4. 生物学的試験法／生化学的試験法／
4.01 エンドトキシン試験法
での粒子の飛散を利用してもよい．測定結果には，用いた振と う法と振とうに関係するパラメータ(これらを変化させること ができる場合には)を記載しておかねばならない．
2.1.4. 終点の決定
ふるい分けは，いずれのふるいについても，ふるい上質量変 化が直前の質量に対して5％(76mmふるいの場合には10％)又 は0.1g以下となったとき，終了する．所定のふるいの上の残留 量が全試料質量の5％未満となった場合には，終点は，そのふ るい上の質量変化を直前の質量に対して20％以下まで引き上 げる．各条中に別に規定するもののほか，いずれかのふるい上 に残留した試料量が全試料質量の50％を超えた場合には，ふ るい分けを繰り返す．このふるいと，元の組ふるいの中でこれ より粗い目開きを持つふるいとの中間にあるふるい，すなわち，
一群の組ふるいから削除されたISOシリーズのふるいを追加す る．
2.2. ふるい分け法
2.2.1. 機械的振とう法(乾式ふるい分け法)
各ふるいの風袋質量を0.1gまで量る．質量を正確に量った試 料を最上段のふるいの上に置き，ふたをする．組ふるいを5分 間振とうする．試料の損失がないように組ふるいから各段のふ るいを注意深くはずす．各ふるいの質量を再度量り，ふるい上 の試料質量を測定する．同様にして，受け皿内の試料質量も測 定する．ふるいを再度組み合わせ，更に5分間振とうする．先 に述べたように各ふるいをはずし，質量を量る．これらの操作 を終点規格に適合するまで繰り返す(終点の決定の項を参照)．
ふるい分けを終了した後，全損失量を計算する．全損失量は元 の試料質量の5％以下である．
新たな試料を用いてふるい分けを繰り返すが，このときは先 に用いた繰り返し回数に対応する合計時間を1回のふるい分け 時間とする．このふるい分け時間が終点決定のための必要条件 に適合していることを確認する．一つの試料についてこの終点 の妥当性が確認されている場合は，粒子径分布が正常な変動範 囲内にあれば，以後のふるい分けには一つの固定したふるい分 け時間を用いてもよい．
いずれかのふるいの上に残留している粒子が単一粒子ではな く凝集体であり，機械的乾式ふるい分け法を用いても良好な再 現性が期待できない場合には，他の粒子径測定法を用いる．
2.2.2. 気流中飛散法(エアー・ジェット法及びソニック・シ フター法)
気流を用いた種々の市販装置がふるい分けに利用されている．
1回の時間で1個のふるいを用いるシステムをエアー・ジェッ ト法という．本法は乾式ふるい分け法において述べたのと同じ 一般的なふるい分け法を用いているが，典型的な振とう機構の 代わりに標準化されたエアー・ジェットを用いている．本法で 粒子径分布を得るためには，最初に最も細かいふるいから始め，
個々のふるいごとに一連の分析をする必要がある．エアー・ジ ェット法では，しばしば通常の乾式ふるい分け法で用いられて いるものより細かい試験用ふるいを用いる．本法は，ふるい上 残分又はふるい下残分のみを必要とする場合には，より適して いる．
ソニック・シフター法では組ふるいを用いる．この場合，試 料は所定のパルス数(回/分)で試料を持ち上げ，その後再びふる いの網目まで戻すように垂直方向に振動する空気カラム内に運 ばれる．ソニック・シフター法を用いる場合は，試料量を5g
まで低減する必要がある．
エアー・ジェット法とソニック・シフター法は，機械的ふる い分け法では意味のある分析結果が得られない粉体や顆粒につ いて有用である．これらの方法は，気流中に粉体を適切に分散 できるかどうかということに大きく依存している．粒子の付着 傾向がより強い場合や，特に帯電傾向を持つ試料の場合には，
ふるい分け範囲の下限付近(＜75μm)で本法を用いると，良好 な分散性を達成するのは困難である．上記の理由により，終点 の決定は特に重大である．また，ふるい上の試料が単一粒子で あり，凝集体を形成していないことを確認しておくことは極め て重要である．
2.3. 結果の解析
個々のふるい上及び受け皿中に残留している試料の質量に加 えて，試験記録には全試料質量，全ふるい分け時間，正確なふ るい分け法及び変数パラメータに関する値を記載しておかねば ならない．試験結果は積算質量基準分布に変換すると便利であ る．また，分布を積算ふるい下質量基準で表示するのが望まし い場合には，用いたふるい範囲に全試料が通過するふるいを含 めておく．いずれかの試験ふるいについて，ふるい分け中にふ るい上に残留している試料の凝集体の生成が確認された場合は，
ふるい分け法は意味がない．
1) 粒子径測定，試料量及びデータ解析に関するその他の情報は，例え ば，ISO 9276において利用できる．
2) International Organization for Standardization (ISO) Specification ISO 3310－1；Test sieves－Technical requirements and testing
4. 生物学的試験法／生化学的試験法／
微生物学的試験法
4.01 エンドトキシン試験法
本試験法は，三薬局方での調和合意に基づき規定した試験法である．
エ ン ド ト キ シ ン 試 験 法 は ， カ ブ ト ガ ニ(Limulus polyphemus又はTachypleus tridentatus)の血球抽出成分より 調製されたライセート試薬を用いて，グラム陰性菌由来のエン ドトキシンを検出又は定量する方法である．本法には，エンド トキシンの作用によるライセート試液のゲル形成を指標とする ゲル化法及び光学的変化を指標とする光学的測定法がある．光 学的測定法には，ライセート試液のゲル化過程における濁度変 化を指標とする比濁法，及び合成基質の加水分解による発色を 指標とする比色法がある．
エンドトキシン試験は，ゲル化法，比濁法又は比色法によっ て行う．ただし，その結果について疑義がある場合又は係争が 生じた場合は，別に規定するもののほか，ゲル化法によって最 終の判定を行う．
本法はエンドトキシンによる汚染を避けて行う．
1. 器具
試験に用いるすべてのガラス製及びその他の耐熱性器具は，
有効とされている方法により乾熱処理を行う．通例，少なくと も250℃で30分間の乾熱処理を行う．また，マルチウエルプレ ート及びマイクロピペット用チップなどのプラスチック製品を
用いる場合は，エンドトキシンが検出されないこと及びエンド トキシン試験に対する干渉作用のないことが確認されたものを 用いる．
2. 溶液の調製
2.1. エンドトキシン標準原液の調製
エンドトキシン標準原液はエンドトキシン標準品をエンドト キシン試験用水で溶解して調製する．エンドトキシン標準品の 力価は，世界保健機関のエンドトキシン国際標準品を基準とし て標定される．なお，エンドトキシン単位はEUで示し，1EU は1エンドトキシン国際単位(IU)に等しい．
2.2. エンドトキシン標準溶液の調製
エンドトキシン標準溶液はエンドトキシン標準原液を十分に 振り混ぜた後，エンドトキシン試験用水で希釈して調製する．
エンドトキシン標準溶液は，エンドトキシンの容器への吸着を 避けるため，できるだけ速やかに使用する．
2.3. 試料溶液の調製
別に規定するもののほか，被検試料をエンドトキシン試験用 水で溶解又は希釈し，試料溶液とする．ライセート試液と試料 溶液の混液のpHが用いるライセート試薬に規定されるpH範囲 になるように，試料溶液のpHの調整を必要とする場合もある．
通例，試料溶液のpHは，6.0～8.0の範囲にあればよい．pHの 調整に用いる試液又は溶液はエンドトキシン試験用水を用いて 調製し，エンドトキシンが検出されない容器に保存する．これ らの試液又は溶液は，エンドトキシンが検出されないこと，及 び反応干渉因子を含まないことが保証されたものでなければな らない．
3. 最大有効希釈倍数の求め方
最大有効希釈倍数とは，試料溶液中に存在する反応干渉因子 の影響を希釈により回避できるとき，許容される試料溶液の最 大の希釈倍数である．
最大有効希釈倍数は，次の式によって求める．
最大有効希釈倍数
＝(エンドトキシン規格値×試料溶液の濃度)／λ
エンドトキシン規格値：注射剤のエンドトキシン規格値は，
投与量に基づいて規定されており，K／Mに等しい．なお，
Kは発熱を誘起するといわれる体重1kg当たりのエンドト キシンの量(EU/kg)であり，Mは体重1kg当たり1回に投与 される注射剤の最大量である．ただし，注射剤が頻回又は 持続的に投与される場合は，Mは1時間以内に投与される 注射剤の最大総量とする．
試料溶液の濃度：試料溶液の濃度の単位は，エンドトキシン 規 格 値 が質 量 当た り(EU/mg)で 規 定 さ れて い る場 合 は mg/mL，当量当たり(EU/mEq)で規定されている場合は mEq/mL，生物学的単位当たり(EU/単位)で規定されてい る場合は単位/mL，容量当たり(EU/mL)で規定されている 場合はmL/mLである．
λ：ゲル化法の場合はライセート試薬の表示感度(EU/mL) であり，比濁法又は比色法の場合は検量線の最小エンドト キシン濃度(EU/mL)である．
4. ゲル化法
本法は，エンドトキシンの存在によるライセート試液の凝固 反応に基づいて，エンドトキシンを検出又は定量する方法であ
る．
本法の精度と有効性を保証するために，「4.1.予備試験」と して「4.1.1.ライセート試薬の表示感度確認試験」及び「4.1.2.
反応干渉因子試験」を行う．
4.1. 予備試験
4.1.1. ライセート試薬の表示感度確認試験
ライセート試薬の表示感度とは，ライセート試薬に規定され ている条件下でのライセート試液の凝固に必要な最小エンドト キシン濃度である．ライセート試薬は各ロットにつき，使用す る前にその表示感度λを確認しなければならない．
本試験は，試験結果に影響を及ぼす可能性が予想される試験 条件の変更があるときにも行う．
ライセート試薬の表示感度の確認は，次の方法により行う．
エンドトキシン標準原液をエンドトキシン試験用水で希釈し，
2λ，1λ，0.5λ及び0.25λの4種の濃度のエンドトキシン標 準溶液を調製する．
ライセート試液及びそれと等しい量，通例，0.1mLのエンド トキシン標準溶液を試験管にとり，混和する．単回試験用の凍 結乾燥ライセート試薬を用いる場合は，その容器にエンドトキ シン標準溶液を直接加え，ライセート試薬を溶解する．
これらの試験管又は容器を通例，37±1℃に保ち，振動を避 けて60±2分間静置した後，穏やかに約180°転倒し，内容物を 観察する．流出しない堅固なゲルが形成されているとき，陽性 とする．ゲルを形成しないか，又は形成したゲルが流出すると き，陰性とする．
調製した4種の濃度のエンドトキシン標準溶液を用いて，こ の4種の液を一組とした試験を4回行う．
各回の試験において，濃度0.25λのエンドトキシン標準溶液 がすべて陰性を示すとき，試験は有効である．試験が有効でな いときは，試験条件を整備して再試験を行う．
各回の試験において，陽性を示す最小エンドトキシン濃度を エンドポイント濃度とし，次の式によって4回の試験の幾何平 均エンドポイント濃度を求める．
幾何平均エンドポイント濃度＝antilog(Σe／f ) Σe：各回のエンドポイント濃度の対数eの和 f：試験の回数
求めた幾何平均エンドポイント濃度が0.5～2λの範囲にある とき，ライセート試薬の表示感度は確認されたと判定し，以下 の試験にはその表示感度を用いる．
4.1.2. 反応干渉因子試験
本試験は，試料溶液について，反応を促進又は阻害する因子 の有無を調べる試験である．
表4.01－1に従い，A，B，C及びD液を調製し，A及びB液は 4回，C及びD液は2回試験する．反応温度，反応時間及びゲル 化判定法は，4.1.1.に従う．
B液及びC液の幾何平均エンドポイント濃度は，4.1.1.の計算 式を準用して求める．
本試験は，試験結果に影響を及ぼす可能性が予想される試験 条件の変更があるときにも行う．
A及びD液の試験結果がすべて陰性で，C液の試験結果によ りライセート試薬の表示感度が確認されたとき，反応干渉因子 試験は有効とする．