Chloroform  phase) 

Added methanol  (2.5  volumes)  Added chloroform  (1.25  volume)  Shaked vigorously  for  2 min. 

Allowed to  stand  at  room temperature  for  10  min.  Added chloroform  (1.25  volume) 

Shaked  vigorously for  30  sec.  Added water  (1.25  volume) 

Centrifuged at  1，000xg for  5 min. 

Fluff phase 

(Denatured protein) 

Upper phase 

(Methanol‑water phase) 

Lower phase 

Added  chloroform  (1.25  volume)  Sheked  vigorously for 30  sec.  Centrifuged 

Upper phase 

Total  lipid  fraction 

Fig.  3.  Bligh and Dyer' s Method for  Extraction of  Lipids. 

17 

ットした。 ク ロ マ ロ ッ ド 上 の 燐 脂 質 を ク ロ ロ ホ ル ム / メ タ ノ ー ル / 水 (50:60:4.5，v/v)を 用 い て 分 離 し た 。

ク ロ マ ロ ッ ド 上 に 分 離 し た 各 脂 質 成 分 は イ ア ト ロ ス キ ャ ン ( 炎 イ オ ン 検 出 器 ) を 用 い て 定 量 し た 。 図 4 ‑Aに イ ヤ ト ロ ス キ ャ ン

TH‑l0

を 用 い た 中 性 脂 質 、 図 4 ‑Bに 燐 脂 質 の 典 型 的 な 分 離 パ タ ー ン と 各 ピ ー ク の 成 分 名 を 示 し た 。 各 脂 質 成 分 の 同 定 は そ れ ぞ れ の 標 準 物 質 の 移 動 度 と の 比 較 に よ り 行 っ た 。 本 分 析 装 置 は 一 次 元 薄 層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で あ る が 、 各 成 分 は 互 い に 充 分 な 分 離 を 示 し た 。 各 デ ー タ は 三 測 定 値 の 平 均 値 と し た 。 こ の 測 定 法 に よ る 検 出 感 度 は 各 脂 質 成 分 に よ っ て 異 な っ て い る 。 ス テ ア リ ル ア ル コ ー ル を 基 準 と し た 時 の 相 対 的 検 出 感 度 は ス テ ロ ー ル エ ス テ ル 、 脂肪酸、 ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ール、 ス テ ロ ー ル 、 燐 脂 質 に つ い て そ れ ぞ れ 1. 2、 1. 0、 1. 3、 1 .2、

0 . 8 5

と し た

( 4 9 a )

。

け ん 化 脂 質 に 含 ま れ る 脂 肪 酸 の 分 析 は 以 下 の よ う に 行 っ た 。 脂 質 溶 液 を ス ク リ ュ ウ キ ャ ッ プ 付 き 試 験 管 に 入 れ 、 溶 媒 を 除 去 し た 後 、

2%(v/v)硫 酸 ‑ 無 水 メ タ ノ ー ル 液

4.5ml

を 加 え た 。 密 栓 後 、 試 験 管 を 70⁰Cで 一 時 間 加 熱 す る こ と に よ り 脂 肪 酸 を ト ラ ン ス メ チ レ ー シ ョ ン に よ り 脂 肪 酸 メ チ ル エ ス テ ル に 変 換 し た 。 冷却後、 メ タ ノ ー ル 溶 液 に

0 . 5 m l

の 水 を 加 え た 。 そ の 溶 液 に 含 ま れ る 脂 肪 酸 メ チ ル エ ス テ ル を

5 m l

の

n ‑

ヘ キ サ ン で 抽 出 し た 。 溶 媒 除 去 後 、 脂 肪 酸 メ チ ル エ ス テ ル を ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 定 量 し た 。 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

に は

1. 5 %

シ リ コ ン

SE‑30

の ガ ラ ス カ ラ ム

(2mx3 m m )

を 装 着 し た ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ( 島 津 製 作 所 製 、

GC‑4CM

型 ) を 用 い た 。 分 離 は

2 0 0

⁰

C

の 一 定 温 度 で 、 キ ャ リ ア ガ ス ( 窒 素 ガ ス ) 流 速 60mll分 の 条 件 下 で 行 っ た 。 脂 肪 酸 定 量 は 既 知 の 量 の パ ル ミ チ ン 酸 メ チ ル エ ス テ ル を 標 準 と

( 刊 l i

‑‑J 

l 十 ‑ ‑ i i

Fig.  4.  Typical Patterns of Neutral Lipids (A)  and Phospholipids  (B)  from Zygosaccharomyç~s 並区込 Cells by Iatoroscan  TH‑10. 

Total  lipids were extracted from cells cultured in  YM medium  containing 1M  NaCl， and analyzed by  Iatroscan TH‑I0  (TLC/FID  Analyzer). 

0， origin 

PL， phospholipids  FFA， free fatty acids  SE， sterol‑esters  PC， phosphatidylcholine  PE， phosphatidylethanolamine  UN， unknown components 

19 

F， front  S， sterol 

TG， triacylglycerol  LPL， lysophospholipids  PS， phosphatidylserine  PI， phosphatidylinositol 

し て 行 っ た 。 各 々 の デ ー タ は 三 測 定 値 の 平 均 値 と し た (50)。

1・2 ・8 二 次 元 薄 層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 及 び 燐 脂 質 に 含 ま れ る 放 射 活 性 の 測 定

1 4 Cで ラ ベ ル し た 脂 質 溶 液 を シ リ カ ゲ ル G薄 層 プ レ ー ト (20cmx20  cm)の 一 隅 に ス ポ ッ ト し た 。 一 次 展 開 溶 媒 と し て 、 ク ロ ロ ホ ル ム / メ タ ノ ー ル /28%ア ン モ ニ ア 水 (65:25:5，v/v)を 用 い て 脂 質 を 分 離 し た 。 溶 媒 除 去 後 、 二 次 展 開 溶 媒 と し て 、 ク ロ ロ ホ ル ム / ア セ ト ン / メ タ ノ ー ル / 酢 酸 / 水 (6:8:2:2:1，v/v)を 用 い て も う 一 度 分 離 し た 。 溶 媒 除 去 後 、 薄 層 プ レ ー ト を X線 フ ィ ル ム ( 富 士 フ ィ ル ム 、

R X )

に 押 し 当 て 、

‑50⁰

C

で放置し、 オ ー ト ラ ジ オ グ ラ ム を 得 た 。 また、 同 プ レ ー ト を ヨ ウ 素 蒸 気 中 に 置 き 、 各 燐 脂 質 成 分 を 検 出 し た 。 各 成 分 を シ リ カ ゲ ル と 共 に 試 験 管 に い れ 、 5m 1の ト ル エ ン で 燐 脂 質 を 抽 出 後 、 10m 1の 液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン 溶 液 [0.75%(w/v) 2，5ー ジ フ ェ ニ ル オ キ サ ゾ ー ル (PPO)及 び O.075%(w/v)1，4‑ピ ス (5‑フ ェ ニ ル ー2ー オ キ サ ゾ イ ル ) ベ ン ゼ ン(POPOP)を 含 む ト ル エ ン 溶 液 ] を 加 え 、 パ ッ カ ー ド 液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー を 用 い て 放 射 活 性 を 測 定 し た 。

1・3 結 果

1・3 ・1

Z .  

rouxi i と~.

  c ̲

erevisia e細 胞 の 生 育 に 及 ぼ す 食 塩 の 影 響

各 種 濃 度 の 食 塩 を 含 むYM培 地 で 培 養 し た

Z .

rouxi i ATCC42981 と

~.

  c ̲

erevisia e 0‑11‑4細 胞 の 生 育 を 検 討 し た 。 図 5‑Aの 生 育 タ イ ム コ ー ス に 示 さ れ た よ う に 、

Z .

rouxi i細 胞 は OM、 1M、 2M、 3M食 塩 を 含 むYM培 地 ( 以 下 、 そ れ ぞ れOM食塩、 1M食塩、 2M食塩、 3M食 塩 培 地

A 

FF   QJ

n u  

‑ ‑ a _{︐ .}    

106 

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M M

畑 州

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u F﹄

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今4

B 

0 1 2   Added NaCl  (M) 

Fig.  5.  Effects of NaCl  on  Growth of  Zygosaccharomyces回 虫ii and 

s .

accharomyee

̲ s  

cerevisiae Cells. 

A， time  courses  of  growth of 

Z .  

ro旦主iicells in YM medium containing  OM^{r v}3M NaCl.  B^， Ratio  of  growth  of 

Z .  

ro旦玉

i

よand ̲S.  ̲cerevisiae  cells. 

10 

1 .4 

守 ‑

N 

‑o oZ 4Z

f  

u

﹃

。

と 略 ) で 培 養 し た と こ ろ 、

Z .

rouxi i細 胞 の ダ プ リ ン グ タ イ ム は そ れ ぞ れ3時間、 3時間、 3 . 5時間、 6時 間 で あ っ た 。

Z .

rouxi i細胞は、

1M食 塩 培 地 で は 対 照 の OM食 塩 培 地 と ほ ぼ 同 じ 生 育 が 、 2M食 塩 培 地 で は 対 照 に 比 べ の 培 養 初 期 に ラ グ 期 が 生 じ た が 定 常 期 に 至 り 対 照 と 同 様の生育が、 3M食 塩 培 地 で は 著 し い 生 育 の 遅 れ が 認 め ら れ た 。 これ らのことは、

z .

rouxi i細 胞 の 生 育 が 培 地 の 食 塩 濃 度 の 増 加 に よ っ て 阻 害 さ れ る こ と を 示 し て い る 。 . s .

  c ̲

erevisia e に お け る 生 育 タ イ ム コ ー ス は 省 略 し た 。

図5‑Bに、

Z .

rouxi iと.s.

  c ̲

erevisia e細 胞 の 生 育 に 及 ぼ す 食 塩 の効果を、 定 常 期 の 細 胞 に つ い て 対 照 の OM食 塩 培 地 か ら 得 た 細 胞 数 に 対 す る 生 育 度 の 相 対 値 と し て 表 示 し た 。 最 終 的 に 定 常 期 で 得 ら れ た

Z .

rouxi i細 胞 量 は OM食 塩 培 地 に 比 べ て 1Mと 2M食 塩 培 地 で は そ れ ぞ れ 1.5倍、 1 .3倍 多 か っ た 。 こ の 食 塩 添 加 に よ る 細 胞 収 量 の 増 加 は 静 置 培 養 条 件 で は 認 め ら れ な か っ た の で ( デ ー タ 示 し て い な い ) 、 振 と う 培 養 の 効 果 、 即 ち 、 培 養 液 の 溶 存 酸 素 量 に 依 存 し て い る と 推 察された。

Z .

rouxi i細胞と異なり、.s.

  c ̲

erevisiae細 胞 の 生 育 は 培 地 の 食 塩 濃 度 に よ り 著 し く 抑 制 さ れ た 。 この結果は'l̲. rouxi iが 耐塩性であり、.s.

  c ̲

erevisiaeが 食 塩 感 受 性 で あ る こ と を 良 く 示 し

ている。特に、.s.

  c ̲

erevisiae細 胞 は 1M食 塩 培 地 で は ほ と ん ど 生 育 し な か っ た の で 、 以 降 で は 削 除 し た 。

1・3 ・2

Z .  

rouxi i細 胞 の 形 態 に 及 ぼ す 食 塩 の 影 響

OMか ら 3M食 塩 を 含 む YM培 地 で 培 養 し た

f .

rouxi i細 胞 の 形 態 を 顕 微 鏡 下 で 観 察 し 、 写 真 を 図 6に示した。 また、 細 胞 の 最 大 直 径 に 対 す る 最 小 直 径 の 比 を 各 細 胞 の 顕 微 鏡 写 真 か ら 計 測 し た と こ ろ 、 そ の

A  B 

c 

^D 

Fig.  6.  Micrographs of Zygosaccharomyces rouxii Cells.  A， in  OM NaCI‑YM medium  B， oin  1M NaCI‑YM medium  C， in  2M NaCI‑YM medium  D， in  3M NaCI‑YM medium  The scale bar represents 10μm. 

23 

値 は OM、 1M、 2M、 3M食 塩 培 地 で 培 養 し た 細 胞 で そ れ ぞ れ 0.90、 0.67、

o 

.65、 0.50であった。 こ の 結 果 は 培 地 の 食 塩 濃 度 の 増 加 と と も に 、

培 養 細 胞 の 形 が 球 形 か ら 卵 形 に 変 化 し た こ と を 示 し て い る 。 酵 母 細 胞 の 細 胞 の 形 は 細 胞 壁 、 細 胞 内 骨 格 な ど に よ り 決 定 さ れ て い る と 考 え ら れ る が 、 本 実 験 で は こ れ 以 上 追 究 し な か っ た 。

1  .  3

・

3 Z .   r o u x i  i

細 胞 の 脂 質 組 成 に 及 ぼ す 食 塩 の 影 響

図 7に 脂 質 含 量 に 対 す る 培 地 食 塩 濃 度 の 影 響 を 示 し た 。 各 脂 質 成 分 は 凍 結 乾 燥

z . r o   u x  

i i 細 胞 重 量

( m g )

当 り の 含 量

(μg)

と し て 表 示 した。 1Mと 2M食 塩 培 地 で 培 養 し た 細 胞 で は 、 OM食 塩 培 地 で 培 養 し た 細 胞 と 比 べ た 時 、 ス テ ロ ー ル エ ス テ ル 量 が 著 し く 増 加 し 、 ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル 量 は 減 少 し た 。 3M食 塩 培 地 で 培 養 し た 細 胞 で は 、 そ れ ぞ れ は OM食 塩 培 地 で 培 養 し た 細 胞 の レ ベ ル に 戻 っ た 。 さらに、 ス テ ロ ー ル と 遊 離 脂 肪 酸 量 は 培 地 の 食 塩 濃 度 の 増 加 と と も に 増 加 し た 。 一 般 的 に 遊 離 型 の 脂 肪 酸 は 細 胞 毒 性 を 持 っ て い る と 言 わ れ て い る の で 、 高 濃 度 の 食 塩 が 培 地 に 存 在 す る と き 、 遊 離 脂 肪 酸 が 細 胞 に 蓄 積 す る こ と は 、 耐 塩 性 酵 母 で あ っ て も 脂 質 代 謝 が 局 部 的 に 異 常 を き た し て い る と 推 測 さ れ る 。 燐 脂 質 は 3M食 塩 培 地 で そ の 含 量 が 若 干 低 い 以 外 は ほ ぼ 一 定 レ ベ ル に 維 持 さ れ て い た 。 ここで、 燐 脂 質 に 対 す る ス テ ロ ー ル の 比 ( ス テ ロ ー ル / 燐 脂 質 ，

μg/μg)

を 計 算 す る と 、 OM、

1M、 2M、 3M食 塩 を 含 む 培 地 で 培 養 し た 細 胞 で そ の 比 は そ れ ぞ れ 0.06、

o  . 

13、

o . 

14、

o . 

18であった。 こ の 結 果 は 培 地 食 塩 濃 度 の 増 加 と と も

に 燐 脂 質 当 り の ス テ ロ ー ル 量 が 増 加 し て い る こ と を 示 し て い る 。 図 8に 中 性 脂 質 組 成 ( 完 ) 、 燐 脂 質 組 成 (% ) 、 脂 肪 酸 組 成 ( %) に 及 ぼ す 培 地 食 塩 濃 度 の 影 響 を 示 し た 。 培 地 に 食 塩 が 存 在 す る こ と に よ り ホ

(三 ぢ υ﹂C凶

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_{∞え)民主己二}C戸一己きこ仏

にJ A U T

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S 

1  2  3  Added NaCl  (M) 

，..‑、、 げ1 Qj  仁J

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(1J 

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6 2  

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一﹂

4 

Effects of NaCl on Content of Lipid Components in 

Zygosaccharomyces盟 堅 註 Cells.

Fig.  7. 

T G

， triacylglycerol  S， sterols 

UN， unknown components 

25 

PL， phospholipids 

SE， sterol‑esters  FFA， free fatty acids 

( A)  _( B)  (C) 

ハ )

十 ‑C 

<lJ  C O 

E 

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O  しJ

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U .

1.  ̲ 

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1 2 0  

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0 

ω 

ω 

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1 

2 

Added 卜~aCI (M) 

2  3 

₂ 

3 

Fig.  8.  Effects of NaCl  on  Composition of Neutral  Lipids  (A)， Polar‑head Groups  in  Phospholipids  (B)， and  Cellular Fatty Acids  (C)  in  Zygosaccharomyces  rouxii  Cells. 

(A)  SE， sterol‑esters  FFA， free  fatty  acids  (B)  PC， phosphatidylcholine 

PI， phosphatidylinositol  LPL， lysophospholipids  The  percentage  of  unknown 

TG， triacylglycerol  S， sterols  UN， unknown  components 

PE， phosphatidylethanolamine  PS， phosphatidylserine  components was  omitted. 

ス フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル は 3. 5倍 に 増 加 し た 。 ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン と ホ ス フ ァ チ ジ ル エ タ ノ ー ル ア ミ ン の 変 化 は 小 さ か っ た 。 こ れ ら の こ と は 培 地 に 食 塩 が 存 在 す る こ と に よ り 、 極 性 基 に 負 の 荷 電 を も っ 燐 脂 質 が 増 加 す る こ と を 示 し て い る 。 脂 肪 酸 分 析 に お い て 、 培 地 食 塩 濃 度 の 増 加 と と も に 、 オ レ イ ン 酸 (18: 1、 炭 素 数 : 二 重 結 合 数 で 表 示 し て い る ) の 割 合 が 増 加 し 、 リ ノ ー ル 酸 (18:2)と パ ル ミ ト オ レ イ ン 酸 (16:1)の 割 合 が 減 少 し た 。 飽 和 脂 肪 酸 は パ ル ミ チ ン 酸 (16:0) 以 外 わ ず か し か 存 在 せ ず 、 培 地 食 塩 濃 度 に よ る 影 響 は ほ と ん ど 認 め

ら れ な か っ た 。 脂 肪 酸 の 不 飽 和 度 を 表 す 尺 度 に 、 以 下 の 式 に よ り 計 算 さ れ る 不 飽 和 イ ン デ ッ ク ス (U . I . )がある。即ち、 U.I.=~ (脂肪酸 の完×二重結合の数)である。 この U. I . は 培 地 食 塩 濃 度 増 加 と と も に 減少した。

1・3 ・4 ~. ̲Q erevisiae細 胞 の 脂 質 組 成 に 及 ぼ す 食 塩 の 影 響 図 9 に~.

  c ̲

erevisiae細 胞 の 中 性 脂 質 、 燐 脂 質 、 脂 肪 酸 の 各 組 成 ( 児 ) に 対 す る 培 地 食 塩 の 影 響 を 示 し た 。 先 の 図

5 ‑ B

に 示 し た よ う に 、 1M 食塩培地で~. ̲Q erevisiaeの 生 育 は 著 し く 悪 か っ た の で 、 十 分 量 の 細 胞 が 得 ら れ る よ り 低 い 食 塩 濃 度 の 培 地 で 培 養 し た 細 胞 の 分 析 結 果を示した。~. ̲Q erevisiae細 胞 に お い て ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル と ス テ ロ ー ル エ ス テ ル が 著 し く 変 化 し た が 、 その変化は'l̲. rouxii  細 胞 で の 変 化 と は 逆 で あ っ た 。 ス テ ロ ー ル と 遊 離 脂 肪 酸 は ほ と ん ど 変 化 し な か っ た 。 燐 脂 質 の 極 性 基 に 関 す る 分 析 で は 、 ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン に お い て 培 地 食 塩 濃 度 増 加 に 伴 っ て 増 加 傾 向 を 示 し た が 、 そ れ 以 外 の 成 分 は 変 化 し な い か ま た は 減 少 し た 。 脂 肪 酸 種 の 割 合 の 変 化 は わ ず か で あ り 、

U .  I 

. も ほ と ん ど 変 化 し な か っ た 。

27 

+‑C  む

540 

Q.. 

E  o 

u 

℃  Q.. 

( A)  ( B)  (C) 

U .

 l.

60 

^ハU

ハU

9 8  

﹂

1 1 4 E

︒ 一 一

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.18: 1畠‑‑‑‑必

3 ナ~

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︒ ︒

、・。

0 

。 世話毛

0 . 3  0 . 8  0 . 6 

^ハ~v 

0 

NaCl  (M) 

17:0 

0 . 3  0 . 6 

Fig.  9.  Effects of NaCl on Composition of Neutral Lipids (A)，  Polar‑head Groups in  Phospholipids (B)， and Cellular  Fatty acids (C)  in  Saccharomyces cerevisiae Cells.  (A)  SE， sterol‑esters  TG， triacylglycerol 

S， sterols  FFA， free fatty acids  The percentage of  unknown components was omitted. 

(B)  PC， phosphatidylcholine  PE， phosphatidylethanolamine  PI， phosphatidylinositol  PS， phosphatidylserine  LPL， lysophospholipids 

The percentage of unknown components was omitted.  (C)  18:1， oleic acid  18:0， stearic acid 

17:0， heptadecanoic acid  16:1， palmitoleic acid  16:0， palmitic acid  U.I.， unsaturation index  The percentage of  18:2 was omitted， since it  was only trace.