考察

あるいはSTIM1-CTを発現させた卵の受精時のCa²⁺流入の程度を比較したとこ ろ，いずれもコントロール（Venus 発現卵）に対して有意な差は見られなかっ た（図5.8）．これらの結果は，マウス卵受精時にはSTIM1/Orai1を介したSOCE はほとんど活性化されず，Ca²⁺振動の維持には寄与していないことを示唆して いる．

一方，Orai1と相互作用して活性化する作用があるSTIM1-CCb9を発現させ

た卵では，受精時のCa²⁺振動の頻度が顕著に増加した（図5.6 D，図5.7）．ま た，Mn²⁺投与時の消光速度は，STIM1-CCb9を発現させた卵で未受精時・受精 時ともに有意に増加していた（図 5.8）．これらの結果は，マウス卵に存在する Orai1はSTIM1によって活性化され得ること，また活性化されればCa²⁺振動に 対して有意に寄与するだけの Ca²⁺流入を担い得ることを示唆していると考えら れる．

図5.7 Orai1-NT, STIM1-CT, STIM1-CCb9のCa²⁺振動の頻度に対する効果 Ca²⁺振動開始から2時間で生じた[Ca²⁺]cytの上昇回数（平均±標準偏差）．* は Venus発現卵（コントロール）に対して有意差があることを示す（p< 0.01) ．

図5.8 Orai1-NT, STIM1-CT, STIM1-CCb9のMn²⁺流入速度に対する効果 Venus, Orai1-NT, STIM1-CT, STIM1-CCb9を発現させた卵での0.5 mM Mn²⁺

投与時のfura-2の消光速度．（灰色：未受精卵，白：受精卵）（平均±標準誤差）．

*はVenus発現卵（コントロール）, ** は対応する受精卵に対してそれぞれ有意

差があることを示す（p< 0.01) ．

を示唆するものであった．

本実験では，SKF-96365, 2-APB, Gd³⁺, La³⁺をSOC阻害剤として用いたが，

こ れ ら の 阻 害 効 果 は 必 ず し も SOC に 特 異 的 な も の で は な い ． 例 え ば SKF-96365は，電位依存性Ca²⁺チャネルやTRPチャネルも阻害する（Merritt et al.,1990; Boulay et al., 1997）．STIM1によって活性化されるCa²⁺流入に対

しては20 µMの濃度で顕著な阻害効果を示すことが報告されているが（Liou et

al., 2005），本実験では30 µMでもCa²⁺振動は阻害されなかった．同様に，Gd³⁺

や La³⁺も多くの種類の Ca²⁺チャネルを広く阻害する．SOCE に対する IC50は それぞれ1 µMと10-100 µMといわれているが，受精時Ca²⁺振動にはいずれも

100 µMでも阻害効果はなかった．なお，精子を直接マウス卵の細胞質に注入す

ることで誘発したCa²⁺振動についても，低濃度のGd³⁺では効果がないことが報 告されている（Miao et al., 2012）．

2-APB は約 10 µM 以上の濃度で SOCE を阻害することが報告されている

（Gregory et al., 2001; Kukkonen et al., 2001）．受精卵のCa²⁺振動は10 µM では阻害されず，30 µMではむしろ頻度が上昇した．なお50 µMでは卵が死滅 するため測定できなかった．培養細胞株HEK293においては，2-APBがSOCE に対して二相性の効果を示すことが報告されている（DeHaven et al., 2008）． 即ちSTIM1/Orai1経路を介したCa²⁺流入が，3~10 µM の2-APBで促進され，

逆に30~50 µMでは抑制された．また，SOCを介したイオン電流の測定によっ

ても，10 µMを境とした同様の二相性の効果が示されている（Prakriya & Lewis, 2001）．しかし，30 µM 2-APB存在下の受精卵においてMn²⁺流入速度が増加し ていなかったことは，マウス卵での2-APBの作用はSOCEに対するものではな

いことを意味していると考えられる．

STIM1-CTやOrai1-NTを過剰発現させても，受精卵でのCa²⁺振動が影響さ れなかったという結果は，SOCEがCa²⁺振動の維持には関与しないという結論 をさらに支持するものである．STIM1とOrai1タンパク質はともにマウス卵に 発現しており（Gómez-Fernández et al., 2009），また本実験で STIM1-CCb9 によって Ca²⁺流入が促進されたことは，マウス卵においても STIM1 と Orai1 を介したSOCEが活性化され得ることを意味している．おそらく受精卵での反 復性 Ca²⁺遊離の際の一過性の[Ca²⁺]ERの低下は，SOCE を活性化するには足り ない程度なのだと考えられる．Orai1が受精卵でもほぼ活性化されずにいること は，コントロール卵と比較した時の STIM1-CCb9発現卵における Mn²⁺流入速 度の増加幅が，未受精卵と受精卵とでほぼ同じであったことからも示唆される

（図5.8）．なお，STIM1-CCb9発現卵ではCa²⁺振動の頻度が10倍程度にまで 増加したが（図5.7），これはMn²⁺流入速度の増加率（約1.5倍，図5.8）に比 べて著しく大きい．従って，STIM1-CCb9による頻度の増加はOrai1を介した Ca²⁺流入に対する促進効果だけでは説明できない．例えば，Ca²⁺遊離チャネル や Ca²⁺取りこみ・排出の能動輸送系などに対して作用したのかも知れない．

D1ER を用いた[Ca²⁺]ER 変化の測定によって，Ca²⁺ストアの再充填速度に対す

るSTIM1-CCb9の効果の検証を試みたが，振動頻度が速すぎるため正確な測定

ができなかった．作用機序は不明ではあるが，今回の結果は，Oraiの活性化と は別の，新たなSTIMの機能を示唆しているものと考えられる．

最近，RNA干渉によりSTIM1やOrai1タンパク質の発現を抑制したマウス 卵で受精時の Ca²⁺振動を測定した実験の結果が報告された（Lee et al., 2012;

Wang et al., 2012）．何れの場合も正常卵に比べてCa²⁺振動の頻度が有意に減少 したことから，著者らはSTIM1/Orai1を介したSOCEがCa²⁺振動の維持に関 わっていると結論している．しかし，これらの実験系ではSTIM1やOrai1の発 現が卵成熟過程で常に抑制されていることになる．卵成熟は細胞内構造の大規 模な変化を伴う過程であり，小胞体Ca²⁺ストアの変化も含め，受精時のCa²⁺反 応に必要な細胞内機構が発達してくる過程でもある（Fujiwara et al., 1993）．

従って，STIM1やOrai1の発現抑制の効果は，成熟後の卵での受精時のSOCE

の減少としてだけ現れると単純には解釈できない．実際，彼らが報告している 測定例では，始めの[Ca²⁺]cyt上昇の大きさが異常に小さい．このことは，STIM1

やOrai1はむしろ卵成熟の間のCa²⁺遊離機構の発達過程に関与していることを

示唆しているものと考えられる．

本研究課題での実験結果から，マウス受精卵ではSOCEは活性化していない，

あるいは仮に活性化しているとしてもその程度はわずかであり，SOCE 経路を 介したCa²⁺流入はCa²⁺振動の維持には寄与していないものと考えられる．研究 課題２で示されたように，Ca²⁺遊離後には何らかのCa²⁺流入経路が一過的に活 性化されているはずであるが，その実体としては今後 STIM1/Orai1 を介した SOCE以外の経路を想定して検証していく必要がある．