方法

2.2.1 成熟卵および精子の採取

本実験では，ddY マウス（日本 SLC）のメスマウス（6 週齢以上）とオスマ ウスを用いた．すべての実験は，電気通信大学動物実験指針に従って行った．

成熟卵の採取のために，メスマウスに以下の過排卵処理をした．血清性性腺刺 激ホルモン（ピーメックス，三共エール薬品，5 U）を腹腔内注射し，その 18 時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ゴナドトロピン，三共エール薬品， 5 U）

を腹腔内注射した．ゴナドトロピン注射の16時間後に卵管から成熟卵を取り出

した．採取した卵は常にM2培地（NaCl 94.6 mM, KCl 4.8 mM, CaCl2 1.7 mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSO4 1.2 mM, NaHCO3 5.1 mM, HEPES （

4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid） 10 mM, Na lactate 19.6 mM, Na pyruvate 0.5 mM, Glucose 5.6 mM，BSA 4 mg/ml， pH 7.2）の中で 扱った．実験で用いた他の薬品はM2培地に溶解して用いた．卵丘細胞は0.05%

ヒアルロニダーゼによって分解，除去した．

精子はオスマウスの精巣上体尾から採取し，M16培地（NaCl 94.6 mM，KCl 4.8 mM，CaCl2 1.7 mM，KH2PO4 1.2 mM，MgSO4 1.2 mM，NaHCO3 25 mM, Na lactate 17.8 mM，Na pyruvate 0.33 mM，Glucose 5.6 mM, BSA 4mg/ml）

のドロップ（200 L）の中に入れ，5%CO2，37°C のインキュベーター内で培 養した．１時間後，M16ドロップの上方を泳いでいる精子を5 Lまたは10 L を採取し，新たなM16培地のドロップ（200 L）に加えた．以後18 時間以上 培養することで受精能を獲得させた．

2.2.2 Ca²⁺イメージング

fura-2 AM（同仁）はDMSO（和光）で4 mMに溶解したものをストック溶

液とした．使用時には，これに細胞膜内へのプローブの浸透を高める導入補助 薬であるpluronic F-127（Molecular Probes）（0.05%）を等量混和し，fura-2 AM の最終濃度が2 MになるようにM2培地で希釈した．採取した成熟卵を2M fura-2 AMで37°C，10分間染色し，その後酸性タイロード溶液（NaCl 173 mM，

KCl 7.0 mM，CaCl2 1.6 mM，MgSO4 0.5 mM，glucose 27 mM，HCl 1.6 mM，

PVP-40 0.5 mM，pH 2.5）で約1分処理することで透明帯を除去した．

fura-2の蛍光イメージングには従来型の落射型蛍光顕微鏡（Axiovert S-100, カールツァイス）を用いた．ガラスボトムディッシュに200 µLのM2培地のド ロップを作り，蒸発を防ぐために流動パラフィンで覆った上で，顕微鏡ステー

ジ上で32-34°Cに加温した．透明帯を除去した卵をそのM2ドロップ内におき，

5分程度静置して卵がカバーグラス面に十分付着するのを待った後，前培養した 精子を少量くわえて媒精した．蛍光イメージングには20倍対物レンズ（FLUAR，

NA0.75，カールツァイス）を用い，励起光源として安定化 Xeランプ（75 W，

浜松ホトニクス）を用いた．340 ± 5 nmと380 ± 5 nmのバンドパスフィルタ ー（朝日分光）をフィルター切り替え装置（Labmda10-2，サッターインストル メント）を用いて切り替えることで，340 nmと380 nmの2波長で交互に励起 した．生じた蛍光は，535 ± 12 nmのバンドパスフィルター（オメガオプテイ カル）を通した後，ICCDカメラ（ICCD-350F, ビデオスコープ）によって検出 し，ビデオ信号をフレームキャプチャボード（LG-3, サイオン）により 8 ビッ トでＡ／Ｄ変換してパソコン（PowerMac G3, アップル）に取り込んだ．蛍光 画像は典型的には20 秒間隔で取得した．それぞれの励起波長での蛍光画像をも とに，個々の卵の蛍光強度（F340, F380）を測定し，バックグラウンド減算をし た後，蛍光強度比（F340/F380）を算出して， [Ca²⁺]cyt の指標とした．なお，フ ィルター切り替え装置の制御，蛍光画像の取得およびその解析は，すべてフリ ーソフトウェアの NIH Image をもとに作成した独自のプログラムによって行 った．

受精によるCa²⁺振動が安定した後，適当なCaCl2濃度のM2培地をステージ

上のM2ドロップ（1.7 mM CaCl2）に加えることで，[Ca²⁺]oを変化させた．例 えば，[Ca²⁺]oを 1/2 にする際には，CaCl2を含まない M2 培地をドロップと等 量（200 µL）加えた．[Ca²⁺]oを0 にする際には，CaCl2を含まずかつ10 mM EGTAを加えたM2培地を等量（200 µL）加えた．