論文内容の要旨

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氏名青^{あお} 松^{まつ} 昭^{あき} 徳^{のり} 学位の種類博士 (医学) 学位記番号甲第620号

学位授与年月日令和3年3月15日

学位授与の要件自治医科大学学位規定第4条第2項該当

学位論文名急性腎障害を調節するマイクロRNAの解析-新規遺伝子治療法およびバイオマーカーへの応用-

論文審査委員 (委員長) 水上浩明教授

(委員) 秋元哲教授嵯峨泰准教授

1 研究目的

急性腎障害（acute kidney injury: AKI）は腎機能が急激に低下する重篤な病態であり、全入院患者の20%に発症し患者死亡の大きなリスクである。AKIは脱水、感染、外科手術による腎血流低下、薬剤による尿細管障害、腫瘍や結石による尿路閉塞など様々な原因で発症し生命予後を悪化させている。AKI の予後改善のためには早期診断、早期治療介入が重要である。しかし、AKI に特異的な治療法および早期診断を可能にするバイオマーカーは未だ確立されていない。近年、

特異的治療法や早期診断法がなかった分野で、マイクロRNA(miRNA)の有用性が注目されている。

miRNAは細胞に内在する、21-25塩基長のタンパク質を作らないノンコーディングスモールRNA で標的メッセンジャーRNAの発現を調節している。現在、miRNAは人を含む哺乳類で2,500種類程度あることがわかっており、その塩基配列はだれでも自由にアクセスできる公共のデータベース（データベース名：miRBaseなど）に登録されている。miRNAは血液・尿にも安定して存在し疾患早期から発現変化すること、外因性にmiRNA-mimic/inhibitorを投与し生体内発現を変化させ得ること、ヒトとマウスなどの動物でほぼ同じ塩基配列であり動物実験の結果をヒトに応用させやすいことから、治療ターゲットとしての有用性が報告され、すでに癌や炎症疾患分野で臨床応用が検討されている。このことからAKIの診断バイオマーカーおよび遺伝子治療の標的として有用なmiRNAも存在するはずであるが未だ同定されておらず、本研究ではAKI腎臓で発現が変化する miRNA を網羅的に同定し、新規遺伝子治療法、バイオマーカー開発に応用することを目的にした。

2 研究方法

機序の異なる2種類のAKIモデルマウス（虚血再灌流モデル：IRI-AKIモデル、敗血症モデル：

リポポリサッカライド(LPS)-AKIモデル）を作成し、腎臓で発現変化するmiRNAをマイクロアレイ法による網羅的解析で同定した。同定したmiRNAをAKI患者（30例）の血清でqRT-PCR 法で測定し健常人と比較した。さらに人工合成したmiRNA-5100のmimicをNon-viralキャリア : polyethylenimine nanoparticle (PEI-NPs) と N/P ratio 6 で複合体

（miRNA-5100-mimic-PEI-NPs）を作成し、IRI-AKIマウスに尾静脈より単回投与で腎にデリバ

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リーし、miRNA-5100を腎臓で過剰発現させ、AKIの抑制効果を検討した。

3 研究成果

両モデルマウスの腎臓で共通して発現変化しているmiRNAを36種類選出した。そのうちヒトで発現報告のある17種類のmiRNAを両モデルともにqRT-PCRを行い発現変化を確かめた。両モデルで統計学的有意差を持って変化していたのは、6 種類の miRNA(miRNA-21a-5p, miRNA-29b-1-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p, miRNA-5100)であった。そのうち 5 種類 (miRNA-21a-5p, miRNA-29b-1-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3pは過去のAKIでの役割がある程度報告されているため、本研究では過去に報告のないmiRNA-5100について検証した。IRI-AKIマウスにmiR-5100-mimic-PEI-NPsをAKIを誘導する2日前に予防薬として尾静脈投与したところmiRNA-5100は腎臓で過剰発現され、組織学的、尿細管間質細胞障害マーカー(NGAL,KIM-1)などでAKIの抑制効果を認めた。miRNA-5100 の効果の機序を調べる目的での遺伝子マイクロアレイでIRI-AKIにおいてmiRNA-5100 を過剰発現させると、IRI＋無治療群と比較して、53種類の遺伝子が4倍以上、82種類のmRNAが4 倍以下に統計学的有意差をもって変化していた。それらの遺伝子のなかでmiRNA-5100の過剰発現は、アポトーシスシグナル伝達経路を含む29種類のmRNAと炎症シグナル伝達経路を含む10 種類のmRNAの発現を変化させAKIでアポトーシスと炎症を複数のパスウェイから抑制することで AKI 進展を抑制していることが明らかになった。さらに、別の実験系で miRNA-5100-mimic-PEI-NPsをAKIを誘導後1時間後に尾静脈から治療薬として投与したところ、miRNA-5100は腎臓で過剰発現され、AKIの改善効果を認めた。

またqRT-PCT法で測定したところAKI患者（30例）では、健常人(30例)においてmiRNA-5100 の血清での発現量が有意に低下(AKI 患者：0.11±0.07 vs 健常人；1.05±1.12, p<0.01)していた。

4 考察

本実験結果から、miRNA-5100はAKIの進展調節に関与しておりAKIの新規治療薬となる可能性は明らかになった。また血清miRNA-5100発現レベルはAKIのバイオマーカーとなる可能性がある。いくつかの以前の研究では、in vitroおよびin vivoでAKIのmiRNAを用いた治療薬としての可能性の報告があるが、miRNA-5100についての報告は本研究が初めてである。本研究では2つの異なるAKIモデルを用いて共通に変化するmiRNAをスクリーニングすることで、AKI、マウスのバックグラウンドおよび手術手技などの影響を軽減した。この研究では、in vivo で腎での miRNA-5100 を過剰発現させるために、miRNA-5100 を投与する際の非ウイルス性キャリアとして、ポリカチオンであるpolyethyleneimine-nanoparticles (PEI-NPs)を用いた。IRI-AKIマウスmiRNA 5100-mimic-PEI-NPs投与により、腎でmiRNA-5100は過剰発現され、腎尿細管の組織学的損傷と腎機能障害（BUN、serum creatinine、NGAL および KIM-1）を抑制した。その機序としてアポトーシスおよび炎症を複数のパスウェイで抑制することが明らかになった。またこれまでの過去の報告ではAKIを起こす前にmicroRNA-mimic/inhibitorを投与しAKIへの効果を検証していたが、本研究では AKI を起こす前、別実験で AKI を起こしたあとに miRNA 5100-mimic-PEI-NPs を投与し、いずれも AKI の改善効果を認めた。本結果から、miRNA

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5100-mimicはAKIの予防薬および治療薬として有効であることが明らかになった。

さらにまたAKI患者では、健常人においてmiRNA-5100の血清での発現量が有意に低下していたことから、血清miRNA-5100はAKIのバイオマーカーとなる可能性が示唆され、今後症例数を増やして検証する必要がある。

5 結論

miRNA-5100は急性腎障害の新規遺伝子治療法およびバイオマーカーとなる可能性がある。

論文審査の結果の要旨

本論文の骨子は急性腎障害（以下AKI）に関連するマイクロRNA（以下miRNA）を発見し、

その臨床的意義付けを行ったとするものである。申請者の臨床経験に基づいた探索を出発点とし、

AKI に関連する新規のmiRNAとして miR-5100を動物実験によって同定し、病態との関連を見出している。さらには今後治療への応用の可能性も示唆している。本論文は新規性・独創性がともに高く、学問的な意義も顕著である。構成に不自然さはなく、結論の裏付けとなるデータも概ね充分に揃っている。以上のことから、本学における学位論文として遜色ない内容と認める。但し、表現を改めた方が良いと考えられる箇所が散見されるため、これらを適切に改訂することで合格に相当するものと判定した。

最終試験の結果の要旨

本学位審査においては、最初に申請者から研究の背景及び目的について必要かつ十分な説明があった。本研究は自らの麻酔科などにおけるAKIの臨床経験に根ざしたものであり、目的を達するために他分野である腎臓内科の大学院に入学して研究を実施したとのことで、共感できる説明であった。本研究の遂行に用いられた方法は妥当であり、科学的根拠のもとに良く練られた上で実施されていた。得られた結果はAKIの早期診断のみならず、治療に役立つ可能性もあり、充分な新規性が認められた。これらの結果に基づく考察に関しても概ね妥当な内容であった。

発表後、審査員３名から多岐にわたる質疑がなされたが、申請者はそれぞれの内容を十分に理解した上で、全ての疑問点に対して適切かつ充分な回答がなされた。周辺領域を含めた申請者の知識及び科学的素養が充分であることは自明であり、申請者は博士の学位に相応しいものと判断した。

本研究は診断及び治療の両面で今後臨床応用される可能性を秘めており、その裏付けとなる知的財産権及び企業導出の面でも既に対応がなされているとのことであった。しかしながら申請者は浮き足立つことなく、慎重に歩みを進めている印象であり、その姿勢には好感が持てた。今後の展開が大いに期待される。

なお、学位論文提出後の動きとして、論文は投稿後第一希望の雑誌には断られたため、別の雑誌に再投稿を準備中とのことである。充分な内容を含んでいると考えられることから、適切な雑誌を選択し、早期に公表されることを期待する。