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40 20 30
Cultivation (hr.)
Growth of
c
担坐虫 versatilieCells in Media Containing Various Concentrations of Sorbitol (A) and Containing 10% Glucose Plus Various Concentrations of NaCl (B). Fig. 23.A, time courses of growth of
c .
yersatilie cells in the presence of OM~2M sorbitol.B, time courses of growth of
c .
yersatilie cells in the presence of 10%(w/v) glucose and OM~3.5M NaCl.3・3 ・2 細 胞 形 態 に 及 ぼ す 食 塩 の 影 響
各 種 濃 度 の 食 塩 を 含 む 培 地 で 培 養 し た
c .
̲yersataili s 細 胞 の 平 均 直 径 は 食 塩 濃 度 O.2M、 O.6M、 1.0M、 3.0Mで そ れ ぞ れ 2. 1μm、 1. 8μm、 1. 5μm、 1. 5μmで あ っ た 。 即 ち 、
c .
̲ yersatili s 細 胞 は 培 地 食 塩 濃 度 の 上 昇 と と も に 小 さ く な っ た 。3 . 3・3 脂 質 組 成 に 及 ぼ す 食 塩 の 影 響
第 1章で、
z .
rouxi i細 胞 の 培 地 食 塩 濃 度 に 依 存 し た 脂 質 変 化 を 検 討 し た 。 本 章 で は 耐 塩 性 酵 母 あ る い は 好 塩 性 酵 母 に お け る 普 遍 的 な 性 質 を 明 ら か に す る 目 的 で 、c .
y̲ersatili s 細 胞 の 食 塩 濃 度 に 依 存 し た 脂 質 変 化 を 検 討 し た ( 図 24 )。なお、 OM食 塩 培 地 で 培 養 し た 細 胞 に つ い て 得 ら れ た 結 果 は 細 胞 の 生 育 の 悪 さ の た め 本 図 か ら 削 除 し た 。 燐 脂 質 含 量 は O.2Mから 2M食 塩 培 地 で 生 育 し た 細 胞 に お い て は 食 塩 濃 度 上 昇 と と も に 増 加 し 、 2M食 塩 培 地 で 最 高 に 達 す る が 、 そ れ 以 上 の 食 塩 濃 度 で は 減 少 し た 。 細 胞 の 生 育 は 2M食 塩 濃 度 を 境 と し て そ れ 以 上 の 食 塩 濃 度 で は 低 下 し て い た ( 図22 ‑ A )
。 細 胞 膜 の 主 要 構 成 成 分 で あ る 燐 脂 質 の 合 成 が 2M食 塩 温 度 以 上 で 低 下 す る た め 、 2M食 塩 濃 度 以 上 で 生 育 の 悪 化 が 引 き 起 こ さ れ る と 推 測 し た 。ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル は O.2M食 塩 と い う 低 濃 度 培 地 で は 多 量 に 合 成 さ れ て い た が 、 O.4M食 塩 培 地 で そ の 含 量 は 著 し く 減 少 し 、 そ れ 以 上 の 濃 度 で は ほ ぼ 一 定 で あ っ た 。
遊 離 脂 肪 酸 含 量 は 生 育 度 の 悪 い 3.0Mから 3.5M食 塩 培 地 で 高 か っ た 。 上 述 し た よ う に 、 こ の 食 塩 濃 度 範 囲 で は 燐 脂 質 の 合 成 が 著 し く 低 下 し て い た 。 従 っ て 、 燐 脂 質 の 合 成 に 利 用 さ れ な い 脂 肪 酸 プ ー ル が 増 大 し た た め で あ ろ う と 考 え ら れ た 。
73
3.0 1.0 2.0
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60
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ガ 一 口 一
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Effect of NaCl on Content of Lipid Components in Candida versatilis Cells.
Fig. 24.
TG, triacylglycerol SE, sterol‑esters DG, diacylglycerol
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残 り の 脂 質 成 分 に 関 し て は 食 塩 濃 度 によ る 変 動 は 小 さ か っ た が 、 低 い 食 塩 濃 度 領 域 で は 食 塩 濃 度 上 昇 と と も に ス テ ロ ール 含 量 が 増 加
し た 。 ス テ ロ ー ル に 関 し て は 次 に ミ ク ロ ソ ー ム 画 分 に つ い て 検 討 し た の で こ こ で は こ れ 以 上 追 及 し な か っ た 。
3・3・4 燐 脂 質 の 脂 肪 酸 組 成 に 及 ぼ す 食 塩 の 影 響
C. versatili S 細 胞 膜 の 主 要 構 成 成 分 で あ る 燐 脂 質 の 脂 肪 酸 組 成 の 培 地 食 塩 濃 度 に 依 存 し た 変 化 を 図 2 5に示した。
c .
y ersatilis 細 胞 の 燐 脂 質 は オ レ イ ン 酸 (18:1)を60か ら 70%、 パ ル ミ ト オ レ イ ン 酸(16:1)を 約 20%、 ス テ ア リ ン 酸 (18:0)を 約 10% 、 パ ル ミ チ ン 酸 (16:0)
を2"'v3%含 ん で お り 、 そ の 主 成 分 は 18: 1で あ っ た 。 脂 肪 酸 の 不 飽 和 度
を 1・3 ・3で 述 べ た 計 算 式 に 従 い 計 算 す る と 80か ら 90になった。
低 い 食 塩 濃 度 領 域 で 、 18 : 1と16: 1に わ ず か な 変 化 が 認 め ら れ た が 、 食 塩 濃 度 に 依 存 し た 脂 肪 酸 組 成 ・ 不 飽 和 度 の 変 化 は わ ず か で あ っ た 。
また、 C andid a (旧名 Torulopsis ) 属 酵 母 は リ グ ノ セ リ ン 酸 (24:0) を 含 む と 言 わ れ て い る が (41 ) 、 本 実 験 で は 検 出 出 来 な か っ た 。
3 . 3・5 燐 脂 質 組 成 に 及 ぼ す 食 塩 の 影 響
1 4 C酢 酸 ナ ト リ ウ ム を 含 む 培 地 で 培 養 し た
c .
y ersatili s細 胞 か ら 全 脂 質 を 抽 出 し 、 各 燐 脂 質 を 二 次 元 薄 層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 分 離 し た 。 各 区 分 に 含 ま れ る 放 射 活 性 を 測 定 し 、 全 燐 脂 質 に 対 す る 相 対 値 ( %)として表示し、 図2 6
に 食 塩 濃 度 に 依 存 し た 燐 脂 質 組 成 の 変 化 と し て 示 し た 。 本 実 験 で は ホ ス フ ァ チ ジ ル エ タ ノ ー ル ア ミ ンと カ ル ジ オ リ ピ ン の 標 準 物 質 が 同 じ 位 置 に 移 動 し た の で 両 燐 脂 質 を 合 計 し た 値 を 示 し た 。 0.2Mか ら 1M食 塩 濃 度 で は 食 塩 濃 度 上 昇 と と も
75
一 一 一 一 x
X‑‑‑XX‑j十
x ‑ ‑
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60
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~ 20
ハUハU
1.0 2.0 NaCl (M)
3.0
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Fig. 25. Effect of NaCl on Fatty Acid Composition of Phospho‑ lipids from ̲c迎坐坐 versatilisCells.
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18:0, stearic acid 16:0, palmitic acid
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NaCl (M)H0 4
t3=ト、
F i g . 2 6 . E f f e c t o f N a C l o n C o m p o s i t i o n o f P o l a r ‑ h e a d G r o u p s i n P h o s p h o l i p i d s f r o m c
担坐坐v e r s a t i l i sC e l l s .
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77
に ホ ス フ ァ チ ジ ル セ リ ン が 1.5倍増加し、 ホ ス フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル が
1 / 5
に 減 少 し た 。1 M
か ら3 M
の 濃 度 で は 逆 に ホ ス フ ァ チ ジ ル セ リ ン が 半 分 に 減 少 し 、 ホ ス フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル が 約3倍、 ホ ス フ ァ チ ジ ン 酸 が 約 2倍 に 増 加 し た 。 こ の 結 果 か ら 本 酵 母 細 胞 を 高 濃 度 食 塩 環 境( 1 M " ' ‑ '3 M )
で 培 養 し た 時 、 負 に 荷 電 し た 燐 脂 質 が 増 加 す る こ と が 分 かった。3 ・3 ・6 細 胞 膜 区 分 の 純 度
遠 心 分 画 法 に よ り 調 製 し た 膜 区 分 の 純 度 を 種 々 の マ ー カ ー 酵 素 を 用 い て 検 討 し た 。 細 胞 膜 の マ ー カ ー 酵 素 と し て マ グ ネ シ ウ ム 依 存 性 ATPase(pH 6.0)を、 ミ ト コ ン ド リ ア の マ ー カ ー 酵 素 と し て オ リ ゴ マ イ シ ン 感 受 性ATPase(pH 9.0)と シ ト ク ロ ー ム Cオ キ シ ダ ー ゼ を 用 い た 。 0.6M食 塩 存 在 下 で 培 養 し た 細 胞 を 試 料 と し て 各 調 製 段 階 の そ れ ら の 活 性 を 表 Vに 示 し た 。 最 終 的 に 得 ら れ た 膜 区 分 の マ グ ネ シ ウ ム 依 存 性ATP as eの 比 活 性 は 2.3倍 に 上 昇 し 、 オ リ ゴ マ イ シ ン 感 受 性ATPaseの 比 活 性 は 1/24に 減 少 し た 。 また、 マ グ ネ シ ウ ム 依 存 性ATPase/オ リ ゴ マ イ シ ン 感 受 性ATPaseの 比 活 性 比 は 55倍 に 上 昇 し 、 最 終 的 に 得 ら れ た 膜 区 分 は 細 胞 膜 に 富 む 区 分 で あ る と 判 断 し た 。
3 ・3 ・7 細 胞 膜 区 分 の 脂 質 組 成 に 及 ぼ す 食 塩 の 影 響
各 種 濃 度 の 食 塩 を 含 む 培 地 で 培 養 し た
C .
yersatili s 細 胞 か ら 調 製 し た 細 胞 膜 区 分 に 含 ま れ る 脂 質 の 組 成 ( 完 ) を 表V I
に 示 し た 。 培 地 食 塩 濃 度 上 昇 と 共 に 燐 脂 質 の 割 合 が わ ず か に 低 下 し 、 ス テ ロ ー ル と トリ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル の 割 合 が 増 加 し た 。 そ れ 以 外 の 成 分 に つ い て は
3 M
食 塩 培 地 で 培 養 し た 細 胞 の 細 胞 膜 に は 多 く の 遊 離 脂 肪 酸 が 含 まTable V. Purification of Membrane (Microsomal) Fraction from包坐虫 versatilis Cells.
Fractions Protein Specific activity (μmol/min/mg protein) Ratio
(mg/ml) ATPase Cytochrome C ATPase (pH 6.0) to
Mg2 + ‑dependent Oligomycin sensitive oxidase ATPase (pH 9.0) (pH 6.0) (pH 9.0)
5,200xg
ド0)
supernatant 3.08 0.214 0.268 0.80 20,000 x互
supernatant 0.93 0.434 0.055 0.022 7.89 85,000 xg
pellet 0.40 0.494 0.011 0.040 44.9
T a b l e
V1.E f f e c t o f N a C l o n L i p i d C o m p o s i t i o n i n M i c r o s o m a l F r a c t i o n f r o m C a n d i d a v e r s a t i l i s C e l l s .
N a C l
見o f l i p i d s
( M ) P L T G F F A S E
0.2 78.0 9.8 7.0 4.1 1.1 0.6 77.0 12.5 5.6 3.6 1.4 1.0 75.0 13.3 5.8 4.4 1.6 2.0 68.3 13.4 10.6 6.0 1.8 3.0 53.1 16.6 13.0 16.5 0.8
P L
,p h o s p h o l i p i d s S
lIs t e r o l s
T G
,t r i a c y l g l y c e r o l F F A
,f r e e f a t t y a c i d s
S E
,s t e r o l ‑ e s t e r s
れ て い た 以 外 、 顕 著 な 変 化 は 認 め ら れ な か っ た 。 同 細 胞 膜 試 料 か ら 得 た 脂 質 中 の 燐 脂 質 と ス テ ロ ー ル の 含 量 比
(mol/mol)
を 計 算 し た 結 果を図 2 7 に示した。 そ の 比 は 培 地 食 塩 濃 度 に 依 存 し て 上 昇 し た 。 な お、 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 分 析 の 結 果 、 ス テ ロ ー ル は ほ と ん ど ( 約 85%)エ ル ゴ ス テ ロ ー ル と し て 同 定 さ れ た 。
ま た 、 細 胞 膜 区 分 の 脂 質 に 含 ま れ る 脂 肪 酸 の 組 成 と 培 地 食 塩 濃 度 の 関 係 を 図 2 8 に 示 し た 。 脂 肪 酸 組 成 は 培 地 食 塩 濃 度 に 影 響 を 受 け ず、 ま た 脂 肪 酸 の 不 飽 和 度 も ほ と ん ど 変 化 し な か っ た 。
3・4 考 察
c . versatili s
酵 母 は3.5M
の よ う な 高 濃 度 の 食 塩 を 含 む 培 地 や 高濃 度 ソ ル ビ ト ー ル を 含 む 培 地 で 生 育 で き る 耐 塩 性 ・ 耐 浸 透 圧 性 酵 母 であるが、 無 食 塩 培 地 で は ほ と ん ど 生 育 で き な か っ た 。 こ の こ と は 無 食 塩 培 地 で も 活 発 に 生 育 で き る
Z . rouxi i
酵 母 と 異 な り 、 本 酵 母 が 好 塩 性 ( 好 浸 透 圧 性 ) で あ る こ と を 示 し て い る 。 なお、 無 食 塩 培 地 に さ ら に 10%グ ル コ ー ス を 添 加 し た り 、 高 濃 度 ソ ル ビ ト ー ル を 添 加す る と 本 酵 母 は 生 育 可 能 で あ る 。 こ の 現 象 は 本 酵 母 が 好 浸 透 圧 性 で あ る こ と を 支 持 し て い る 。
細 胞 の 大 き さ は 培 地 食 塩 濃 度 に 依 存 し て 小 さ く な っ た 。 第 1章 で 述 べ た よ う に 、
Z . rouxi i
細 胞 で も 培 地 食 塩 濃 度 の 上 昇 と と も に 小 さくなり、 球 形 か ら 楕 円 形 に な っ た 。 また、 一 般 的 に 微 生 物 ( 非 耐 塩 性 酵 母S .
~ erevisia~ )では、 高 浸 透 圧 下 で 細 胞 内 水 分 含 量 が 減 少 し 、 細 胞 の 体 積 が 減 少 す る と 報 告 さ れ て い る (79 ) 。 従 っ て 、 食 塩 濃 度 あ る い は 混 透 圧 の 上 昇 に 伴 っ て 細 胞 が 小 さ く な る 現 象 は 微 生 物 共 通 の 特 徴 で あ り 、 耐 塩 性 お よ び 好 塩 性 酵 母 に お い て は 特 に 重 要 な81
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0.4
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ハUハU
3.0
2.0 NaCl (M) 1.0
0.6
Effect of NaCl on Ratio of Sterols to Phospholipids in Microsomal Fraction from Candida versatilis Cells.
Fig. 27.
The ratio was shown as mol/mol.
100
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80 U
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・ … ・ ‑ ・ 一 一 ‑ 一 一 ・ ‑ 一 … … ‑ ‑ ‑ ・
3 . 0
1
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0 2 . 0 N , κ1 (M)
2 0
4v C︿
﹀}}司
'比
ミ ミ
Effect of NaCl on Fatty Acid Composition of Phospho‑ lipids in Microsomal Fraction from
c
担坐坐 versatilis Cells.Fig. 28.
18: ,1 oleic acid 16:1, palmitoleic acid U.I., unsaturation index
The percentage of other components was omitted, since they were trace.
18:0, stearic acid 16:0, palmitic acid
83
性 質 で あ る と 考 え ら れ る 。
低 濃 度 領 域 で は 、 食 塩 濃 度 上 昇 と 共 に ス テ ロ ー ル ( エ ル ゴ ス テ ロ ー ル ) 含 量 が 増 加 し た ( 図 2 4 )。 こ の 点 、 を 細 胞 膜 を 試 料 と し て さ らに検討した。 その結果、 培 地 食 塩 濃 度 の 上 昇 に と も な っ て 燐 脂 質 の 割 合 が 低 下 し 、 ス テ ロ ー ル の 割 合 が 増 加 し た ( 表 VI)。 さらに、
ス テ ロ ー ル / 燐 脂 質 の 含 量 比 は 培 地 食 塩 濃 度 上 昇 と 共 に 高 く な っ た (図 2 7 )。 こ の 現 象 は
Z .
rouxi i細 胞 に お い て も 観 察 さ れ ( 第 1 章 ) 、 耐 塩 性 ・ 好 塩 性 酵 母 に お い て 共 通 し て 認 め ら れ る 現 象 で あ った 。 一 般 的 に 、 細 胞 膜 の 流 動 性 調 節 に は 燐 脂 質 の ア シ ル 鎖 組 成 と ス テ ロ ー ル 含 量 が 重 要 で あ る と い わ れ て お り 、 膜 ス テ ロ ー ル は 細 胞 膜 の 流 動 性 と 透 過 性 を 、 ま た 細 胞 膜 の 物 理 的 強 度 を 調 節 し て い る と 考 え ら れ て い る ( 第 1章 参 照 ) 。 従 っ て 、 膜 区 分 の ス テ ロ ー ル 含 量 の 増 加 は 好 塩 性 ・ 耐 塩 性 酵 母 の 食 塩 に 対 す る 適 応 機 構 に お い て 重 要 な
因 子 で あ る と 結 論 で き る 。
̲ c .
yersatili s細 胞 の ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル 含 量 は O.2M食 塩 を 含 む 培 地 で は 、 多 量 で あ っ た が 、 O.4M食 塩 培 地 で 急 減 し 、 そ れ 以 上 の 濃 度 の 食 塩 を 含 む 培 地 で は ほ ぼ 一 定 に な っ た ( 図 2 4 ) 。 緒 論 及 び第 1章 で 述 べ た よ う に 、 耐 塩 性 酵 母 は 培 地 の 浸 透 圧 の 上 昇 に 呼 応 し て グ リ セ ロ ー ル な ど の ポ リ オ ー ル を 生 成 し 、 細 胞 内 の 浸 透 圧 を 上 昇 さ せ る 。 従 っ て 、 第 1章 で 考 察 し た よ う に 、̲ c .
y ersatili sで も グ リ セ ロ ー ル の 生 成 に よ り ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル 、 燐 脂 質 の 合 成 に 必 要 な1 ‑ α
ー グ リ セ ロ ー ル ー3‑燐 酸 が 不 足 す る こ と が 予 想 、 さ れ る 。 また、Z .
rouxi i細 胞 と 同 様 に 本 酵 母 に お い て も 、 燐 脂 質 の 合 成 は 3.0Mや 3.5Mの 高 濃 度 食 塩 培 地 で 培 養 し た 場 合 を 除 い て 抑 制 さ れ な い の で 、 貯 蔵 脂 質 で あ り 燐 脂 質 の 合 成 経 路 と 関 連 し て い る ト リ ア シ ルグ リ セ ロ ー ル の 合 成 が 抑 制 さ れ る の で あ ろ う と 推 察 し た ( 図 14参 照)。 言 い 換 え れ ば 、 低 い 食 塩 濃 度 で 多 量 に ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル を 合 成 し て い る 酵 母 は そ の 脂 質 代 謝 系 を 調 節 す る こ と に よ り グ リ セ ロ ー ル を 生 成 し 、 耐 塩 性 ・ 好 塩 性 を 示 す 可 能 性 が 考 え ら れ る 。
また、 C.
v
ersatili s細 胞 に お い て 、 高 い 食 塩 濃 度 領 域 (1 Mか ら 3M) で 培 地 食 塩 濃 度 上 昇 に と も な っ て 負 に 荷 電 し た 燐 脂 質 ( ホ ス フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル 、 ホ ス フ ァ チ ジ ン 酸 ) の 含 量 が 上 昇 す る こ と を 認 め た ( 図 2 6 )。 Z̲. rouxi i細 胞 で も 、 負 に 荷 電 し た 燐 脂 質( カ ル ジ オ リ ピ ン 、 ホ ス フ ァ チ ジ ン 酸 、 ホ フ フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル ) 含 量 が 増 加 す る こ と を 認 め た ( 第 1章)。 こ れ ら の 結 果 は 培 地 食 塩 濃 度 に 依 存 し た 負 に 荷 電 し た 燐 脂 質 の 増 加 が 耐 塩 性 ・ 好 塩 性 酵 母 で 共 通 し て 認 め ら れ る 変 化 で あ る こ と を 示 唆 し て い る 。 耐 塩 性 ・ 好 塩 性 細 菌 で 負 に 荷 電 し た 燐 脂 質 ( ホ ス フ ァ チ ジ ル グ リ セ ロ ー ル 、
カ ル ジ オ リ ピ ン な ど ) 量 が 食 塩 濃 度 に 依 存 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る の で (60‑62)、 負 に 荷 電 し た 燐 脂 質 含 量 の 変 化 は 負 に 荷 電 し た イ オ ン ( 塩 素 イ オ ン ) の 透 過 性 を 抑 制 す る こ と に な る の で 、 酵 母 の 耐 塩 性 ・ 好 塩 性 機 構 に お い て 重 要 な 変 化 で あ る と 考 え ら れ る 。
̲c. yersatili s細 胞 膜 の 主 要 構 成 成 分 で あ る 燐 脂 質 の 脂 肪 酸 組 成 の 変 化 は Z̲.rouxi i細 胞 に 比 べ て わ ず か で あ っ た ( 図 2 5 ) 。 細 胞 膜 を 試 料 と し た 場 合 で も 、 期 待 に 反 し て 脂 肪 酸 組 成 の 変 化 は 小 さ く 、
ほ と ん ど 変 化 し な か っ た ( 図 2 8 )。 これは̲c. y ersatili s細 胞 が 二 重 結 合 を 二 つ 以 上 持 つ 脂 肪 酸 ( 例 え ば 、 18 : 2 ) を ほ と ん ど 合 成 で
き な い こ と に 起 因 し て い る の で あ ろ う と 推 察 さ れ た 。 第 1章で、
Z̲. ro ux i i 細 胞 に お い て 培 地 食 塩 濃 度 に 依 存 し た 燐 脂 質 の 脂 肪 酸 組 成 の 変 化 が 認 め ら れ た こ と か ら 、 細 胞 膜 の 燐 脂 質 の 脂 肪 酸 組 成 の 変