結晶鯨インシュリンに関する研究
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(2) . 第 １２ 巻 第 ２ 号. 北海道学芸大学紀要 （第二部Ａ）. ，. ６年１２月 昭和３. 結晶 鯨イ ンシュ リン に関す る研 究 伊. 藤. 格. 三. 北海道学芸大学釧路分校化学教室. Ｙａｓｕｚ６ １ ｔ ｒ６ ： Ｓｔｕｄｉ ｌ ｉｎｅ ＶＶｈａ ｌ ｉｎ ｅｓ ｏｎ Ｃｒｙｓｔａｌ ｅ ｌｎｓｕｌ. Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ａｕ ｉ ｄ ａｎａ ｔｈｏｒ ｈａｓｅｘａｍｉｎｅｄ ｔｈｅａｍｉｎｏ ｌ － ｉ ｌ ａｃ ｉｎｓ （ｗｈｏ ｌ ｌ ‐ｗｈａ ｌ ｉｎ ｙｓｅｓｏｆｓｐｅｒｍ‐ａｎｄ ｓｅ ｅ ｉｎｓｕ ｅ ｉｎｓｕ ｌ（Ａ）ａｎｄ ｐｈｅｎｙ ｌ ｌ ｉｎｓｏｆｏｘｉ ｔｈ ｇｌ ｄｉ ａｎｄ ｂｏ ｌ ｉｎ） ａ ａｎｌｙ（Ｂ）ｃｈａ ｚｅｄｉｎｓｕ ｙｃｙ ｔ ｓ ｈａＶｅｃｏｎ行ｒｍｅｄ ． Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌ ｉ ｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆｓｐｅｒｍ ｉ ｔｈａｔｔｈｅａｍｉｎｏ ｌ ｉｎ ｉ ‐ ｉｍｉ ｌ ａｃ ｉｎｅｄ ｂｙ ｓａｎｇｅｒｅ ｓｓ ｎｓｕ ａｒｔ ｏ ｔｈａｔｏｂｔａ ｉ ｔａｌ ｔｓｅ ． ，； ｂｕ ｌ ｌ ｉｎ ｃｏｎｔ ｌ ｌ ｉ ｗｈａ ｉｄｕｅｉ ｅｉｎｓｕ ａｉｎｓａｎ ａ ａｎｉｎｅ ｉｎｓ ｔ ｓｏ ｈ Ａ ｈ ｅａｄ ｏｆａｎ ｉ ｉ ｅｕｃ ｎｅｒｅｓ ｔ ｎ ｅ ｃ ａｎ． Ｔｈｅ ａｍｉ ｉ ｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎ ｂｏｔｈ ｓｐｅｒｍ－ ｉ １ ｉ ‐ ｌ ｎｏ －ｗｈａ ａｃ ａｎｄ ｓｅ ｅ ｉｎｓｕ ｎｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉ ｔｈ ｔｈｅ. ’ ｔ ｔａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｏｒ ｅｄ ｂｙ Ｓａｍｇｅｒ ｅ ｒｅ ｆ ｏｕｎｄｔｏ ｈａｖｅ ｔｈｅｓａ ｌ ｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｓ ｓａｎｇｅｒ ． Ｔｈｅ Ｂ ｃｈａｉｎ ｗｅ ｓ ， ｂｕｔｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅｓｐｅｃ ｉ ｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎ Ｐｏｓ ｌ ｉ ｉ ｉｎ ： ｌｎ ｓｐｅｒｍ ｗｈａ ｔ ｅｓ ｄｉ ‐ １ｏ ｏｆｔｈｅ Ａ ｃｈａ ｌ ｏｎｓ ８ ｌ ｉｎ， Ｔｈｒ ｅｉ ｎｓｕ ， ｉ ｌ ｉ ｈ Ｓ Ｓｅｒ １ ｌ ｄ ｉ ｄｉ ｉ ｈ ｌ ｉ ｔ ｔ ｌ ｉ １ （ ） Ａ Ｓ ｕ ｃ ａ ｒ ‐ Ｔｈ ｅ ｅ ｎ ｗ ａ ｎ ｅ ａ ｎ ｓ ｎ ｅ ｗ ａ ｅ ｎ ｓ ｕ ｇ ， ｎ ． 、 ａ ． ｅｒ ． ｒ ．. 目. １ 緒. 次. ｉ） 抹香鯨イ ンシュリン. 言. ロ 試料及び実験方法. ｉ ｉ） イワシ鯨イ ンシュリ. 皿 精製並びに結晶化. Ｗ 理化学的性質. ｉ ｉ ｉ ） イ ワ シ 鯨イ ンシ ュ リ. １ 超遠心分析. ンＡ‐及びＢ‐鎖. ２ 電気泳動. １０ 末 端 基. ３ 櫨紙泳動. １ １ アミノ酸結合順序. ４. やラ ペ ー パ ー ク ロ マ トク. Ｖ 鯨イ ンシュ リンの生理効果. フイ ー. ５. １ 結晶鯨イ ンシュリン ２・効果持続性物質. 赤外線吸収. ６ 紫外線吸収. Ｗ 考. 察. ×線分析. Ｗ 要. 約. ８ 施 光 度. 皿 文. 献. ７ ６. アミノ酸組成 １. 緒. 言. 騨臓の大部分は外分泌組織より成り， この外分 泌腺部の間に 小さい内分泌細胞の集団が散在す. る が， 之 は１８６９年 Ｐ ， Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ により最初に観察され， 之を Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ 島 （ラ氏島） と名 － １ ー.
(3) . 伊. 藤. 格. 三. ｍ位で， 僅かの結締 ／ づ けられ るに至った． そ の体積は全畔臓 の約１ ・ ｏ ｏとされ， 平均直径０ ．２～０ ．３ｍ の細胞即ち α このラ氏島の上皮細胞は４種 される 組織により一般騨臓組織から区別 ，γ ，６ 細 ，β ． 胞より成り， ｆ ｚ 細胞 は好酸性のアルコ←ル不溶性の頬粒を有し， β 細胞 は好塩基性のアルコー ル可溶性の顎粒を有し， 一般にラ氏島の周辺に存在し，α細胞より数 が多いが小形とされてい る． γ 細胞は顎粒を 有してなく， β 細胞は研究者によりいろいろの種類に 入れられ て記載されて来た. ｚ 細胞から が， 未 だ 明 確 に は 定義 さ れ て い な い． こ の 中 β 細 胞 よ り イ ン シ ュ リ ン が 分 泌 さ れ， ｆ. はイ ンシュ リンの捨抗性物質 であ るグルカ ゴンが分泌される， 糖尿病に就いては古代のエ ジプトやギリシャに既に記載 が見られ， その葡萄糖の存 在は. Ｃｈ ｅｒ－ ．. ｌ （１８１５） に よ り 証 明 さ れ て い る． 叉 Ｃ１ ａｎｄｅ Ｂｅｒｎａｒｄ （１８４８） は 肝 臓 が グ リ コ ← ゲ ン を 葡 萄 糖 ｒｅｕ. 化して血中に送り出す事を 発見， 以後正常及病 的な糖代謝に関す る知識が 進み， 遂に実験的畔性 ｉ（ ｉ ） の有名な研究により， 畔臓が重要な役割を果 １８８ ９ ｎｋｏｗｓｋ ｒ ｎｇ 及 Ｍｉ 糖尿病を起させた． Ｍｅ している事が明らかにされた． 即ち畔臓を劇出した犬では糖尿・血糖上昇な どの 症状が見られ数 週間にして死亡するも， 単に畔導管結桑によ り外分泌のみを阻止する場合には， この症状を起し. 得ない． 之により畔臓の内分泌が実証され， その後 Ｓｃｈｕｌｚｅ 等が畔管の結梨では畔臓実質は変性 するも， ラ氏島組織は残留す る事を観察し， ここに畔臓の内分泌はラ氏島による事が明確とな る に至つた．. そ の 後 ｄｅ Ｍｅｙｅｒ （１９０９） は 当 時 尚 仮 定 的 であ っ た ラ 氏 島 分 泌物 を イ ン シ ュ リ ン と 命 名 し， 以. 来畔臓中のこの活性物質を 取り出す事に多くの研究者の努力が払われたのであ るが， 初めは共存. ｉ ｔ （１９ ｎｔ ｎｇ 及 Ｂｅｓ す る プ ロ テ ァ ー ゼ に よ る 破 壊 に注 意 が 及 ば な か っ た 為 成 功 し な か っ た が， Ｂａ ， ｉ ｅｏｄ 博 士 の 指 導 の 下 に， 大 の 蹄 臓 別 出 に よ る 糖 ２１）．もま， カ ナ ダ トロ ン ト大 学 の 生 理 学 教 授 Ｍａｃ. 尿病の症状を 軽快させる畔臓抽出物の作製に 成功するに至った， 即ち大の群導管結梨により騨外 分泌腺の部分を萎縮せしめた畔 臓を劇出して食塩水により 冷所抽出を行ない， 之を静脈投与して. 血糖降下する事を 観察， この中に有効物質の存在が確認され， 以後この方面に於ける研究が進み ｌｔ はこの有効物質の結晶化に成 功した． １９２６年に至り遂 に Ａｂｅ 陸上動物のイ ンシュリンに就いては以上の如く 古くより多くの研究が為され， 就中牛イ ンシュ. ｌ ）の考案 によ る方 ３５年 Ｓｃｏｔｔ ｌの結晶化以来結晶化の方法も種々改良され， １９ リンに就いては Ａｂｅ ）３ ） のイ ンシ ）４ 法が今日広く用 いられる に至り工業的な実施も行なわれている． その後硬骨魚類２ ュリンに就いて も結晶化されるに至った． ）６ ’先に Ｓｃｏｔｔ の方法により鯨ィンシュリ ンの結晶化を行な 著者の所属した研究室に於いては５. い， 牛・魚イ ンシュリンの生理的活性と比較し最高作用 発現時間に多少のずれを見るが， その効 力には殆ん ど差のない事を報告したが， 著者は更に鯨イ ンシュ リン精製結晶化の 各種方法に就い て比較検討し， 更に比較生化学的見地から詳細に そのアミノ酸組成及アミノ酸結合順序を明らか ） 等 は 牛 ・ 豚 の 脳 下 垂 体ホ ル モ に しようと試みた． その理由とする処は例えば既に ｄｕ Ｖｉｇｎｅａｕｄ７ ンであるバン プ レシンに就いて， 豚に於いては Ａｒｇ の代りに Ｌｙｓ が入れ替っている事を示し， 蛋白系ホルモンのアミノ酸組成に動物の種属差が見られ る事を 明らかにしているが， イ ンシュリ ンに於いて もこの種の種属差が当然 予想せられ るからである． 結 晶イ ン シ ュ リ ン の 蛋 白 質 化 学 的 な 研 究 も１９４６年 Ｓａｎｇｅｒ 一派の研究により， 牛・豚等の結晶 ８ ） イ ン シ ュ リ ン の 構 成 ア ミ ノ 酸， Ｎ 末 端， Ｃ 末 端 な ど明 ら か に さ れ， １９５１年 Ｓａｎｇｅｒ に よ り牛 イ ９ ） ｉ に よ り 豚， 羊イ ン シ ュ リ ン， 更 に１９５６年 に は ｔａ ン シ ュ リ ン， １９５５年 に は Ｂｒｏｗｎ ， Ｋｉ ， Ｓａｎｇｅｒ ｌ ｏ ） のイ ｈ ・ Ｎ て 馬 ン シ ュ リ ン の 構 造 が 決 定 さ れ， 相 互 に 若 干 の ｔ よ に っ 鯨 ｉ Ｈａｒｒ ａｕｇ ｏｎ ｓ ， Ｓａｎｇｅｒ ， － ２ ー.
(4) . 結晶鯨イ ンシュリンに関する研究. 種属差を示す事が明らか にされた．. 先ず著者は結晶イワシ鯨イ ンシュリンの構成アミノ酸の 完全分析を行ない， 之等陸上動物イ ン. シ ュ リ ン と は若 干 ア ミノ 酸 組成 を 異 に す る事 を 見 た が， 鯨イ ン シ ュ リ ンに 就 い て の Ｓａｎｇｅｒ の 報. 告と相違するので， 之を検討する為， 新たに抹香鯨イ ンシュリンと更にイワシ鯨イ ンシュリンに 就いては Ａ 鎖と Ｂ 鎖を分別して， それぞれのアミノ 酸の完全分析を試みた． その結果抹香鯨イ ン ｌ シ ュ リ ン で は Ｓａｎｇｅｒ の 結 果 に 一 致 す る が， イ ワ シ 鯨イ ン シ ュ リ ン で は矢 張 り 之 と異 り， １ ｅｕ ｌ. 分子少な く， その代りに Ａ１ ａ ｌ分子多く含有する事を確認した． 更にその Ａ 鎖 Ｂ 鎖を分別して ペプ ペプ シン及酸による部分水解を行ない， 各々のアミノ酸結合順序を究明した処， 豚 シン， 鯨 １ ｌ 抹 香イ ン シ ュ リ ンで は Ａ 鎖 の ８ ～１０が Ｔｈｒ ‐Ｓｅｒ ‐ ｅｕ （Ｓａｎｇｅｒ と 同 一 結 果） であ る の に 対 し， イ. ワ シ鯨イ ン シ ュ リ ン で は Ａ１ ‐Ｓｅｒ ‐Ｔｈｒ を示し両種間に明らかに相異を示す事が認められるに至っ ａ た， こよ り プロ テ プ ー ゼ の 作用 の 特 異 性 を 観 察 す る 方 法 は Ｂｅｒｇｍａｎｎ ‐一派 が 簡 単 な 合 成 ペ プ チ ドャ. 創始， 種々の プロテ ァー ゼに就いて観察されているが， 最 近 で は Ｓａｎｇｅｒ が構造を明らかにして １ ） キ モ トリ 以 来， イ ン シ ュ リ ンの Ａ 鎖 及 Ｂ 鎖 を 基 質 とす る 研 究 が 行な わ れ， Ａ 鎖 で は ペ プ シ ン１ ２ ） を 始 め トリ プ シ ２ ２ ｝ パ パ イ ン１ ） 麹 カ ビ プ ロ テ ァ ー ゼ１９ 等 が Ｂ 鎖 で は ペ プ シ ン１ プ シ ン１ ， ， ， ， ２ ） サ ブ テ ィ リ ジ ソ１ ５ ２ ４ ｝ 及 び レニ ン１ ）等 が 挙 げ られ る． ） キ モ ト リ プ シ ン１ ン１ ， ， ，. 著者の所属した研究室では 既に各種 鯨類及海獣ペプシンが精製結晶化され， その酵素学的性質 は厭ペプ シンとは 若干相異する事が明らかにされているが， 構造既知のイ ンシュリンを基質とし. て， 之等ペプシンの特異性の綜括的な究明は今後の興味を惹く課題と考える．. 口 試料及び実験方法 試. 料. Ｚ １９５５年 ５月 金 華 山 沖 にて 捕 獲 せ るイ ワ シ 鯨（Ｂの 解“噂 おγα 彰γ卿Ｚ ＳＬａ ｓｏ“）及 抹 香 鯨（Ｐ 毎 例解γ ｓ. ） の新鮮な畔臓を解剖後直ちに凍結貯臓したものを用いた． 騨臓をイ ンシュリ ｃのｏｄｏ” ＬＺ”〃αａ ”ｓ ン原料とする場合， 共存するトリ プシンの 影響が大なる為鮮度， 低温貯蔵に細心の注意を払い結 晶イ ン シ ュ リ ンの 作 製 に 当 っ た，. 結晶抹香鯨イ ンシュリンは大洋漁業横須賀工場製のものも併せて供試した．. 実. 験. 方. 法. 力 価 の 測 定 は Ｍａｒｋｓ 法 及 Ｔｏｒｏｎｔｏ 口 法 に 準 じ， 血 糖 定量 は 常 法 通 り Ｈａｇｅｄｏｒ Ｊｅｎｓｅｎ. に従った． アミノ酸完全分析は. ） ６ Ｍｏｏｒｅ ｅｉｎ 法１ ， Ｓｔ ，. 法. ） ８ ７ ） 及 Ｈｙｄｒａｚｉｎｅ 法１ 末端基の 定量は ＤＮＦＢ 法１ ， ｝ｌ ｏ ） に 準 じ渡 紙 泳 動 ペ ー パ ー クロ マ ト グラ フィ ー を 併 用 ・ アミノ酸結合順序は Ｓａｎｇｅｒ の 方 法９ ， し た．. 超遠心分析は. Ｓｐｉｎｃｏ Ｅ. 型超遠心機にて行なった． ｌ ｉｕｓ 電気泳動装置にて行な った． 電気泳動は日立製 Ｔｉ ｓｅ 滋紙泳動は東洋滴紙電気泳動Ｃ 号にて行なった，. 紫外部吸収測定は島津製光電分光光度計にて行なった．. ｍ 精製並びに結晶化 － ３ ー.
(5) . 伊. １. 粗インシュ リン調製. Ａ. ア ルコ ール抽出法. ｉ） Ｓｃｏｔｔ. 格. 藤. 三. 法. 畔 臓 磨 砕 物 １ 鯉 を ２足 の 塩 酸 酸 性 ア ル コ ー ル （ＰＨ２，２ ， エチ ルア ルコ ー ル ： メ チルア ルコール. ｌ ９ ： ｌｖｏ ） にて， 常温で５ 時間抽出し，，滴過後共の癒液に１０％ア ソモニャ水を加え ｐＨ８ とし， ／ ７ 量 にな る 不純蛋白質を沈澱除去する． 得られた滴液に３Ｎ 硫酸を加え ｐＨ３ 以 下 と し， 澱 液 の １ ０ｏＣ に上げ， 約５分間保った後 急冷し脂肪を遊離せしめ 迄 ３５ｏＣ 以下で減圧濃縮後 直ちに温度を５. て除去する． かくして得られ た撒液に食塩２５％加えて塩析を行ない， 一夜放置後， 沈澱を取り， Ｎ／ ， ｏ ｏ塩酸に溶かし再 び食塩にて１５％塩析を行なった． ここに得られた塩析物をアセトンで脱水洗 糠後， 硫酸デシケーター 中 で減圧下乾燥した．. ｉ ｉ ） 硫酸亜鉛， 酢酸亜鉛添加法 ／ 上記方法の中濃縮を１ ３量に止め， 脂肪除去後の縦液に飽和 硫酸亜鉛溶液， 飽和酢酸亜鉛溶液を ２苛性ソ← ぬこて ｐＨ５ 夫々撒液１兄当り５０ｍｌ の割で加え， 直ちに Ｎ／ ，６とし， 一夜放置後得られ. １０ ０塩酸に溶かし２５％塩析， １５％塩析を行ない， 上述の操作と同様にして乾燥し た沈澱を集め Ｎ／ た．. Ｂ アセ トン抽出法 ２苛性ソー ダにてｐＨ５ 畔臓磨砕物 １鯖を１ ．６ ．５ゑの塩酸酸性アセトンにて 室温で加え， 直ちに Ｎ／ Ｎ ５％ １ ５％ 塩析を行なった後 アルコ ２ １ ０ 酸に溶かし ／ ０塩 一夜放置後得られた沈澱を集め とし， ， ，. ール法と同様の操作によって乾燥した． 上述の種々の方法で 得られた粗イ ンシュ リンの収量は第 １表に示す如くである． 第１表 各種製法による粗製イ ンシュリンの収量 組. イ. 騨臓ｌｋｇ当りｇ Ｓｃｏｔ ｔ アノレゴ ーノレ. ア セ ト ン. 硫酸亜鉛 酢酸亜鉛 硫酸亜鉛 酢酸亜鉛. ０ ．５８６ ０．１５２. ン. シ. ュ. ｍ ｇ当 Ｐ Ｉ ． Ｕ， ２ ．５ ３. リ. ン. ｋｇ 当 り １ ．Ｕ １ ，４６５ ４５６. ０．１４６. ２. ２９２. ０ ．７３０ ０ ．２３４. ２. １ ，４６０ ４６８. ２. ｔ 法は後段の精 ｔ ｔ 法並 びにアセトン抽出硫酸亜鉛法が良い結果を示したが， Ｓ ｃｏ 此 の 結 果 Ｓｃｏ ｔ. 製段階に於いて共存不純物の除去が困難で多量の損失を見た． この点アセトソ法 に 於 い て は 柴 ９ ） の詳細な研究にも明らかな様 に， 鯨イ ンシュ リン製造には最も適当な方法と考え ら れ る． 田１. ００単位であって著者等の場合に於いても本標品の等 柴田の結果では， この方法大体畔臓鯉 当り７ 電点沈澱２回繰返すことにより ｍｇ 当り約１０単位のものとする事が 出来大体近似した 値が得られ た， ２. 結. 晶. 化. ２ １ ） Ｓｔａ ） 等 があ る ） Ｈａｒ ０ ｌ ｌｍａｎ法２ ） Ｓｃｏｔ ｉｎｇｔｏｎ 法２ Ａｂｅ ｌ 法２ ｔ法１ ， ， ， ｔ が， 最も広く用 いられているのは Ｓｃｏｔｔ 法 で あ っ て， 鯨イ ン シ ュ リ ン に 就 い て は， 著 者 も Ｓｃｏｔ イ ン シ ュ リ ンの 結 晶 化 に は. 法で結晶化を行なっ ている． しかしながら， この方法を鯨イ ンシュリ ンに其のまま適用するとき ｒ は， ＰＨ５ ｐｈｏｕｓ に移行し 結晶化が 仲々困難であった． 其の上収 ．９に近 づけると相当量が Ａｍｏ － ４ ー.
(6) . 結晶鯨イ ンシュリンに関する研究. 量の面でも常に一定の値を示さず， 良い時で６０％， 悪い時には１０％前後であった． そこで著者は ｌ ｌｍａｎ の鉄イ オ ンと亜鉛イオンを共に加えて晶出せしめる方法を行なって見たが収量は一定と Ｓｔａ なったが非常に悪か った． 次に. 法でアセトンを含む母液より結 ，晶の晶出する事が認められ たので， アセトン溶液より溶解度の差により晶出する可能性があるものと 考えて第１図に示す様 に処理した処極めて良好な結果が 得られたのであ る． 各種結晶化の方法によ る収量の比較は第２表に示す如くであ る． Ｓｃｏｔ ｔ. こ こ に 作 られ た， イ ワ シ 鯨イ ン シ ュ リ ン 及 抹 香 鯨イ ン シ ュ リ ン の 結 晶 の 顕 微 鏡 写 真 は 第 ２ 図 に 第１図 鯨イ ンシュリンの結晶化. 沈 殿. . . . 全量錫”と“ ・ ‐酢ｉ戦績俺 歌を加え “モメヤ ．. . ｔ養ぬし 酢 鯨４一′ . . . Ｈ飾 りｊ Ｐ 酢 鶴間・ 今度 ｈ ２ ′ ｒ語遥 温ー ｏｈ ｒ ，；. ＰＨぶや（補 正. 迄 べ分離. . . ３努 潔思. . 弁酢 醜く逮ふし 酢 酸怪魂Ｅ加える . べ分離. セトン亥３ ０. . 墓園 鱒上 １ 〆 濯凍 ア 塩 加えろ カ車 貯 蔵. 上誉乙操作を練り更訂. 純 晶生成. 第２表 各種結晶化方法の比較 組 イ ン シ ュ リ ン. 著. 者. の. 方. 法. 平. 均. 結晶イ ンシュリン. 回. 収. 率. １ ． Ｕ． ｌｏｏｏ. １ ．Ｕ． ９１０. ｌｏｏｏ. ８６６. ８６. １０００. ８００. ８０. ８５８. ８５. ９１. Ｓｃｏ ｔ ｔ. １０００. ５５０. ５５. Ｓｔａ ｌ ｌｍａｎ. １０００. ３００. ３０. ー ５ －. ％.
(7) . 伊. 藤. 格. ゴ. 示す． 結晶の活性測定結果は後に述 べる． ｔ ｔ 法， その他の ・方法に比し ｃｏ 第２表に示す通り著者の方法は平均８５％の収量を得る事が出来 Ｓ. 鯨イ ンシュリンの結晶化には適当であると考える．. ｌ の方法では斜 結晶鯨イ ンシュリンの結晶の形状は第２図に示す如くであるが， 牛の場合 Ａｂｅ ｉ 方 六面 体， Ｈａｒ ｎｇｔｏｎ の方法では立方体叉は之に近い斜方 六面体である． 鯨の場合でも大体六面. 体である事は同様であ るが， その形は各種条件 即ち水素イ オン濃度， 亜鉛含量等のわずかの差に ｒ しかし図に示す様に襖形斜方 六面体乃至は立方体が主 であり， 或る条件 よって変化が見られた． 下では六角錐双晶の Ｃｕｔｆｏｒｍ が得られた． ０ ） ｇ ｌｂ 抹香鯨インシュリン （ｘ４８ 第２１. ０） 第２図ａ イワシ鯨イ ンシュリン （×４８. ′ 理化学的性質 ｎ １. 超 遠 心 分 析. 再 結 晶 し たイ ワ シ 鯨イ ン シ ュ リ ン と 抹 香 鯨イ ン シ ュ リ ンを イ オ ン 強 度 ０．２ｐＨ ７．５燐 酸 － 食 塩 緩 衝 液 に て 前 者 は０．８％， ０．６％， ０．４％， ０，２％， 後 者 は０．８％， ０．４％， 溶 液 と し， ２７０～３０ｏＣ で約 ６０，ｏｏｏ ｒ ．ｐ．ｍ で測定した．. 得られた結果は第３図に示す如くであって， 両鯨結晶イ ンシ ュリンとも 超遠心沈降的には均一 である事が認められた， ‐ ｉ ‐ ３ 沈降速度恒数 Ｓ２｛ ）ｗ の 値 は 第 ３ 表 に示 す 如 く であ っ て， イ ワ シ 鯨イ ン シ ュ リ ン で は３ ．２０ｘｌｏ ３ であ っ た こ の 値 は 牛 イ ン シ ュ リ ン に つ い て Ｃｒｅｅ ３ ） の得 抹 香 鯨イ ン シ ュ リ ン で は３．１０×１０『１ ｔｈ２ ， 一 ３と大 体 良 く 一 致 す る も の であ っ て イ ン シ ュ リ ン は 中 性 付 近 の 溶 液 中 では 牛 ・ て い る３．１２×１０ １ ，. 鯨とも大体同 じ様な会合状態 にあるものと考 えられる， ２. 電. 気. 源. 動. 再 結 晶 し たイ ワ シ鯨 イ ンシ ュ リ ンを イ オ ン強 度 ０，１ ， ＰＨ ２．２ ， ３．３， ３．７ ， ４．０ ， ６，５ ， ７．４ ， 及. ｏ ８ ．０のクエン酸－燐酸緩衝液にて０ ．５％溶液とし， ｏ Ｃ にて２４時間上記緩衝液にて透析せるもの ｏ ４ Ｃ に於いて電気泳動を行なった，. 得られた結果は第４図に示す如くである． 第４図に示す如く結晶鯨イ ンシュリンは電気泳動的に均一であ る事が認められる． 各 ｐＨ に於ける易動度を表示すると第４表に示す如くである， － ６.
(8) . 結晶鯨イ ンシュリンに関する研究 第３図ａ イワシ鯨イ ンシュリン超遠心沈降図 １ ２. イ ンシ ュ リ ン濃 度 ０．８％ イ ンシュ リン濃 度 ０ ，６％ （ＰＨ７ ｐ ． ．ｍ） ．５燐酸－緩衝液， ” ０．２ ６０，０ｏｏｒ. ２. 第３図ｂ 抹香鯨イ ンシュ リン超遠心沈降図 １ ２. イ ンシ ュ リ ン濃 度 ０ ．８％ イ ンシ ュ リ ン濃 度 ０ ．４％. （ＰＨ７ Ｐ ．５燐酸－緩衝液， ”＝０ ．２ ６０ ． ．ｍ） ，０ｏｏ ｒ. ２. 第３表 各濃度に於けるインシュ リンの Ｓ２０ｗ イ. イ. 蛋白濃度. ワ. ｌｏｏｍｌ ｇ／. シ. 鯨. Ｓ２０ ，ｗ. ０ ．８. ３ Ｘ１０‐１ ２ ．９９. ０ ．６. ３ ．０７. ０ ．４. ３ ．０５. ０ ．２. ３ ．１６. ０. ３ ，２０. 抹. 香. 蛋白 濃度. ｇ月ｏｏｍｌ ０，８. ３ Ｘ１０一１ ２ ．９３. ０，４. ３ ．００. ３ ．１０. － ７ －. 牛. 鯨 Ｓ２０ ，ｗ. ２３） Ｓ２０ ．ｗ. ３ ．１２. ２４） Ｓ２０ ．ｗ.
(9) . 伊. 藤. 格. ゴ. 第４図 イワシ鯨イ ンシュ リンの電気泳動図 （ＰＨ４ ） ｓ ｅｃ ． ， ”＝０ ，４８００ ，０ ，１. ２ ５ ） Ｈａ ２ ６ ７ ） 等 が 電 気 泳 動 的研 究 を 行な っ 」 ｉｎｅｒ １ ｌｋ ｉｎ２ 従来牛イ ンシュリンについて Ｗｉｎｔｅｒｓｔｅ ， ｌ ， Ｖｏ ｉｎ の結果ではイ ンシ ュリンの等電点附近の範囲をチオシアナートを 加えて溶解効 て い る が， Ｖｏｌｋ. 果を挙 げて行なっていて， ＰＨ 値や緩衝液の種類に無関係に単一でほぼ対称的な界面を得ている． ‐６ ２ ｌ ｔ ／ ｓｅｃ ／ ｓｅｃ であった， 第４ 易動度は ｐＨ７．ｏで －５，ｏｌ×１０－５ｃ岬 ｖｏｌｔ ，ＰＨ７．３９ で －６，４０×１０ ｃｍ／ｖｏ 慮紙泳動か らの結果と 表から 鯨イ ンシュリンの等電点は ｐＨ５．４ 附近にあ る事が認められ後述のｉ. 良く一致した． 第４表 各 ＰＨ に於ける鯨インシュ リンの易動度 ｌ ／ ／ １０－６ ｔ ） 易動度 （ ｃ ｍ２ ｓ ｖｏ ｅｃ イ オ ン 強 度 上 昇 側 下 降. ｐＨ ２ ．２０ ３ ，２９ ３ ．７０ ４．０４ ６．５０ ７．３９ ８．００. ３. 漉. 紙. 緑. ，. ０ ，ｌｏ ０ ，ｌｏ. ０ ・ｌｏ ０ ・ｌｏ ０・ｌｏ ０．１０ ０・ｌｏ. 側. 十 １０ ．６７ ＋ ７．６５. 十 １０ ．０９ ＋ ７ ．４２. 十. ＋. ー ２ ．０１ ー ７・００ － ９ ．７３. ー. ＋ ５．９６ ２ ．５４. 十 ５ ．６９ ２ ．４９. １ ．９６ ー ６．８４ － １０ ．４７. 動. 再 結 晶 し たイ ワ シ鯨イ ン シ ュ リ ン をイ オ ン 強 度 ０，１ ．ＩＭ グ リ シ ン － ，５ （５Ｍ 食 塩 －０ ．５～３ ， ＰＨ ２ ０，２Ｍ 塩 酸 緩 衝 液）， ＰＨ４ ．０－５ ．５ （５Ｍ 食塩－２Ｍ 酢 酸 ソ ー ダ ←３．５Ｍ 酢酸緩衝液） ， 及 ｐＨ６．０～. ７．０ （０．５Ｍ 第一燐酸ソー ダ－－４ ．Ｍ 第二燐酸ソ ー ダ－緩衝液） に溶解， １％濃度として供試した． ｔｌ ｏ時間行ない泳動は プロ ←ムク レゾ←ル ブル ←を用 いて染色した， 染色後， 分光 泳 動 は ３０ｏｖｏｌ. 光度計にて ３６０ｍｇ の吸光度を測定し 第５図に示す様な 結果を得， 吸光度の一番大な る点を規準. にしてイ ンシュリンの移動距離を求めた， この結果は第５表に示す． 尚 ｐＨ４ か らｐＨ６ 迄の範囲 はイ ンシュリンを緩衝液に懸濁せしめた状態のままで泳動を行なった， ８ 〕 はベロ ナー １ 第 ５ 図 に 示 す 様 に 結 晶 鯨イ ン シ ュ リ ン は 滴 紙 泳 動 上 で も 均 一 で あ る， Ｓ ｕｙｔ ｅｒｍａ ｎ２ ，. ｌ ｌ ｔ ｔ ） ク ル緩衝液 （ ）， グ リ シ ン緩 衝 液 （ＰＨ３．０ ゑ＝０．０４ １６ｈｒ １５０ｖｏ ＰＨ８ ．６ ”＝０．０４ １６ｈｒ １５０ｖｏ ｌ ｌ Ｈ ｈ Ｈ ｈ ＝０ ｔ ｔ 用 ０ ０ １ １ ０ ） 緩 ７ １ １ ５ ０ ） てイ ３ ４ ６ ５ 及 酢 酸 衝 液 Ｉ ６ を い エン酸緩衝液 （Ｐ ． 〆 ． （Ｐ ． ｒ ｒ ｖｏ ｖｏ. ンシュリンの瀬紙泳動的研究と分子量の 測定を報告して いるが， 酢酸緩衝液が最も分 離 の 良 い.
(10) . 結晶鯨イ ンシュリンに関する研究 （ ｃｍ） 第５表 イ ンシュ リンの櫨紙泳動移動距離， ＰＨ. ２ ．５. ３ ．Ｏ. ３．５. 結晶イ ンシュリン. ＋ ２．７. 十 １ ．５. ＋ ０ ．６. 粗製イ ンシュリン. ＋ ２ ．２. ＋ ２ ．１５ ＋ １．５. 第５図. ４ ．Ｏ. ４，５. ５．Ｏ. ＋０ ，３. ＋ ０．３. ５．５. ６．０. ６．５. ー ０ ．４５ － ０，７０ ，０５ ー ０. 十 ０．７５ ＋ ０ ．４０ ・７０ ＋ ０．５０ ー ０. 鯨イ ンシュリンの猿紙泳動に於けるスポットの色度測定曲線 ｐＨご ，ｏ. ｐＨ ぶり. ｐＨ５ぶ. ｐ″６ ，ｏ. ・ ．. ク １. ・ ２”“. ０・ ７ ２ １ ０ ＋』 －１ ‘ 加 ‐. １肌 ０ 十. 単 一 区 分 が 得 ら れ る事 を 報 告 し た， 叉 ｙａｍａｇｉ ｓｈｉ ， Ｍａｓｕｄａ ， ９ ）等は Ｔｈｅｏ ｈ ｌ ｔ ） で 癌 ｌ ｌ ＝０ ０ ７ ０ ｏ 紙 動 Ｙｏｋｏｏ２ ０～０ ５ 泳 を 行な ６ ｒ３ ｖ ｏ い …緩 衝 液 （ＰＨ６，０－１１ ｒｅ ” ， ， ，. 事６単 位 以 上 の イ ン シ ュ リ ン で は. 単位以下では二つの区分になる事を報告し ている， 第５表に示す結果から結晶鯨イ ンシュリンの等電点は ｐＨ５，３～５．４ の付近にあるものと考えら れ， 先の電気泳動の結果からも同様の事がいい得るが， 牛イ ンシュリンの等電点が５ ，２～５ ．４位で. ある事を考え， 牛同様等電点にあ る範囲を考えた方が良いと思われる． ４. ペ ー パ ーク ロマ トグラフ ィ ー. ３酢酸溶液を０ 試料として１％結晶鯨イ ンシュリン Ｎ／ ，ｌｍｌ用いた． 溶媒はブタノ ール； 酢酸；. ブ ゾ 水（ ） ３：１：４ ， 滴紙は東洋瀬紙 Ｎｏ５０ （２×４０ｃｍ）， を用 い た． 染 色 は ０，０２％ ロ ー ム ク レ ー ル. ブル 溶液を用 いた， 得られた結果は第６図に示す如 くであ る．. 第６図 結晶鯨イ ンシュリンのペー パークロマトグラム. ＠ ファ“し頃“皮賀 川：の ３ ０ ） が ブタ ノ ー ル ： 酢酸 ： 水 ｉ ｎｓｏｎ イ ン シ ュ リ ン の ペ ー パ ー ク ロ マ ト グ ラ フィ ー の 研 究 で は Ｒｏｂ ３：１：４） を 溶 媒 と し てイ ン シ ュ リ ンの 酢 酸 溶 液 に つ い て 行な い， Ｒｆｏ．４３の 区 分 が 活 性 を 有 す る （. 事， 叉朝岡等も同じ溶媒で６単位のイ ンシュリンの酢酸溶液について．行ない３つの区分に分かれ. る事 （Ｒｆ＝０．４３， ０．４０ ， ０，００） を 認 め， Ｒｆｏ．４３に 活 性 のあ る事，そ し て 精 製 を す る と 先 ず Ｒｆｏ．００ ９ １ ２ ’等 と 同 Ｊ等 も 朝 岡３ ｆ Ｒ ０の区分が消失する事を報告した． 更に叉 Ｙａ ｏ ｓｈｉ の区分 次いで ，ｍａｇｉ ，４. ， ３ ２ ）は シ リ カ ゲル に て 分 配 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー を 行な ｔ ｅｒ 様の結果を得た事を報告している． 叉 Ｐｏｒ い， 分配クロマトグラ フィー的には活性区分が一つであって均一であ るとした． しかし Ｃｒａｉｇ１３） － ９ －.
(11) . 伊. 藤. 格. 三. 等は向流 分配で活性のあ る区分を二つ得ている．. 結 晶 鯨イ ン シ ュ リ ン は 上 述 の 如 く ペ ー パ ー ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に よ っ て も 単 一 成 分 であ る 事 を. 示す． 以上のように 再結晶した鯨イ ンシュリンは超遠心沈降及び電気 泳動的にも 均一であ る事が認め られ， この精製標品を構造決 定に供試した． ５ 赤 外 吸 収. イ ワ シ鯨， 抹香鯨イ ンシュリンを再結精製せるものを供試した．. 分析は Ｎｕｊｏｌ 法及び ＫＢｒ 法によ り行ない， 結果を第７図ａ ， 第８図ａ ，ｂ ， ｂ に示す． 第７図ａ イワシ鯨イ ンシュ リンの赤外線吸収スペクトル （Ｎｕ ｌ 法） ｊ ｏ. 第７図ｂ 抹香鯨イ ンシュリンの赤外線吸収スペクトル （Ｎｕ ｌ 法） ｊ ｏ. ２. ３. 字. ‘. ６. ７. ー ｌｏ －. 「～ヲ. の 吸収を示す. ８. ９ ：／ ク.
(12) . 結晶鯨イ ンシュリンに関する研究 第８図ａ イワシ鯨イ ンシュリンの赤外線吸収スペクトル （ＫＢｒ 法）. 第８図ｂ 抹香鯨イ ンシュリンの赤外線吸収スペクトル （ＫＢｒ 法）. 第７図に示した結果は Ｎｕｉｏｌ 法を用 いた為， Ｎｕ ｌ の吸収と重な り解析出来なか ったが 第３ ｊ ｏ ， 第９ 回こ示 ． ４ ） より記載した した牛の結果は文献３ ． 上記三者のス ペクトルを比較すると大体同一であるが， 第１０図に示 すようにして解析を試みた ， ５ ） の方法に準じたものであって 各域に於ける吸収は Ａ 領域 は ＣＨ ＯＨ この分劃は島内３ ， ， ， ， ＮＨ な どの伸縮振動 を現わしている 即ち ３２８０ｃｍ冊１ ３０６０ｃｍ‐１ は 水 素 結 合－ＮＨ…０＝Ｃく ＮＨ ， ， ， 伸 縮 振 動 であ り， ２９４０ｃｍ‐１は ＣＨ２ の伸縮 （及び変角） 振動である Ｂ Ｃ 領域には殆んど吸収が ． ， 認められなかった． Ｄ 領域は…Ｃ＝○， Ｃ「＝○ 伸縮振動， ＮＨ２ はさみ振動 を現わしている 蛋白 ． 質ではペプチ ド結合を現わしていると考えられる． この領域では， 両者共同じ様な吸収 を示す ． 一般に個々の蛋白質を赤外ス ペクトルで 区別する事は出来ないが 蛋白質特有 の吸収 帯の確認 ， ｉｎ Ｃｏｎ６ｇｕｌａｔ ｉ と Ｃｈａ ｏｎ の研究に重点が置かれ ている． そこで鯨イ ンシュリンについても先ず蛋白質特有 の 吸収 帯 である ３３００ｃｍ‐１ （３ ０〆） １６５０ｃｍ‐１ 図 に 示 し た 結 果 はイ ン シ ュ リ ン ｌ ｍｇ／ ２０ｍｇ ＫＢｒ なる条件下 で行なったものである. ．. － １１ －. ，.
(13) . 第９図. ２. 三. 格. 藤. 伊. 牛イ ンシュリンの赤外線吸収ス ペクトル （ＫＢｒ 法）. ３. ４. ６. ５. 次長 ／ ｏ・. ？. ８. ７. 第１０図ａ イワシ鯨インシュリンの赤外線吸収スペクトル. Ａ. 禿 リ ￥ 参 り ／ク ／ クシ ′ ク ． ‘ Ｉ ！ 登 Ｅ Ｄ Ｆ. ｉ ＶＨ ， ２. ， ５. ｈ. ｉ ， 卒. ｉ 夕. ６. ７. 夕. β. ／ リブ ＆＆′. 第１０図ｂ 抹香鯨イ ンシュリンの赤外線吸収スペクトル. 叩 ，Ｄ. Ａ. ‘ ‐ ） ｃ ｍ 濃敏（ Ｅ. ム. Ｆ. ー ーーｉ. ２. ３. 字. ６. ７. ８. ヲ. 超 怨長 ー 〆. ｉｎ （６，０〃）， １５３００ｍ‐１（６，５の 付 近 に つ い て 見 る と 両 者 共 に か な り 強 い 吸 収 が 見 ら れ る． 次 に Ｃｈａ ‐ １ ‐ １ 一 ｏ ｏ ｃ ｍ 或 ｏ い はｌ ｉ Ｃｏｎ６ｇｕｒａ ｔ ｏｎ に つ い て 見 る と， 両 者 共 １６６０ｃｍ に 弱 い 吸 収 を 示 し， １６３０ｃｍ － １２ 一.
(14) . 結晶鯨イ ンシュ リ ンに関する研究 ６ ） ｔ ｒのｍ－Ｌａｎｇ３ にな ん ら の 吸 収 を 示 き な い 事 か らα－螺 施 状 を 呈 す る も の と考 え る， こ の 事 はＬｉ ｓ ｎｄｅｒ. 等の牛イ ンシュリンについて行なった研究と一致した結果である， ６. 紫 外 部 吸 収. １０ ０ １００塩酸溶液及， ０ ，４％再結晶イ ワシ鯨イ ンシュリン Ｎ／ ．１％再結晶イワシ鯨イ ンシュリン Ｎ／ 苛性ソー ダ溶液について測定した． 其の結果は第１１図， 第１２図に示す如くである． 第１１図 イワシ鯨イ ンシュリン の紫外部吸収曲線 （Ｎ／ １０ 塩酸溶液）. ２“. っの. ２２ 汐. 第１２図 イワシ鯨イ ンシュリンの 紫外部吸収曲線 １０ 苛性ソーダ溶液） （Ｎ／. ２卿 ． “物 夢. 葛０ ２７ り. ２卿. “○ ． ３００. ３ ／クｍ. イ ワ シ鯨イ ン シ ュ リ ン の 紫 外 部 吸収 は Ｎ／ １００ 塩酸溶液内であ っては蛋白質が示す ２７５ｍ！ ‘ 付近. １０ 苛性ソ ー ダ溶液内では ２９２ｍ” に最大吸収を示し， 得られた曲線がほ ぼ対称 に最大を示し， Ｎ／ 用 的である事から いた試料は純粋であろうと考えられる， ７. Ｘ. 線. 分. 析. 再 結 晶 せ るイ ワ シ 鯨 イ ン シ ュ リ ン， 不 定 形イ ワ シ 鯨イ ン シ ュ リ ン， 熱 変 性イ ワ シ 鯨 イ ン シ ュ リ ン， 不 定 形 牛イ ン シ ュ リ ン 及 び 不 定 形 魚 イ ン シ ュ リ ンを 試 料 と し て用 いた，. 結晶イ ンシュリンについては使用した装置の限界から， 単結晶としての廻析が 困難であったの ‐Ｓｃｈｅｒ ｒ ｅｒ の 方 法 に て 分 析 を 行 な っ た， 得 られ た 結 果 は 第１３図 ａ， ｂ， ｃ， ｄ， で， 粉末にして Ｄｅｂｙｅ ｅ 及び第６表に示す如 くである． これらの結果を解析すると １ＯＡ～９Ａ に強い， ４Ａ～５Ａ に弱い二つの環は球状蛋白質の. Ｄｅｂｙｅ－. ３ ７ ） 法 で は 普 通 に 認 め られ る も の で あ っ て これ は 鯨， 牛， 魚 共 に 認 め ら れ る， Ｓｃｈｅｒ ｒｅｒ ，. ＯＡ 付近の環が不明瞭になり， 新たに７Ａと３ 次に変性せしめた鯨イ ンシュリンでは１ ．５Ａ に環を. ‐ケ 生 じ， ４～６Ａの環 が 明 瞭 に な っ た， ３，５Ａ の値はポリ ペ プチ ド鎖がほ どかれて伸びた状態即ちβ. ラチンと同様の構造を持った時のアミノ酸残基の周期に相当し， ４～５Ａ の環が 明瞭 になったのは ポリペ プチ ド鎖の伸びた形の鎖は互いに平行に並んで 小結晶を作る為といわれている． この事か ‐型を示すものであろうと推定 ら鯨イ ンシュリンの場合にも未変性では α 型， 変性したものでは β － １３ －.
(15) . 伊. 藤. 裕. 一. 第１２図ａ 結晶イワシ鯨イ ンシュリンＸ線写真 ｉ ｃ （Ｃｎ一Ｋα えコ１ ｍ） ，５１４８Ａ ４０ＫＶ ６０ｍＡ，７０ｍ ｎ ７. 第１３図ｂ 不定形イワシ鯨イ ンシュリン. 第１３図ｃ. 熱変性イワシ鯨イ ンシュリン. さメｔる． ３ ８ Ｊ が 行な っ て い る が 尚イ ン シ ュ リ ン に 就 い て の Ｘ線 回 析 は Ｃｒ ｔ ｏｍｆｏｒ ， 之 は単結 晶 のものを使. 用して居り， 粉末法については未だ行なった報告がなく比較する事が出来なかった， ８. 施. 光. 度. 再 結 晶イ ワ シ， 抹 香 鯨イ ン シ ュ リ ンを 用 い， ＰＨ３．０ 々２％溶液とし ，８ ．０ 及 び １０．０ に つ い て 夫，. て測定した． 測定結果は 第７表に示す如くである．. ６ ９ ） 等 の 論 じて い る よ う ） や 今 堀 安 藤３ ｔ イ ン シ ュ リ ン の 施 光 度 に つ い て は Ｌｉｎｄｅｒ ｓ ｒ≠ｍ－Ｌａｎｇ３ ，. に， 変 性に伴って左施性が著しく増す事が述 べられ， その原因として分子構造が α 型螺施構造か － １４. －.
(16) . 結晶館イ ンシュリンに関する研究 第１３図ｄ 不定形牛イ ンシュリン. 第１ ３図ｅ 不定形魚イ ンシュリン. ｛ ・ ～ ｛ ず ．. ′. ノ. ‐. 第６表 各種イ ンシュリンの両間隔 ｄｈｋ ｌ（Ａ） 結. 晶. 不定形 変. 性. Ａ １８，４０９ １８，４０９ １８，４０９. １３ ５９８. １４，０４８. １３ ，５９８. ４ ，９００ ４，６９５ ４ ，５０８. ９ ，２１０. １３ ，５９８. ７，３６０. 不定形. １０ ，０４８. 不定形. ３ ，５２１. ４，０２５. 之. ４、６９５ ９ ，２１０. ４ ，２５７. 第７表 鯨イ ンシュ リンの各 ＰＨ に於ける施光度 ＰＨ ３，ｏ. イ. 抹. ワ. シ. 香. ＰＨ ８．ｏ. ＰＨ ＩＯ ．Ｏ. － 〔 〕智 α. ス. －むり管. 鯨. ３０ ．３. ２７５０. ３４．８. ６４ ．０. ２１５０. 鯨. ３１．９. ２７５０. ３６．８. ６４．１. ２１ ２０ ‐. ３１ ．７. ２６５０. ３４．２. ５８．５. ２３００. 牛 節ン ′. ス. ２５５０. － 〔 〕智 α. バ. ら β 型 へ 移 行 す る 為 で あ る と し た 両 鯨イ，ソ シ ュ リ ン に つ い て の 結 果 も 略 々 Ｌｉｎｄｅｒ ｔ ６ ） ． ｓ ｒのｍ－ｌａｎｇ３. 等の結果 と同じであり， アミノ酸分 析の結果牛と比較 して両鯨共Ａ鎖の８・９ ・１ ０の配列が異 ってい るが， 共の立体構造に は大差ないものと考えられる ． ９. ア ミ ノ 酸 組 成. ｉ. 抹 香 鯨 インシュ リン. 再結精製した抹香 鯨イ ンシュリンを１ ０倍量の６Ｎ 塩酸を加え， 封管 コ１１ＯＤＣに て２４時 間 及７２時 間 加熱して加水分解した後， 減圧下で過剰の塩酸を除去後常法により緩衝液で Ｈ を調節 定容 と し た ｐ. １ ６ 後 一 定 量 を 供 試 し た． Ｍｏｏｒｅ Ｓｔｅ ） ， ｉｎ 法 に 従 っ て ア ミ ノ 酸 分 析 を 行 な い別 に Ｃｙｓ の 定 量 をＳｃｈｒａｍ， ４ ０ ） Ｍｏｏｒｅ Ｂ ｉ ｄ Ｔ 法 ｏ ｏ １ ）を併用した 加水分解に於ける個 々のアミ ， ｇｗ ， ｙｒ の定量は 紫外部吸収法４ ．. ノ酸の分解に対す る 補正は２４時間及７２時間両水解物 の 定量数値か ら外挿法に従 って行った ． － １５ －.
(17) . 伊. 藤. 格. 三. 実験結果は第１４図 ａ ， 第８表 に示す如 くである． ，ｂ. 脚，‘＆. “ ′. 一望÷. ２ の. 諸ム ー。 。ぞ. ４時間加水分解物溶出曲線 ４図ｂ 抹香鯨イ ンシュリン２ 第１. ｉ １ ｐ ｈ ． ８ ｎ ｎ ｅ 良 ｅペ ン. １ａ ｉ ｄ ｉ Ｈ ｔ ｎ ｅ. ｏ ｏ. ，. . １６ ８ ｌ ７ ｐ ．. 一 １６ 一. １ Ｈ６ ５ ｐ ，. . 粋司.
(18) . 結晶鯨イ ンシュリンに関する研究 第８表 抹香鯨インシュリンのアミノ酸組成 ア. ミ. ノ. 酸. Ａｓｐａｒ ｉ ｉｄ ［ ｃ ａｃ Ｔｈｒ ｅｏｎｉｎｅ Ｓｅｒ ｉｎｅ Ｇ１ｕｔａｍｉ ｉ ｄ ｃ ａｃ Ｐｒｏ ｌ ｌ ｎｅ. の ア ミ ノ 酸. ｇ ６ ．７６±０，０１ ４，１２ ４ ．９２土０．２８ １６．２９±０ ，１１ １ ．４６. ｉｎｅ Ｇ１ ｙｃ. ５ ．０６±０．０１ ３ ．３４±０ ．０２. Ａ１ ａｎｉｎｅ Ｃｙｓ ｉｎｅ ヒ. １１．０９. Ｖａ ｌ ｉｎｅ ｌ ｌ ｉｎｅ ｓｏ ｅｕｃ Ｌｅｕｃ ｉｎｅ Ｔｙｒｏｓ ｉｎｅ Ｐｈｅｎｙ ｌ ｌ ａ ａｎｉｎｅ Ｈｉ ｉ ｄｉｎｅ ｓｔ Ｌｙｓ ｉｎｅ ｉ Ａｒｇ ｎｉｎｅ Ａｍｍｏｎｌ ａ Ｔｏ ｌ ｔａ. 蛋白質 １００ｇ 中. ８．４５±０ ．０７ ４ ．０８±０．０１. １３．６７±０．１９ １１，８６±０．０９ ８ ．１９ ４ ．８８±０．０７ ２ ．６４±０．０９. ヒ○ ３．２１ゴ ．１５ １１０ ．０２. 蛋白質 １ ００ｇ中 のアミノ酸残基 ｇ ５．８５±０ ．０１ ３．４９ ４．０７±０ ．２３ １２．５９±０．１０ １．２３. ３，８４±０ ．０１ ２ ．６６±０．０２. ９ ．４３ ７．１５±０．０６ ３．５２±０．０１. １１．８０±０．１６. １０ ．６７±０．０８ ７ ．２９. ÷ ４．３１－ ０．０６ ２．３２±０．０８ ２．８７±０．１３ ９３．０９. Ｎ. 回 収. 率. ％ ４．５７±０ ．０１ ３ ，１２ ４，２１±０ ．２４ ９．９７±０，０７. １ ，１４ ６．０７±０ ．０１ ３ ．３８±０．０２. ８ ．３０ ６，４６±０．０５ ２ ．８０±０ ．０１ ９ ．３９±０ ，１３. ５．８９土０ ．０４ ４．４６ ８ ．５０±０ ．１２ ３．２６土０ ．１１ ６．６３±０ ．３１ ９ ．８２. ９８ ．００. イ ンシ ュ リ ン１. 分子中の残基数 ３．０４士０．０１ ２ ．０８ ２ ．８１±０．１１ ６ ．６５土０．０５ ０ ．７６. ：０．０１ ４．０４士 ２ ．２４±０．０１ ２ ．７７ ４ ．３３±０．０４. １ ．８７±０ ．０１ ６．２６±０．０９ ３ ．９３土 －０．０３. ３ ．０２ １．８８土０．０３ １ ．０８±０．０４ １ ．１０±０，０５ ６．２８. ＊ ｃｙｓ ｉｃａ ｉ ｄ として測定し ｃｙｓ として計算 ｔ ｅ ｃ. 抹香 鯨イ ンシュリンのアミノ酸完全分析の結果は第１４図 ａ ，ｂ 及び第８表に示す如くであって， Ｓ Ｔ アミノ 酸の酸による分析に対する補 正は Ｔｙｒ ｈ ｅ ｒ ｒ に対しては水解時間 への外挿法， Ｇ１ ｕ及 ， ， び ｐｈｅ は７２時間の水解値， 他は各時間の平均値 を採った， 表示の如く Ｓａｎｇｅ ｒ の結果 と全く一 致するアミノ酸組成である． ｉ ｉ イワ シ鯨 イ ン シュリ ン. 再結精製 したイワシ鯨イ ンシュリンを 抹香鯨イ ンシ ュリンで 行なったと同様の方 法により加水 ６月こよ り ア ミ ノ 酸 分解， 塩酸除去， 緩衝液で ｐＨ 調 節 定 容 後 一 定 量 を 供 試 し， Ｍｏｏｒｅ ｉｎ 法１ ｅ ， Ｓｔ. 分析 を 行 な い，. ０ ４ ）法 別 にＣｙｓ の 定 量 を Ｓｃｈｒａｍ， Ｍｏｏｒｅ ｇｗｏｏｄ ， Ｂｉ ， Ｔｙｒ の 定量 は 紫 外 部 吸 収. １ ） を併用 した 加水分解に於 ける個々のアミノ酸の分解に 対する補正は抹香鯨イ ンシ リンの 法４ ． ュ. 場合と同様の方 法に従った， 得られた結果は第１５図 ａ， ｂ 及び第９表に示す如くである ． アミノ酸の完全分析に於いて 蛋白質の水解に於けるアミノ酸の破壊 （或いは逆に水解不充分 の 為のペ プチ ッ ド残存） に対する補正が難 しい問題であるが 水解時間を延長しての結果を外挿法で. 処理した． 水解時間を異に した場合の個々の分解態度は第１ ４ ２ 」 ０表に示す如くであるが， Ｈａ ｄｅｎ ｉ ｔ ｓ ． の 結 果 と 傾 向 を 同 じ く し て い る が， Ａｓｐ のみが逆である 之 は Ｈｉ ４ ３ ｉｎ ｒｓ ｅ ，Ｓｔ ． ， Ｍｏｏｒｅ ） の 場 合 が 著 者の結果と傾向 を同じくしている． 窒素回収率及びアミノ酸残基の含有率共に 良好であるので以 上の処理で十分 と考える， 鯨イ ン シ ュ リ ン １ モ ル 当 り の 各 ア ミ ノ 酸 残 基 数 を 見 る 為 に Ｎ‐ 末 端 の Ｇ１ｙ 及 び Ｐｈｅ の 定 量 結 ｉｎ 平 均５ ９００が 得 られ る の で今 Ｍ ｍｉｎ ６ ０００ と し た 此 の 結 果 を Ｈａｒ 果より Ｍｎ・ ２ ） の測 ｆ ｅｎｉ靴４ ， ， ，. 定値と比較すると第１１表の如く である．. 第１１表 よ り 鯨 ・ 牛 ・ 豚 ・ 羊 の ４ 種 のイ ン シ ュ リ ン の ア ミ ノ 酸 含量 を 比 較 す る と ４ 種 イ ン シ ュ リ. ー １７ －.
(19) . 伊. 藤. 格. ゴ. ｏ ｈ ｈ. ｏ ｏ ｏ ｍ ｈ ト Ｎ ， 寸. ① ロ メ リ ロ ① － ○ の 日. 画 像 ”. ○ ” ＼. ｏ ｑ 回 心 像 ｈ Ｄ. 。 曇 . ‐ . . 言 に. . ｓ Ａｒｇ， Ｌｙｓ 及 び ア ミ ド基． モ ル 当 り 総 ｏ ソ 共 同 － 含 量 の ア ミ ノ 酸 と し て Ａｓｐ ， Ｈｉ ， Ｃｙｓ ， Ｐｒ ， Ｇ１ｕ 残 基 数 も ４ 種，同 一 で あ る． 鯨 の み が 特 異 的 に 異 る も の と し て は Ｌｅｕ ， Ｔｙｒ ， Ｐｈｅ が あ る の に 対 し. 羊では Ｇ１ ｙ ， 厭では ＡＩ鴇 がそれ ぞれ特異的に量を異にして存在するアミノ酸である， この他鯨. ｌ は牛より１分 子少 な く 厭 と 同 一， イ ン シ ュ リ ン で は Ｔｈｒ が牛より１分子多く豚と同一， Ｖａ. ａ ｌ １ ｅｕ 牛より１分子多く厭と同一で厭イ ンシ ュリンに最 も近い類似性を示す． 但し豚より Ａ１ ，Ｐｈｅ イ ワ シ の 之 等の Ｔ 有 シ 鯨イ ン リ ン 少な く 含 る 各 子 して い １分 Ｌ を と ｒ ュ ｅｕ を各１分 子多く ｙ ． ，. ） 結果は Ｓａｎｇｅｒ８）９）１６. 等 の 報 告 と は 相 異 す る の で， 之 を 検 討 す る為 に 更 に Ａ 鎖 と Ｂ鎖に 分 別 して. － １８ －.
(20) . 結晶鯨イ ンシュリンに関する研究 ５図ｂ イワシ鯨イ ンシュリン数時間加水分解溶出曲線 第１. 第９表 イワシ鯨イ ンシュ リンのアミノ酸組成 ア. ミ. ノ. 酸. ｉ Ａｓｐａ ｉｄ ｔ ｔ ｃ ａｃ Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｓｅｒ ｉｎｅ ｉｄ Ｇ１ ｕｔａｍｉ ｃ ａｃ ｌ ｉｎｅ Ｐｒｏ Ｇ１ ｉｎｅ ｙｃ ｉｎｅ Ａ１ ａｎ Ｃｙｓ ｉｎｅ＊ ｔ Ｖａ ｌ ｉｎｅ ｉｎｅ ｌ ｌ ｓｏ ｅｕｃ ｉｎｅ Ｌｅｕｃ ｉｎｅ Ｔｙｒｏｓ ｌ ｌａｎｉｎｅ Ｐｈｅｎｙ ａ ｉｎｅ Ｈｉ ｉｄ ｔ ｓ ｉｎｅ Ｌｙｓ ｉｎｉｎｅ Ａｒｇ Ａｎ ｌｍｏｎｌａ Ｔｏｔ ａｌ. 蛋白質 １００ｇ中 の ア ミ ノ 酸. ｇ ６．７４±０ ．０９ ３ ．４３±０ ．１４. 蛋白質 ｔｏｏｇ 中. のアミノ酸残基 ｇ ５ ．８４±０ ．０８ ２．８４±０ ．１２. Ｎ. 回. 収 率. ％ ４．５２±０ ．０６ ２．４９±０ ．１０. イ ン シ ュ リ ン１. 分子中の残基数 ３ ．０４±０．０４ １ ．６８±０．０７. ４．９７±０ ．０２ １６．２９±０ ，０６. ４．１１±０ ，０３ １４．９５±０．０５. ４．２２±０ ．０２ １０ ３ ２±０ ． ．０４. ２ ．８４±０ ．０１ ６．６５土０．ＯＺ. １ ，４６ ５ ．０８±０ ．０２. １．２３ ３ ．８６±０．０２. ５，０３士０ ．０２ １１．０９. ４．０１土０．０２ ９．４３. １ ．１３ ６．０４±０．０２ ５．０４±０ ．０２. ０ ．７６ ４．０５±０．０２. ７，５６±０ ．１９ ０ ５．０８十 一 ．２０. １１．５５±０ ，０８. ８ ．６２±０ ．０４ ８±０ １０ ７ ． ．１１ ５．１０±０ ．２３ ２ ６ ７±０ ． ．３０ ３ ．７２±０．１６ １０９ ．０３. ６．４０十 一０．１６ ４．３８±０．１７ ９．９７±０．０７ ７．７６十０．０３ ９．５９±０．０８ ４．５１土０ ．２０ ２．３０±０ ．２６ ３．３３±０ ．１４ ９４，５１. ｉ ｉ ｄ として測定し ｃｙｓ として計算 ｔ ＊ ｃｙｓ ｃａ ｅ ｃ. － １９ －. ８ ．２３ ５．７６±０．１４. ３．４６±０．１４ ７，８７±０．０５ ４．２５十０．０２ ５，８３±０．０６ ８．８０±０．４３ ３．２０土０．３７ ７．６２±０．３３ ８．８６±０，４６. ９７．６４. ３ ．３９±０ ．０１ ７ ２ ７ ，. ３ ．８８±０．０９ ２ ．３３土０ ．０９ ５ ．２９±０．０３ ２．８６±０．０１. ３ ．９２±０ ．０４ １．９７±０．０９ １ ．０８±０．１２ １ ．２８±０．０５ ５ ．９６土０．３１.
(21) . 藤. 伊. 裕. 一. 第ｉｏ表 加水分解時間延長による影響 残. 基. ｉｎｅ Ｔｈｒｅｏｎ ｉｎｅ Ｓｅｒ ｉ ｉｄ Ｇ１ｕｔａｎ ・ ｃａｃ Ｐｒ ｌ ｉｎｅ ｏ Ｇ１ｙｃ ｉｎｅ ｉｎｅ Ａ１ ａｎ Ｖａ ｌ ｉｎｅ ｉｎｅ ｌ ｌ ｓｏ ｅｕｃ ｉｎｅ Ｌｅｕｃ Ｔｙｒ ｉｎｅ ｏｓ ｌａ ｌ Ｐｈｅｎｙ ａｎｉｎｅ. 平均値叉は外挿値. ７２ ｈｒ. ２４ ｈｒ ｄ ｉ ｉ Ａｓｐｓｒ ｔ ｃａｃ. 数. ２ ．８２ １ ．６３. ＊ ３ ．０４ １．６８＊ ２．８４＊ ６．６５＊＊ ｏ，７６＊ ４．０５. ２ ．４５ １．５２. ２ ．５９ ６．１３ ０ ．７４. ２ ．０９ ６，５４ ０・７１. ３ ．３４ １．６１. ３ ．７７ ２．１８. ３．９７ ３．３９. ４．１２ ３ ．３９. ５．２８ ２ ．４７. ５．３１ １．６７ ３．８０. ３．１４ ‐. ３ ．３９ ＊＊ ３ ．８８ ２．３３＊＊ ５．２９ ２．８６＊ ； ド ネ ３．９２. ＊ 零時間への外挿 ＄ｋ 分解時間時７ ２～９ ６間後の平均 第１１表 種々のイ ンシュ リンのアミノ酸組成 残 ７ ） 牛－Ａ４. 鯨 ｉ ｉ ｄ Ａｓｐａｒ ｔ ｃ ａｃ ｉｎｅ Ｔｈｒ ｅｏｎ Ｓｅｒ ｉｎｅ ｉ ｉ ｄ Ｇ１ｕｔａｎ ・ ｃ ａｃ Ｐｒｏｌ ｉｎｅ ｉｎｅ ． Ｇ，ｙｃ Ａ１ ａｎｉｎｅ Ｃｙｓ ｉｎｅ ｔ Ｖａ ｌ ｉｎｅ ｌ ｉｎｅ ｓｏｌ ｅｕｃ ｉｎｅ Ｌｅｕｃ Ｔｙｒｏｓ ｉｎｅ ｌ Ｐｈｅｎｙ ａｌ ａｎｉｎｅ Ｈｉ ｉｄｉｎｅ ｔ ｓ Ｌｙｓ ｉｎｅ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ａｎ ｌｎ ｌ ｏｎｉ ａ. 基. 数. ７ ） 牛‐Ｂ４. ７ ） 豚４. ３. ３. ３. ３. ２. １. １. ２. ３. ３. ３. ３. ７. ７. ７. ７. １. １. １. １. ４. ４. ４. ４. ３. ３. ３. ２. ３. ３. ３. ３. ４. ５. ５. ４. ２. １. ２. ５. ６. １ ん ６. ６. ３. ４. ４. ４. ４. ３. ３. ３. ２. ２. ２. ２. １. １. １. １. １. １. １. １. ６. ６. ５. ６. 夫々のアミノ酸完全分析を次に試みた． ｉ ｉ ｉ Ａ 及 び Ｂ 鎖 酸 化 イ ン シ ュ リ ン の 調 製 と Ａ 及び Ｂ 鎖の分別. １ ７ ） 羊． ‘３ ｌ ２ ７ Ｉ ５ ３ ３ ５ ｌ ６ ４ ３ ２ ｌ Ｉ ６. １ｏｍｌ ） を加え， 室温で１ ５分間反応後等 ｌｏｏｍｇ） に過義酸 （ 再結晶 したイ ワシ鯨イ ンシュリン （ 量の水を加え反応を停止し， 減圧にて１ 生 量まで濃縮 之に大量のアセトンを加え 成せる沈澱 ／ ３ ， － ２０ 一.
(22) . 結晶鯨イ ンシュリンに関する研究. （酸化イ ンシュリン） を集め乾燥した （ ９６ｍｇ） ． 酸 化イ ン シ ュ リ ンを ｐＨ の 差 に よ り Ａ. 及び. ４ ） に分 別 し 夫 々 約 ３０ｍｇ を得た 各鎖の Ｂ 鎖４ ， ，. アミノ 酸組成は全イ ンシュリン分子のアミノ 酸 完全分析と同様操作にて行な った アミノ酸の酸 ， に よ る 補 正 は 前 述 の 如 く， Ｔｈｒ ，Ｓｅｒ ， Ｔｙｒ ， に 対 して は 水 解 零 時 間 へ の 外 挿 法， Ｇ１ｕ 及 び Ｐｈｅ は ７２時間水解値， 他は各時間の平均値を採った ． この結果は第１６図， 第１７図 ａ ２表に示す如く である． ，ｂ 及 び第１. ｏ ｏ ｏ ｍ ・ ト Ｎ ， 寸. の Ｇ Ｈ Ｑ コ ゆ. の ロ メ ｏ ｈ 一 〇. や 、. ．. 勺. 懲潔く 、擁 へ ょ／. 一２ １一.
(23) . 伊. 藤. 裕. 一. 』. 挺 嶺 玉嚢尋儀. 愈 妾 長誕苗 謙 遜 １ぬ. ”. ｏ ｏ 【 い ぬ ｈ ｏ. ャ蛭 ｂて. ｏ . 博 区ロ. ｏ ｈ 、 . 繕. . . ｙ 悪 撃 ハ ム／. こ こ に 抹 香 鯨イ ン シ ュ リ ンは Ｓａｎｇｅｒ の 鯨イ ン シ ュ リ ン に 対 す る結 果 と 全 く 同 一 で あ る が， イ ワ シ 鯨 イ ン シ ュ リ ンは 明 ら か に 之 と 相 異 す る事 が 認 め ら れ る， Ａ， Ｂ 両 ペ プチ ッ ドに 分別しての ｉ ｅｕ と 分析値を前述の全イ ンシ ュリン分子に対する分析値と比較す る と， 総残基数 に 於 い て ｌ. に於いてそれ１分子宛の入れ替りが見られる． 之で Ｓａｎｇｅｒ の結果に一層接近 ｉ した事にな るが， 明らかに ｌ ｅｕｌ分子少なく， 代りに Ａｉａ が１分子多い事が確認されるに至っ. Ｌｅｕ， Ｔｙｒ と Ｐｈｅ. た． 以 上 の 結 果 を 之 迄 のイ ン シ ュ リ ン と 対 照 し て 纏 め る と 第１３表 の 如 く に な る． 即 ち 抹 香 鯨 イ ン シ ュ リ ン で は Ｓａｎｇｅｒ の 報 告 した， 豚， 鯨 と 全 く 一 致 す る が， イ ワ シ鯨 イ ン シ ュ リ ン では Ａ１ ａ ， － ２２ －.
(24) . 結晶鯨イ ンシュリンに関する研究 第１７図ｂ イワシ鯨インシュリン Ｂ 鎖２ ４時間加水分解物溶出曲線 ．. ェ Ｈ６ ５ Ｐ ．. ８ Ｈ６ ？ Ｐ ．. Ｏ Ｏ ．. 第１２表 イワシ鯨イ ンシュリンＡ及びＢ鎖のアミノ酸組成 蛋白質 １００ｇ中 の ア ミ ノ 酸 Ａ ｉ ｄ ｉ Ａｓｐａｒ ｔ ｃ ａｃ Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｓｅｒ ｉｎｅ ｉ ｄ ｉ Ｇ１ ｔａｎ ｕ ・ ｃ ａｃ Ｐｒｏ ｉｎｅ ｌ ｉｎｅ Ｇ１ｙｃ Ａ１ ａｎｉｎｅ Ｃｙｓ ｉｎｅ ／ ｔ ２ Ｖａ ｌ ｉｎｅ ｌ ｌ ｉｎｅ ｓｏ ｅｕｃ Ｌｅｕｃ ｉｎｅ Ｔｙｒ ｉｎｅ ｏｓ ｔｎｉ Ｐｈｅｎｙ ｌ ａ ｎｅ. ｇ １２，６３ ６．３６. ９，７１ ２１．４０ ３ ．５４ ３ ．８４. １９ ．００ ５．６７ ６．２１ １０．９２ １５．７５. Ｈｉ ｉｄｉｎｅ ｔ ｓ. Ｂ ｇ ４．１１ ３ ．６２. ３．８０ １３ ．３８ ２．８１ ６．８８. ４．９６ ６．０５. ９．２８. １５ ．８１ １０．２２ １２．９７ ７ ．１９. 蛋白質 １００ｇ中 のアミノ酸残基 Ａ. Ｂ. ｇ １０，９２ ５．４０ ８．Ｑ４ １８．７７ ２ ，６９ ３ ．〔６ １６．１５ ４．８６ ５．３６ ９ ．４２. １４．１８. ｉｎｉｎｅ Ａｒｇ. ３．１７ １１ ，７３. ２ ．３７ ５．２３ ３．９５ ５．１４ ７ ．８６ １３．９０ ９ ．２０ １１ ．５４. ３，６１. Ａｎ １ｍｏｎｉ ａ ｌ Ｔｏｔａ. １１５．０３. １０８．４０. 回. ９８ ．８０. ９３，５３. 収. 率. イ ンシ ュ リ ン１. 分子中の残基数. Ａ. Ｂ. Ａ. ８．５２ ４．７７. ％ ２ ．７９ ２．７３. ２ ．３７ １ ．３４. ８，３０ １３ ．Ｃ６. ４．２４ ３．８７. ３．２７ ８ ．２２. ２ ．２１ ８ ．２９. １４．１９. ５ ．０２ ４．５５. ７ ．８７ ７ ，８２. １０ ．９０ ５．１０. ４ ．３４ ４ ．２６. ６．３２ ２ ．８８. ３ ，２９ ４．０３. Ｌｙｓ ｉｎｅ. ｇ ３ ．５６ ３．０８. Ｎ. ７ ．１６. ７ ．１０ １２ ．５６ ４ ．０７ ８ ．３７. １４．０２ ９５．７０. ４ ．２４ ９６，５８. ２ ，３１ ３ ．６４ １ ．１８ １ ．０７. ３ ．９６ １ ．２１. １ ．１８ ２ ．０８ ２ ．１８. Ｂ １ ．１８ １ ．０６. １ ．２７ ３．１８ ０ ．８６. ３．２１ １ ，９５ １ ．７６ ２．７８ ４，２２ １ ．９８. ２ ．７５ １ ，６２. ３ ．９６. ０．７９ ０．８１ １ ．６９. ｌ 工 ｅｕ に相異が見られ， この相異は Ａ 鎖に由来する事も叉明らかに認められる． Ａ 鎖につきイワシ. 鯨イ ン シ ュ リ ン と 他 の ５ 種 を 比 較 す る な ら ば， Ａｓｐ ， Ｌｅｕ ， Ｔｙｒ は 共 通， Ｔｈｒ は厭及 び ， Ｇ１ｕ， Ｃｙｓ － ２３ 一.
(25) . 藤. 伊 第１３表. 抹香. イ ワ シ 鯨 Ａ ｉｄ Ａｓｐａｒ ｉ ｔ ｃ ａｃ ｉｎｅ Ｔｈｒｅｏｎ Ｓｅｒ ｉｎｅ ｉ ｄ Ｇ１ｕｔａｍｉ ｃ ａｃ Ｐｒｏ ｌ ｉｎｅ ｉｎｅ Ｇ１ ｙｃ Ａ１ ａｎｉｎｅ Ｃｙｓ ｉｎｅ ｔ Ｖａ ｌ ｉｎｅ ｌ ｉｎｅ ｓｏｌ ｅｕｃ Ｌｅｕｃ ｉｎｅ Ｔｙｒｏｓ ｉｎｅ. Ｂ. Ｔ. 各種インシュ リンのアミノ酸組成. 豚. 及. 鯨. Ａ. Ｂ. Ｔ. 牛 Ａ. Ｂ. 羊 Ａ. Ｔ. ２. １. ３. ３. ２. ３. １. １. ２. ２. １. ２. ２. １. ３. ３. ２. ３. ２. ３. ４. ３. ７. ７. ４. ７. ４. ７. １. １. １. １. ３. ４. ４. １. ２. ３. ２. ２. １. ３. ３. ２. ３. １. ３. ４. ４. ・. ４. １. ２. ２. ・. ２. ３. ２. Ｂ. Ｔ. Ｂ. ３. ２. １. １. １. ２. １. ４. ７. ４. １. １ １. Ｂ. １. １. ４. １. ４. ２. ５. ２. １ ２. ３. １. ３. ３. ２. ３. ２. ２. ５. ２. ５. １. ２. １. １. １. １. ２. ２. ２. ４. ６. ６. ２. ４. ６. ２. ４. ６. ２. ４. ６. ２. ２. ２. ４. ４. ２. ２. ４. ２. ２. ４. ２. ２. ４. ２. ３. ３. ３. ３. ３. ３. ３. ３. ３. ２. ２. ２. ２. ２ １. ２. ２. ２. ２ １. １. １. １. ・. ・. １. １. １. １. １. １. １. １. １. １. １. ２. ６. ６. ２. ６. ２. ６. ２. ６. Ｐｈｅｎｙｌ ｌ ａｎｉｎｅ ａ Ｈｉ ｉｄｉｎｅ ｔ ｓ ｉｎｅ Ｌｙｓ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ａｍｍｏｎｉ ａ. 註. 鯨. ゴ. 格. ４. ４. ４. Ｉ Ｉ Ｉ ３ Ｉ ３ ２ Ｉ ３ ４ ２ ３ ２ Ｉ. ４. Ｉ ２. Ｔ ３ ２ ２ ７ １ ５ ２ ３ ４ ２ ６ ４ ３ ２ １ １ ６. Ａ……Ａ鎖 Ｂ……Ｂ鎖 Ｔ……Ａ 及び Ｂ の合計. 馬 と 同 一， Ｓｅｒ は豚及び牛と同一， Ａ１ ｌ は 厭 及 び 馬 と 同一， ｌ ｉ ａ は牛及び羊と同一， Ｖａ ｅｕ は牛及. び馬 と同一である．. この様な抹香鯨とイワシ 鯨両イ ンシ ュリン共アミノ 酸 組成の相異を更に確認する為に 両イ ンシ. ュリンのアミノ 酸結合順序を検討する事に研究を進めた， １０ 末 端 基 の 定 量 牛 イ ン シ ュ リ ン の Ｎ 末 端 に 就 いて は 既 に１９３５年 Ｊｅｎｓｅｎ５１ が ヒ ダ ソ トイ ン法 で ｐｈｅ であ る 事. を報告しているが， 定量的でなく， 且つ叉 ｐｈｅ だけという事に疑問があ った． 次いで１ ９４５年末. ６ ７ ）１ ）４ ） が ＤＮＦＢ を用 い 牛 Ｓａｎｇｅｒ９ ， 厭， 羊 の イ ン シ ュ リ ンの ア ミノ 末 端 と して Ｐｈｅ と Ｇｉｙ と. を定量した．. 研 究 室 では 先 に ＤＮＦＢ を用 い て 結 晶 鯨イ ン シ ュ リ ンの Ｎ 末 端 を ペ ← パ ー ク ロ マ ト グラ フィ ー. で定性的に牛・豚と同じく ｐｈｅ ７ ） て， 之を定量的に検討した４ ，. と Ｇ１ ｙ. Ｊ， ここに分子量測定の必要もあ っ である事を認めたが ６. ＤＮＰ－ ア ミ ノ 酸 の 定 量 に は 従 来 Ｓａｎｇｅｒ の 行 な っ た シ リ カ ゲ ル の ク ロ マ ト グラ フ ィ ト が 広 く用. ４ ９ ８ ｝ ）に 従 っ て 行 な っ た ｉ ｌ いられているが， 種々の見地よ り著者は Ａｍｂｅｒ ｔｅＩＲ－ １１２を 用 い る方 法４ ． Ｃ 末端に就いては， 酵素的及び化学的の二方法があ るが 酵素法では牛イ ンシュリンに就いて ，. ５ ０ Ｌｅｎｓ （１９４９） 」 が 力 ル ポ キ シ ル ペ プチ ダ ー ゼ を 作 用 さ せ Ａｉ ｌ ａ を 見 出 し た が， 他 に Ｇ１ｙ ， Ｖａ ， Ｔｙｆ ５ １ ン ｉ な どの痕跡を認めている． その後 Ｈａｒｒ Ａ Ａ ｉ １ ＮＨ Ａ ９ ５ ２ は じ方 ｓ（ ） 同 法で ａ ）， ｓｐ を検出 ， ｓｐ （ ２ ６ ’ も こ の 酵 素 を ア セ チ ルイ ン シ ュ リ ン に 作 用 さ せ Ａ１ａ Ａｓｐ （ＮＨ２ し， 更 に Ｓａｎｇｅｒ （１９５３）４ ）， ， Ａｓｐ を認めた． 一方化学的方法として Ｌ ８ ｉ ＢＨ‘ ）（ １９５２ ）は ま で Ｇ１ｙ， Ａｉａ を検出した． 更に赤堀１ － ２４ 一.
(26) . 結晶鯨イ ンシュリンに関する研究 ヒ ドラ ジ ン法 で 同 じ く Ｇ１ｙ と Ａ１ａ を 検 出 し て い る．. こ こ に著 者 は 鯨イ ン シ ュ リ ンに 就 い て， ヒ ドラ ジ ン法 と ＤＮＦＢ 法 を 併 用 し Ａｍｂｅｒ ｉ ｌ Ｃ－５０ ｔ ｅ ＩＲ ‐. で定量を行ない， Ａ１ ） を Ｃ 末端として確認すると共に分子量算出を行な った． ａ ｐ （ＮＨ２ ，Ａｓ アミノ末端及び遊離アミノ基. ＤＮＰ イ ン シ ュ リ ン の 調 製 ： 再 結 晶イ ワ シ 鯨イ ン シ ュ リ ンｌｏｏｍｇ と重炭酸ソー ダｌｏｏｍｇ を水 ５０ｍｌ に 溶 か し， 無 水 エ タ ノ ー ル ｌｏｏｍ１ と ＤＮＦＢ ０，５ｍｌ を加え， ２時間振湯後生じた ＤＮＰ イ. ンシュリンの黄色沈澱を遠心分離後水， エタノール及びエーテルで洗線乾燥した． このもののア マイ ドーＮ は０，９６％ で あ っ た． 尚再 結 晶イ ン シ ュ リ ン の ア マイ ドーＮ は１．３４％ であ っ た． こ の 事 か ら ＤＮＰ イ ン シ ュ リ ンｌｏｏｍｇ はイ ン シ ュ リ ン７１ ．５ｍｇ に相当する．. 末 端 基の 定性. ＤＮＰ イ ン シ ュ リ ン１ｏｍｇ に ６Ｎ 塩 酸１ｏｍｌ を加え８時間煮沸し冷後ェ←テル で３回抽出しエー テ ル 区 分 と水 溶 液 区 分 と に 分 離， エ ー テ ル 区 分 は ェ ← テ ル 除 去 後 ペ ← パ ー ク ロ マ ト グラ フ ィ ー（溶 媒 ブ タ ノ ー ル ー 酢 酸 － 水 ９：１：７ ， フ ェ ノ ← ル ー 水 ４：１） に て ＤＮＰ‐Ｇ１ｙ と ＤＮＰ‐Ｐｈｅ を 確 認 し. た． 叉水溶液区分は乾固後更に８ 時間６ Ｎ 塩酸で加水分解し， 常法に従って塩酸を除去後ペー パ ー ク ロ マ ト グラ フィ ー で Ｅ ‐ＤＮＰ‐Ｌｙｓ を 確 認 し た． ペ ー パ ← ク ロ マ ト グ ラ フィ ー 結 果 は 第１４表 に. 示す，. 第１４表 イワシ鯨イ ンシュ リン Ｎ－末端基の定性 エーテル 区 分 Ｓｐｏｔ ｌ ．. 標準. 水溶液区分. Ｓｐｏ ｔ ２. Ｐｈｅ. Ｐｈｅ. ＤＮＰ‐アミ ノ 酸 Ｇ１ ｙ. ８‐ＤＮＰ－Ｌｙｓ. 水. ０ ，９０. ０ ．７５. ０．８１. ０，８９. ０ ．７２. ０ ．８４. ブタノール；酢酸：水. ０ ，８８. ０ ，８１. ０ ．６３. ０ ．８７. ０ ，７５. ０ ，６３. フ ェ ノ ー ル ：. 末 端 基 の 定量 ＤＮＰ イ ン シ ュ リ ン各 ２０ｍｇ を ６Ｎ 塩 酸 １ｏｍｉ で８時間 ４時間 ２時間煮沸し 冷却後 各々 ， ， ， ，. エーテルて３回抽出し， エ ーテル区分は水で洗練し， 洗液は水溶液区分に 合した． エーテル区分 ｉ ｌ はエーテル除去後１％塩酸－酢酸 （８：２） の混液を溶媒として Ａｍｂｅｒ ｔ ｅＩＲ－１１２ （Ｈ型０．９ｃｍ×. １ ５ ） カラムにて溶出分析を行なった， 叉水溶液区分は濃縮乾固後， 更に６Ｎ 塩酸にて８時間加 ｃ ｍ ｌ ｉ ｔ 水分解を 行ない Ａｍｂｅｒ １１２ （Ｎａ ｅ ＩＲ‐ －型 ０．９ｃｍ×１５ｃｍ） カラ ム に て Ｍ／ ４０ ク エ ン酸 緩 衝 液 を 溶 媒 として溶出分 析を行なった． それぞれの定量結果は第１８図及び第１５表に示す如くであ る ，. 以 上 の 結 果イ ワ シ 鯨イ ン シ ュ リ ン の Ｎ 末端としては Ｇ１ ｙ と Ｐｈｅ が各１分子存在し， この他分 子中に Ｌｙｓ が１分 子含まれている事を確認した. ．. カルボキシル末端及び酸性アミノ酸. 末 端基の 定 性 再 結 晶イ ワ シ 鯨イ ン シ ュ リ ン１ｏｍｇ に 無 水 ヒ ドラ ジ ン０．５ｍｌ を加え１ ０時間煮沸冷却 後硫酸デシ. ケ ー タ ー 中 で濃 縮 乾 固， 之 を 水５ｍｌ に 溶か し 次 い で ペ ン ズ アル デ ヒ ← ド０ ３ｍｌ を加え過剰のヒ ド ．. ラ ジ ンを 除 去 後， 遮 液 を 濃 縮 し 極 く 少 量 の水 に 溶 か し ペ ー パ ← ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に よ り Ａｓｐ （ＮＨ２ ）， Ａ１ ａ 及 び 必Ａｍｉｎｏ ｂｕｔ ａ を認めた. 末 端 基 の 定量. ，. ３ ２ ）５ カルポキシル基並びに酸性アミノ酸の定量には５ Ｊ ア ル デヒ ー ド 処 理 し て ヒ ドラ ジ ッ ド を 除 －２ ５一.
(27) . 伊. 藤. 格. 三. 第１８図 イワシ鯨インシュ リンの ＤＮＰ…アミノ酸溶出曲線. 戦 ／ ｏ ，. . . . ５表 第１. 加水分解時間. 鯨イ ンシュ リン Ｎ 末端及び避難アミノ基. ＤＮＰＭ アミノ酸 ｉｎｅ Ｇ１ ｙｃ ｌ ｉａ Ｐｈｅｎｙ ａｎｉｎｅ. ２. ４. 量. 値. ０，２４ ０．６１. 均. 正 ０ ．５８ ０ ．８５. ９３. １ ．０７ ０．８１ ０ ．７５. ｉｎｅ Ｇ１ ｙｃ ｌ ｌ Ｐｈｅｎｙ ａｎｉｎｅ ａ. ０ ．４６ ０ ．６５. ５７. ｉｎｅ Ｇ１ ｙｃ. ０ ．４３ ０．７５. ４０. ０ ．７５. 補. ９２ ．５. ７３. ０，１８ ０．９９. ８７. ７４ ８４. 値. １ ．０７ １ ．ｎｌ ０ ．８４. ０．８２ ０ ．８７. ｉｎｅ Ｇ１ ｙｃ. 平. 分 解補 正 値. ｉｄｅ ｌａｎｙｌ Ｐｈｏｎｙｌ －ｐｅｐｔ ａ ｉｎｅ ｅ‐ＤＮＰ－Ｌｙｓ. ｌａ ｌａｎ ｉｎｅ Ｐｈａｎｙ ｉｎｅ ｅ‐ＤＮＰ－Ｌｙｓ. ８. 定. ｌ Ｐｈｅｎｙｌａ ａｎｉｎｅ ｉｎｅ ｅ‐ＤＮＰ－Ｌｙｓ. ０．９６. ｌ ） ｌ ）／イ ンシュリン （ｍｏ 定量値 ： ＤＮＰ‐アミノ酸 （ｍｏ 分解補正値 ： ＤＮＰ－アミノ酸の残存率 （％） ｌ ｌ ） ）／イ ンシュリン （ｍｏ 補正値 ： ＤＮＰ‐アミノ酸 （ｍｏ. ｓ が末端にあ る場 ，Ｔｒｙ ， 及 び Ｈｉ 去す る方 法 と ア ル デ ヒ ー ド処 理 し な い方 法 と が あ る． 前 者 は Ｔｙｒ. 合， 後者は酸性アミノ酸のペ プチ ド中の結合状態を調 べ るのに適してい る． イワシ鯨イ ンシ ュリンの Ｃ 末端は定性試 験により上記の３種アミノ酸を認めているので， 後者 ＤＮＰ 化及 の方法に従って定量を行なった． 即ち再結晶インシ ュリン１ｏｍｇ をヒ ドラ ジ ン分解後. ｉ ＩＲＣ－ ｂ ｌ び ア ル カ リ 抽 出 に て Ｃ 末 端 区分 と ヒ ドラ ジ ッ ド区 分 と に 分 別 し た． Ｃ 末 端 区 分 は Ａｍ ｅｒ ｔｅ ６０ ５０ （Ｈ型０．９ｃｍ×３０ｃｍ） に て 分 別， 各 区分 を 切 り取 り， ア セ ト ン 一 水 （１：１） 混 液 に て 溶 出 後３. と にて比色定量した． 次にヒ ドラジッ ド区分， 即ちアルカリで抽 出されず酢酸 エチル層に残っ ｍ′ － ２６ －.
(28) . 結晶鯨イ ンシュリンに関する研究. た区分は 之を減圧乾固後６Ｎ 塩酸で５ 時間加水分解して 生成した ＤＮＰ ア ミ ノ 酸を 酢 酸 エ チ ル で ｉ ｎ を 定 量 し た． 測 定 ｔ ｔ 抽 出 し Ａｍｂｅｒ ５０ （Ｈ型０，９ｃｍ×３０ｃｍ） で分 別 し ＤＮＰ‐Ａｓｐ ｅＩＲＣ－ ， ＤＮＰ‐Ｇ１. 結果は第１６表に示す．. ６表 イワシ鏡イ ンシュ リンｃ末端及び酸性アミノ酸含量 （１分子当リモル数） 第１ ア. ミ. ノ. 酸. 結 合 状 態１ 定 量 値. 補 正 率 ｉ補 正 値. Ａ１ ａｎｉｎｅ. Ｃ‐ 末. 端. ０，８６. ９０. ０．９２. Ａｓｐａｒａｇｌ ｎｅ. Ｃ－ 末. 端. １ ，０４. ９３. １ ．１１. Ａｓｐａｒａｇ ｌ ｎｅ. ペ プチ ド. １ ．４６. ７８. １ ．８８. Ｇ１ 灯ｌｎｅ ｕヒａｌ. ペプチ ド. ２ ．２５. ７８. ２ ，８９. 全モル数. ｉｄ Ｇ１ｕ ｔａｍｉ ｃ ａｃ ６. ｄｅ Ａｍｉ. ） が各 第１６表 に示 す 通 りイ ワ シ 鯨 イ ン シ ュ リ ン の カ ル ボ キ シル 末 端 と し て は Ａ１ａ と Ａｓｐ（ＮＨ２ １モル含まれ 更に分子中には Ａｓｐ （ＮＨ２） ２ モ ル， Ｇ１ｕ ７ モ ル 中３ モ ル が ア マイ ドと し て 存 在 し. ４ モ ル が ‐ＣＯＯＨ を持って 存在す る事を確認した． これらの結果は従来の牛・豚・羊等について. ｎｏ ｂｕｔａ一は定量操作で認められ 得られた結果 と全く一致す る， 尚定性試験で検出された 伴Ａｍｉ ず， 先のアミノ酸分析 にても認 められなかった事よ りして二次的生成物と考える， 既往に於て化 ）５ ４ ５ ８ ） Ｇ１ｙ が Ａ ）５ １ ） の他に Ｃ 末端として 報告され， 酵素 ａ 学 的 方 法 を 用 い た 場 合１ ｐ （ＮＨ２ ， ，Ａｓ ７表 イワシ鯨インシュリ 第１. ソ最少分子量 （末端 基定量値より計算）. 末. 端. 基. ｉｎｅ Ｇ１ ｙｃ ｌａｎｉｕｅ Ｐｈｅｎｙａ. ５，８６９ ６ ，１８３ ６，５９０ ５，２６０. Ａ１ ａｎｉｎａ ｉｎｅ Ａｓｐａｒａｇ. 平. 最少 分 子量. 均. ５，９７ ５. ０ ６ ０ １ ）４ ）５ ） に は之 が 認 め ら れ な い事 か ら ）５ を 用 い る 場 合１ ， 問. 題 と な っ て い る が， この 鯨 イ ン シ ュ リ ン の 場 合 も ＤＮＰ Ｇ１ ｙ ｌ ｉ ｔ ５０ のカラム上で認めたの で ｅ ＩＲＣ‐ 区分の痕跡を Ａｍｂｅｒ. ，. こ の 部分 を 溶 出 し， ア ン モ ニ ヤ に よ り ＤＮＰ を分離し， ペー. パ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で 再 び確 認 し た， 反 応 の 際 に Ｇ１ ｙ. を Ｃ‐末端とす る様な 特別に切れ易い場所が あ るのかも知れ ないが詳細は明らかでない， 以上のＮ末端， 及びＣ末端定量値からイワシ鯨イ ンシュリ ７表に示す如くであ る． ンの最少分子量を求めると第１. 即ち， 鯨イ ンシ ュリンの最少分子量は約６ ，０００であ る． なお過去に於いて牛， 隊， 羊等のイ ン ）Ｓ１ｕｙｔ ５ ７ ５ ３ ） Ｊ Ｆｒ ｉ ｉ ｆｎｉ ｔ ｅｒｍａｎ （１９５５），５ ｅｄｅ ｃｑ ｓ シ ュ リ ン に就いて Ｈａｒ ｇ（１９５２）， Ｓａｎｇｅｒ （１９５５），５ ，Ｃｒａ ９ ） 等 の 結 果 も ６ ０００ で これ と 同 様 であ る， １９５６）篤）（１９５７），５ （ ，. １１ アミノ酸結合順序 Ａ Ａ鎖の結合順序 ａ 鯨及び 豚ペプシンによる加水分解生成ペプチ ドの検索. ｏ ８時間作用さ せ た ｌｏｏ塩 酸２ Ａ 鎖２０ｍｇ を Ｎ／ ．５ｍｌ に溶解之にペプシンｌｍｇ を加え， ３７ Ｃ で４. 後沸騰水 中に入れ反応を停止し， 凝固物を遠心除去してから上清を乾固後， 小量の蒸溜水に溶解 し， 之 を フ ェ ノ ー ル 一 水 （４：１）， 及 び ブ タ ノ ←ルー 酢酸－水 （４：１：５） の両溶媒系で二次元 ペ ー パ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 行 い， 各 ペ プチ ドを 分 別 し た． 分 離 し た 各 ペ プチ ドを 切 り 取 り，. ０５０Ｃ１６時 間 加 水 分 解 し， 構成 ア ミ ノ 酸 を ペ ー パ ー ク ロ マ 蒸溜水で抽出し濃縮乾固後６Ｎ 塩酸で１ － ２７ 一.
(29) . 伊. 藤. 裕. 一. ト グラ フィ ー に よ り 同 定 し た． 叉 同 様 操 作 に て 分 別 し た ペ プチ ドを １ ％ トリ メ チ ル ア ミ ソ に て 抽. 出 し ＤＮＦＢ に て ＤＮＰ 化 し ペ プチ ドの ア ミ ノ 末 端 基 を ペ ー パ ー ク ロ マ ト グ ラ フィ ー で 同 定 し. た． イワシ鯨イ ンシュリンのペ プシ ン水解生成 ペ プチ ドの分別及び その構成アミノ酸の検索は第 １９図第２０図， 第１８表第１９表， 抹香鯨イ ンシュリンについての 結果は第２１図第２２図， 第２０表第２１表 に示す如くである．. ９図 イワシ鯨イ ンシュリン Ａ‐鎖の豚ペプシンによる分解物のペーパークロ４ トグラム 第１ こフリー′し一 挙. ＾ｎ Ｊ （. . 『. . ①. ① ④. 第２０図 イワシ鯨イ ンシュリンＡ鎖の鯨ペプシンによる分解物のペー パー クロマトグラム ／し－７ｋ ＼ 乙ノー. ０ ２ ．. Ｏ 卒 ．. ナ る ー 港 ６ 歯０ ， － ミー ミト. ①① ① ⑩. ＼. ８－ －２.
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