―青森県弘前市における Acanthamoeba spp.の棲息調査と感染能―
櫻 庭 理 絵
＊１田 中 謙 次
＊２熊 谷 正 広
＊３木 田 和 幸
＊４稲 葉 孝 志
＊５（2010 年 9 月 30 日受付，2010 年 12 月 14 日受理）
要旨：アカントアメーバはヒトの生活環境下に密接な土壌・淡水・海水などに広く分布してお り，近年，アメーバ性髄膜脳炎や角膜炎の原因として注目されている。そこで，青森県弘前市 の児童公園に設置する砂場の砂，家屋室内塵，コンタクトレンズ及びその洗浄保存液の棲息調 査を行ったところ，公園67ヶ所から採取した砂68検体中66検体（97.1%），及び，室内塵では10 検体全てからアメーバが検出された。検出したアメーバは Pussard & Pons の方法に則り 3 タ イプに分類した。コンタクトレンズ 9 検体及び洗浄保存液38検体からは検出されなかった。更 に，分離したアメーバの無菌培養を試み，C.B-17/scid マウスへ感染実験を行ったところ，感染 マウスは神経症状を呈して斃死した。剖検により，アメーバの脳への侵入が高率に認められた。
今回の研究により，砂から分離したアカントアメーバは免疫不全者に対する感染リスクが示唆 された。
キーワード：アカントアメーバ，アメーバ性肉芽腫性脳炎，アカントアメーバ性角膜炎，
児童公園砂場，室内塵
＊１弘前大学大学院保健学研究科生体機能科学領域
病態解析科学分野
〒036-8564 弘前市本町66-1
＊２株式会社岸本医科学研究所札幌ラボ
＊３東京慈恵会医科大学熱帯医学講座
＊４弘前大学大学院保健学研究科健康支援科学領域
健康増進科学分野
＊５弘前大学大学院保健学研究科医療生命科学領域
病態解析科学分野
Ⅰ．はじめに
アメーバ類は非常に多種の存在が明らかにされてお り，なかでもヒトに病原性を持つアメーバ類として古 くから知られているものに
Entamoeba histolytica
が ある。E. histolytica
はアメーバ赤痢の原因となる病原 体であり，患者の粘液血性便から発見されたのは1875 年の Losch による報告が初めてであったが，このア メーバによると思われる疾患は紀元前から存在が知ら れていた１）。しかし，近年，土壌や海水などの自然環 境下に多数存在し，以前は非病原性と考えられていた 自由生活性アメーバの中で，ヒトに感染してアメーバ 性髄膜脳炎や皮膚アメーバ症，また，アメーバ性角膜 炎を惹起する種類の存在が明らかにされ，なかでも，Acanthamoeba
spp.，Naegleria fowleri
，Balamuthia mandrillaris
，Sappinia diploidea
などの症例が世界各地から報告されている２），３）。この，病原性を有する アメーバの種類は今後も更に増えていく事が予想さ れる。アメーバ性髄膜脳炎は，病理学的に
N. fowleri
に よ る 原 発 性アメーバ性髄 膜 脳炎（PAM: primary amoebic meningoencephalitis），及び，Acanthamoeba
spp.，B. mandrillaris
によるアメーバ性肉芽腫性脳炎（GAE: granulomatous amoebic encephalitis）に分け られる。PAM は急性で劇症型の疾病であり，40〜
45℃の水温を好む
N. fowleri
を病原体とするが４），淡 水や汚染されたプールで泳いだり潜ったりした際にア メーバが鼻腔から侵入する事でも感染する。また，ま れに汚染された浴槽水からの感染の報告もある。脳の 嗅球部ではアメーバは急速に分裂し， 7 〜10日以内で 死に至る。免疫機能が正常な健常者にも感染のリス クがある２）。対して，GAE は慢性で進行性の疾病で，これらのアメーバの CNS（central nervous system）
への侵入経路には，嗅神経上皮からによるものと，経 皮や経肺感染などの血行性によるものが推測されて いる５）。
Acanthamoeba
spp.はN. fowleri
よりも増殖 速度が遅いため，慢性肉芽腫性炎症反応が引き起こ されるとの報告もある３）。一般にAcanthamoeba
spp.を病原体とする GAE は HIV や糖尿病患者，臓器移 植や抗癌化学療法による免疫抑制患者，薬物中毒患者 などの免疫機能が正常でない易感染者に関与する疾患 である。一方，
B. mandrillaris
によるものは健常者に も感染の可能性がある２）。これらのアメーバ性髄膜脳 炎は診断法や治療法が確立されていない事から症例の 多くが死亡例であり，国内では1979年にアメーバ性脳 炎症例が報告されて以来，1998年までに 6 例の発生 がみられている６），７）。アメーバ性角膜炎は症例のほ とんどがAcanthamoeba
spp.によるものであり，主 にソフトコンタクトレンズの使用や角膜の外傷が感染 リスクとなる。難治性で予後不良であり，迅速に治 療が行われない場合，失明の危険がある２，３）。国内で は1988年に第 1 例が報告されて以来８）年々増加して おり，症例が各地で頻発している９−11）。青森県内で もAcanthamoeba
spp.を起因とする角膜炎が1998年12）と2004年に報告された。自由生活性アメーバの中でも
Acanthamoeba
spp.は，ヒトの生活環境下に密接な土 壌・淡水・海水などに広く分布し，ヒトへの曝露の危 険性が高いと言える。また，Acanthamoeba
spp.はラ イフサイクルに栄養型（trophozoite）と嚢子（cyst）の 2 つのステージを持っている。栄養型は分裂体で あり，嚢子は休止期にみられる２，３）。
Acanthamoeba
spp.は自然環境中においてこの嚢子を形成する事で低 温や乾燥に抵抗し，長期間に渡り生存している事が推 測される。寒冷地の青森県においてもAcanthamoeba
spp.による角膜炎が報告されているにも関わらず，東 北地方でのAcanthamoeba
spp.の棲息状況に関する 報告が無い事から，本研究では，北東北の青森県弘前 市内児童公園の砂場の砂68検体，また，家屋室内塵10 検体，コンタクトレンズ 9 検体及びその洗浄保存液38 検体を対象としてAcanthamoeba
spp.の棲息調査及 び分離を試みた。検出されたアメーバは嚢子の形態学 的特徴により 3 タイプに分類した。更に，分離された アメーバを用いて T，B 細胞の機能不全である C.B-17/scid マウスへ感染実験を行い，自然環境中に棲息する
Acanthamoeba
spp.の感染能について検討した。Ⅱ．材料と方法 1 ．材料
（ 1 ）砂検体
青森県弘前市内児童公園67ヶ所に設置された砂場か ら68検体の砂を採集した。採集するにあたり，事前に 弘前市公園緑地課に砂場の砂を採集する事の承諾を得 た。検体は深さ約20 cm の砂場中央の砂を50 ml の滅 菌コニカルチューブに採取し，乾燥防止のため密封し た。採取した検体は使用時まで4℃に保存した。
（ 2 ）家屋室内塵
弘前市居住者10世帯の土足で汚染されない住居内塵 を各自宅の電気掃除機で吸引したものを検体とした。
採取した室内塵は撹拌し，篩を通して落下した細塵を 用いた13）。
（ 3 ）コンタクトレンズ及び洗浄保存液
東北地方に居住するコンタクトレンズ使用者を対象 とし，使用済みコンタクトレンズと使用済みコンタク トレンズ洗浄保存液をケースに入れたまま回収した。
回収した洗浄保存液は3000 r.p.m.，10分間遠心し，沈 渣100 µl を用いた。
（ 4 ）実験動物
6 〜10週齢の T ， B 細胞の機能不全である C.B-17/
lcr-
scid/scid
Jcl（以下 C.B-17/scid マウス）を使用した。実験は，弘前大学実験動物に関するガイドラインを遵 守し行った。
（ 5 ）培養試薬類
①KCM 溶液（アメーバ用塩類溶液）
KCl（ 和 光 純 薬 ）0.7 g，CaCl（ 和 光 純 薬 ）0.8 g，2
MgSO4-7H2O（和光純薬）0.8 g を蒸留水で1000 ml に メスアップし，オートクレーブで滅菌処理したものを 原液とし，冷蔵保存した。使用時にその原液を100倍 希釈し，オートクレーブで滅菌処理した14）。
②1.5% NN 寒天培地
KCM 溶液100 ml に Bacto agar（Difco）1.5 g を溶解 し，オートクレーブで滅菌処理した。滅菌後，直径 9 cm の滅菌プラスチックシャーレに 8 ml 流し込み（厚 さ約 2 〜 3 mm となるように），寒天培地を作製した15）。 抗生剤を加える場合は，ミコナゾール硝酸塩（和 光純薬）0.01 g を N-N ジメチルホルムアミド（和光純 薬）1 ml で溶解し，KCM 溶液 9 ml を加えて濃度1000 µg/ml とし，KCM 溶液で希釈して濃度62.5 µg/ml と した。このミコナゾール硝酸塩62.5 µg/ml を培地：ミ コナゾール硝酸塩＝ 9：1 となるように加えた。ミコナ ゾール硝酸塩の濃度は，真菌の発育を極力抑え，また，
アメーバの発育には影響を及ぼさない濃度にした。
③大腸菌液
Acanthamoeba
spp.は各種細菌や乾燥イーストなど を餌として捕食し，食作用により体内消化する事が 知られている16）。そこで本研究ではアメーバの餌となAcanthamoeba spp.の研究―青森県弘前市におけるAcanthamoeba spp.の棲息調査と感染能― 149
る大腸菌液を作製した。5 ml の KCM 溶液中に大腸菌
（DH 5 α株）を McFarland No.1 の濁度になるように 調製した。それを60℃， 1 時間熱処理し，大腸菌液と した。1.5% NN 寒天培地上に大腸菌液250 µl 滴下し，
滅菌コンラージ棒で一面に塗り，乾燥させて用いた。
④PYG 液体培地
K2HPO（和光純薬）4 0.522 g，KH2PO（和光純薬）4 0.408 g を 蒸 留 水 で600 ml に メ ス ア ッ プ し， 5 mM K2H/
KH2PO4とした。この 5 mM K2H/KH2PO4約300 mlに Glucose（和光純薬）7.5 g を溶解させ，残りの 5 mM K2H/KH2PO4と共にオートクレーブで滅菌処理した。
滅菌後，Glucose を溶解した溶液に Proteose peptone
（Difco）3.75 g，Yeast extract（Difco）3.75 g を溶解し，
5 mM K2H/KH2PO4で500 ml にメスアップしてよく撹 拌した。これを濾過滅菌し，PYG 液体培地とした17）。 抗生剤を加える場合は，ペニシリン G カリウム（明 治製菓）500 U/ml，硫酸ストレプトマイシン（明治製 菓）50 µl/ml を加えた。どちらも PBS（pH7.3）に溶 解して用いた18）。
2 ．方法
（ 1 ）アメーバの検出と分離培養
①検体からのアメーバの検出
採取した砂は汚染が著しいため，細菌や真菌の混入 を抑える目的で抗生剤を用いた。コニカルチューブ に砂約 5 g を入れ，KCM 溶液20 ml を加えて混和し，
2000 r.p.m.，5 分間遠心洗浄した。上清をデカントし，
ミコナゾール硝酸塩6.25 µg/ml を20 ml 加えて混和 し， 4 ℃で一晩放置した。翌日，混和後に2000 r.p.m.，
5 分間遠心洗浄した。上清を捨て，KCM 溶液20 ml を加えて混和し，2000 r.p.m.， 5 分間遠心洗浄した。
上清を捨て，アメーバの餌として熱処理した大腸菌を 塗布したミコナゾール添加1.5％ NN 寒天培地の中央 に砂約1.5 g を置いて KCM 溶液を数滴滴下し，ビニー ルテープで密封して30℃の暗所で培養した。
採取した室内塵約100 mg，また，コンタクトレン ズ及び洗浄保存液沈渣100 µl についても1.5％ NN 寒 天培地に置き，同様に培養した。コンタクトレンズは 左右のレンズをそれぞれ培地上に置いて培養した。
培養後，倒立顕微鏡下で精査し，アメーバの有無を 確認した。
②検出アメーバの分類
検出されたアメーバが嚢子を形成したところで，
Pussard & Pons（1977） の 方 法 に 則 り， 嚢 子 の 特 徴 か ら ア メ ー バ を Ⅰ 型（astronyxids type）， Ⅱ 型
（polyphagids type）， Ⅲ 型（culbertsonids type） の 3 タイプに分類した（図 1 ）19）。
③砂から検出したアメーバの無菌培養
砂から出てきたアメーバを，パスツールピペットを 用いて KCM 溶液を吹きつけて吸引し，新しい寒天平 板培地に移した。この操作を，細菌や真菌の混入が極 力少なくなるまで繰り返した。寒天培地上で分離し 図１ 嚢子形態による