方法

であることも示唆されている（Mohri et al., 2001）．受精卵でのCa²⁺振動時に 実際に SOCE が活性化されるのか，また活性化されるとして SOCE を介した Ca²⁺流入がCa²⁺振動の維持のために有意に寄与しているのかどうかは，現時点 では不明である．

本研究課題は，マウス受精卵においてSOCEがCa²⁺振動の維持に寄与してい るかを検証することを目的とした．そのためにSOCEを阻害することが知られ ているGd³⁺，La³⁺，SKF-96365，2-aminoethoxydiphenyl borate（2-APB）と いったチャネル阻害剤が受精時の Ca²⁺振動に与える影響について調べた．さら に，卵に内在するSTIM1とOrai1の相互作用を阻害するSTIM1やOrai1由来 のタンパク質フラグメントや，Orai1を直接活性化する効果を持つペプチドが受 精時のCa²⁺振動に及ぼす影響についても検証した．

させることでも，SOCE が阻害されることも報告されている（Takahashi et al., 2007）．STIM1によるOrai1の活性化は，それぞれのC末端，N末端領域にあ る coiled-coil 領域同士の相互作用によるものと考えられている（Wang et al., 2009）． Kawasakiらは，STIM1のC末端領域のcoiled-coil領域を含むペプチ ド（STIM1-CCb9）がOrai1を介したCa²⁺流入を活性化することを報告してい る（Kawasaki et al., 2009）．これらの報告を参考に，本研究では，マウス卵に 内在するSTIM1とOrai1の相互作用を阻害するために，マウスSTIM1のC末 端部位（STIM1-CT）とマウスOrai1のN末端部位（Orai1-NT）を，また内在

性Orai1を内在性STIM1非依存的に活性化させるためにマウスSTIM1-CCb9

を用いることとした（図5.2）．

STIM1とOrai1のcDNAについては，C57BL/6J 系マウス（日本SLC）の 脳から採取したmRNAから逆転写酵素（SuperScript III，インビトロジェン）

により逆転写して，タンパク質コード領域全長をクローニングした．STIM1-CT，

STIM1-CCb9，Orai1-NT に 相 当 す る 部 分 の cDNA は ，PrimeStar DNA

polymerase（タカラバイオ）を使用して，それぞれ表5.１に示したプライマー

を用いて増幅し，pGLS/(A)21x8ベクターにサブクローニングした．なお，それ

ぞれのcDNAの3’末端には蛍光タンパク質VenusのcDNAを連結し，卵での

発現量を Venus の蛍光強度により評価できるようにした．RNA 合成は，4.2.1

と同様の手順で行った．

5.2.2 成熟卵および精子の採取

成熟卵および精子の採取および前処理は2.2.1と同様の手順で行った．

P/A TM1 TM2 TM3 TM4 CC Orai1 P/AP/A TM1TM1 TM2TM2 TM3TM3 TM4TM4 CCCC Orai1

P/A Venus

Orai1-NT VenusVenus P/AP/A Orai1-NT

N C

N C

STIM1-CCb9 Venus CC2CC2CC2

STIM1-CCb9 VenusVenus CC2CC2CC2CC2CC2CC2CC2CC2CC2

STIM1-CT Venus CC1 CC2 P K

STIM1-CT VenusVenus CC1CC1CC1 CC2CC2CC2 PP KK SAM

EF TM CC1 CC2 P K

STIM1 EFEF SAMSAM TMTM CC1CC1 CC2CC2 PP KK STIM1

N C

N C

図5.2 Orai1とSTIM1およびOrai1-NT , STIM1-CT, STIM1-CCb9の模式図 P/A：プロリンリッチ領域， TM：膜貫通領域， CC：coiled-coil 領域，EF：

EF-hand ドメイン， SAM：SAM ドメイン，P：プロリンリッチ領域，K：リ

シンリッチ領域，Venus：蛍光タンパク質

表5. 1 STIM1/Orai1断片のcDNA合成に用いたプライマー

塩基配列

STIM1-CT forward AACTCGAGAAGGAGCACATGAAGAAAATG reverse TTGCGGCCGCCTACTTCTTAAGAGGCTTCTTAA STIM1 CCb9 forward AACTCGAGAGCTCATGGTATGCTCCTG

reverse TTGCGGCCGCCTAGTTATTGACAATCTGGAAACCG Orai1-NT forward AACTCGAGATGCATCCGGAGCCTGCC

reverse TTGCGGCCGCCTTAAGCTTTGAGCTTGGCGC

5.2.3 卵細胞へのRNA注入

成熟卵への RNA 注入は，基本的には未成熟卵への注入（4.2.3）と同様に行った．

STIM1-CT, Orai1-NT,またはSTIM1-CCb9のRNAを150 mM KClで適当な濃度に 希釈し，ガラス微小ピペットを用いて成熟卵の細胞質に約5 pL注入し，5% CO2，37°C のインキュベーター内で4時間培養して発現させた．

5.2.4 Ca²⁺イメージングおよびMn²⁺消光法

Ca²⁺イメージングは2.2.2と同様の光学系および測定条件で行った． Mn²⁺消光法に ついては，3.2.2と同様の手順により行った．

GdCl3とLaCl3は超純水で100 mMになるように溶解したものをストック溶液とし た．SKF-96365，2-APBはDMSOでそれぞれ50 mM, 100 mMになるように溶解し，

それらをストック溶液とした． 受精時の Ca²⁺振動の途中で，それぞれ最終濃度の 2 倍濃度になるようにM2 培地で希釈したものを，測定中のM2 培地のドロップに等量

（200 µL）を投与した．