考察

本研究課題では，タンパク性 Ca²⁺プローブ D1ER と fura-2 を用いて，マウ ス卵受精時のCa²⁺振動中の[Ca²⁺]ERと [Ca²⁺]cytの変化を同時に測定し，Ca²⁺流 入速度と小胞体Ca²⁺ストアへのCa²⁺の再充填速度との関係を明らかにした．

D1ERを用いることによって，今回初めてマウス卵での[Ca²⁺]ERの変化を測定 することができた．これまでに，Miyawakiらが開発したyellow cameleon（YC）

3-er やYC 4-er をマウス卵に発現させて[Ca²⁺]ERの測定を試みたことはあった が，いずれのプローブも発現はするものの，全く小胞体に局在しなかった．本 実験でD1ERが小胞体に局在した理由は不明だが，１つはD1ERにはFRETア クセプターとして YFP の代わりに citrine が使われていることにあるのかも知 れない．また，今回用いた RNA の非翻訳領域（UTR）が原因かも知れない．

YC 3-erやYC 4-erを発現させる時に用いたRNAは5’側UTRを持たなかった のに対し，今回pGLS/(A)21x8を使って合成したRNAは，グロビンの5’-UTR

（-globin leader sequence; GLS）を持つ．一般に5’-UTRの配列はリボソー

ムとの相互作用や翻訳開始の制御に関わっている(Kozak, 1991)．GLSの配列 によって，小胞体膜上リボソームによる翻訳およびその後の小胞体内腔へのタ ンパク質のco-translationalな移行が促進された可能性がある．しかし，本実験 で用いたRNAやその発現のための培養条件では， D1ERが小胞体に十分局在 しなかった卵もあり，[Ca²⁺]ERの測定に用いることができた卵は3割程度であっ た．小胞体への局在の効率をより高めるため，今後培養条件等のさらなる検討 が必要である．

本実験でD1ERの測定に用いた励起波長（450 nm）と蛍光測定波長（C: 480

nm, Y: 535 nm）では，細胞内の酸化型フラビン由来の自家蛍光が混入し得る

（Shirakawa & Miyazaki, 2004）．マウス受精卵において，フラビン由来の自 家蛍光が[Ca²⁺]cyt 依存的に変化することが報告されており（Dumollard et al.,

2004），実際今回の測定系でも，D1ERを発現させなかったコントロールの受精

卵で微弱ではあるが自家蛍光が記録され，Ca²⁺振動の際にYとCの両方のシグ ナルが変動するケースが観察された．自家蛍光の変化は，始めの[Ca²⁺]cyt上昇時 に最も顕著で，以後の[Ca²⁺]cyt上昇では微小であった．図4.3の測定例において，

始めの[Ca²⁺]cyt上昇の開始時に Y/C 比が一過性に上昇しているのは自家蛍光の 影響によるもの思われるが，以後の変化については，Yと C の強度が反対向き に変化していることからも，ほぼD1ER のシグナル変化を示していると考えら れる．

図 4.3 の測定例からも示唆されるように，一過性[Ca²⁺]cyt 上昇が生じる [Ca²⁺]ER閾値レベルは，Ca²⁺振動開始からしばらくの間低下し，その後ほぼ一定 の値となる．この変化は，受精後に精子の PLCが 30~60 分かけて徐々に卵内

に移行し（Knott et al., 2006），それに伴って卵内のIP3濃度が徐々に上昇する こと（Shirakawa et al., 2006; Matsu-ura et al., 投稿準備中）に対応している と考えられる．第１章でも論じたように， [Ca²⁺]cytの急峻な上昇相はIP3R/Ca²⁺

チャネルに対する細胞質 Ca²⁺のポジティブ・フィードバックによって形成され る．細胞質のIP3濃度が高まるとIP3R/Ca²⁺チャネルの開口確率が増加するので，

IP3濃度が低い時に比べて Ca²⁺遊離の駆動力がより小さい時点で同等の Ca²⁺遊 離速度が得られる．即ち，IP3 濃度が高いと，[Ca²⁺]ER がより低い時点で Ca²⁺

によるポジティブ・フィードバックがかかり始める [Ca²⁺]cytに達し得ることに なる．

Ca²⁺遊離時に[Ca²⁺]ERが急激に低下し，その後徐々に回復していく一連の時間 経過は，研究課題２で明らかになった Ca²⁺流入速度の時間的変化（図 3.4）と よく類似している．このことは，マウス受精卵での Ca²⁺遊離後に活性化される Ca²⁺流入チャネル（CRAC）が，[Ca²⁺]ERの低下によって活性化されるいわゆる ストア作動性チャネル（SOC）であることを示唆しているようにも思われる．

しかし，第３章でも論じたように，例えばIP3やその代謝産物であるIP4の濃度 も，一過性[Ca²⁺]cyt上昇と同期して一過性に増加する．また任意の Ca²⁺依存性 機能タンパク質も同様に，[Ca²⁺]cytの変化とともに活性が変動するはずである．

したがって，[Ca²⁺]ER変化の時間経過との類似性だけでは，マウス受精卵におけ るCRACの活性化のメカニズムを判別することはできない．本研究の課題４で は，SOCE経路の存在を想定して，その受精時のCa²⁺振動における機能的関与 を検証する実験を行っている（第５章）．

本研究課題では，マウス卵受精時の[Ca²⁺]ERの変化を実測によって初めて明ら

かにできただけでなく，その Ca²⁺流入に対する依存性を明示したことにより，

Ca²⁺流入は細胞内 Ca²⁺ストアの再充填のための Ca²⁺を供給することで Ca²⁺振 動を維持するという仮説に対して，実験的な根拠を与えることができた．