水生植物に見いだされた 新しい表層微生物作用 - J-Stage

お よ そ60兆 の 細 胞 か ら な る ヒ ト に は100〜1,000兆 も の 細 菌 が住んでいることが近年明らかとなり，動物と微生物の深い かかわりが注目されている^（1, 2）．一方，肥沃な土壌1グラム 中 に は1〜10億 程 度 の 細 菌 が 含 ま れ お り，植 物 と 微 生 物 と もやはり深いかかわりがある．植物根の周辺域いわゆる根圏 や内生の微生物が植物の成長などに重要な役割を果たすこと も古くから知られている．実に今から100年以上前の1908年 のサイエンス誌に Pure cultures for legume inoculation（マ メ科植物の純粋培養） という記事で細菌の影響の排除がい かに難しいかを論じている．このように土壌植物の根圏に関 する研究は長い歴史をもち根粒菌や菌根菌をはじめとする多 くの知見が蓄積されてきた．一方，水生植物と微生物とのか かわりに関する研究は歴史が浅くまだ未解明の点が多い．私 たちは，水生植物の一つであるウキクサからその成長を顕著 に促進する表層付着細菌を複数発見している．本稿では，こ れら水生植物成長促進細菌とその作用機構の特徴について解 説する．

はじめに

根圏（Rhizosphere）という概念は古く1904年にLo- renz Hiltnerによって「植物の根から影響を受ける土壌 領域」として提唱されている^（3）．根圏域には非根圏域

（土壌）に比べ格段に多くの細菌が生息しており，根圏 に生息する細菌の数は非根圏域と比較して40倍から200 倍にも及ぶと言われている^（4）．その主要因の一つとし て，根圏土壌には植物根からさまざまな代謝産物が浸潤 していることが挙げられる．根浸潤物はグルコースなど を含む糖類や各種アミノ酸，有機酸，脂肪酸，ビタミン や酵素など多岐にわたり，細菌はそれらの浸潤物を栄養 源として利用している^（5〜7）．なかでも炭素源に関して は，光合成により固定された全炭素量の5％から10％が 根から放出されるという報告^（8）や，根から放出される 炭素量が0.1 mg C/g soil以上にも及ぶという報告があ る^（9）．特に湿地帯で生育する水生植物では通気組織と呼 ばれる気体の通り道を発達させることで，低酸素状態で あっても根への酸素の輸送が行われ，それが根圏へ染み 出すことが知られている^（10）．もちろんこれらの機能や その影響の大きさは植物の種類および生育環境によって

【解説】

New Function of the Phytosphere Bacteria from Aquatic Plants Masaaki MORIKAWA, Masayuki SUGAWARA, Wakako SUZU- KI, Kyoko MIWA, *¹ 北海道大学大学院環境科学院，*² _JST-ALCA

水生植物に見いだされた  新しい表層微生物作用

森川正章 * ^{1 , 2} _{，菅原雅之} * ^{1 , 2} _{，鈴木和歌子} * ¹ _{，三輪京子} * ^{1 , 2}

【2011年農芸化学研究企画賞】

異なるが，根圏は非根圏領域よりも細菌の生育を促進す る環境であることは間違いない．一方で，菌類や細菌も 根圏において植物に対してさまざまな影響を与えること が知られている．その例として，土壌中に存在する不溶 化したリンの可溶化^（11）やシデロフォアの生産による鉄 のキレート^（12）などのミネラル吸収の介助，菌根形成の 活性化^（13），オーキシンやサイトカイニンといった植物 ホルモンの生産^{（14, 15）}による成長促進などがある．さら には，植物の成熟あるいはストレス応答ホルモンである エチレンの合成前駆体を細菌が分解することによってエ チレン生成を抑え植物の成長を維持促進するという手の 込んだ作用も報告されている^（16）．一方，植物に対する 重金属毒性の軽減^（17）や，細菌が生産する抗生物質など の作用により植物を病原性真菌から防御することも広く 知られている^{（18, 19）}．このように根圏において植物と細 菌は多元的に相互作用しながら共生関係を築いており，

現在も精力的に研究が行われている^（20）．

本 稿 で 対 象 と す る 水 生 植 物 は ア シ（ヨ シ）［学

名  ］などのように底泥に根を着

生し，葉や茎を水面より上に伸ばす「抽水植物」，スイ

レン科ヒツジグサ［学名  ］やオ

オオニバス［学名  ］のように底泥 に根を張り，葉を水面または水面近くに浮かべる「浮葉 植物」，アオウキクサ［学名  /

］やコウキクサ［学名  ］などの

「浮遊植物」，そしてキンギョモ［学名 

］やオオカナダモ［学名  ］のよ うに個体全体が水没して生育する「沈水植物」の4つの タイプに大別される．抽水植物は陸生植物と類似の形態 分化を有しているが，浮遊植物は根と茎と葉が明確に分 化しておらず，根にもクロロフィルがあり光合成器官と しても機能し，葉に見える部分には気孔はあるが維管束 構造をもたないため葉状体（frond）と呼ばれる．また，

葉状体も根と同様に水に接していることとミジンコウキ クサ［学名  ］のように葉状体のみで根 をもたないものもある．そこで，陸上植物で地下部を指 す根圏（rhizosphere）とこれに対比して地上部を意味 する葉圏（phyllosphere）という表現はウキクサではふ さわしくなく，根圏（rhizosphere）と葉状体圏（cormo- sphere）と呼ぶべきであろうというのが，ウキクサ研 究者での合意である．ただし，葉状体のうち大気と接し ている上面と水に接している下面で環境が大きく異なる ことも注意する必要がある．ちなみに，両者を合わせて 植物体圏（phytosphere）という．

ウキクサ初の成長促進根圏細菌

 P23によるクロロフィル増加作用 本細菌発見の経緯詳細については，本紙「化学と生 物」46巻10号，682‒688頁（2008）を参照していただき たいが，P23は北海道大学植物園のアオウキクサから単 離した表層細菌の一種で，フェノールを分解する能力と ともにウキクサ科植物の成長を促進する能力を有してい る^（21）．また，P23を無菌化したウキクサ表層に付着共 生させると1週間以上にわたって持続的にフェノールを 分解することができる（図1_）．この結果は，ウキクサ とP23は相利共生の関係にあることを示している．そこ で次に，このP23がウキクサ以外の植物にも作用するの かについて試験した．対象植物はチンゲンサイ［学 名   var.  ］，ハツカダイコン［学 名   L. cv.  ］，レ タ ス［学 名   L. cv. Great Lakes］ を 用 い た．植物の栽培は水耕栽培法により行い各培地^（22）を基 本として，10倍（1/10 H培地），100倍（1/100 H培地）

希釈したものも使用した．植物種子はあらかじめ，

0.05％次亜塩素酸ナトリウム＋0.02％ Triton X-100（界 面活性剤）水溶液で3〜5分間滅菌したあと，滅菌水中 で静置する作業を5回繰り返し表面洗浄した．1/10 H固 形培地上で3 〜 5葉まで発芽した植物体を1.5 LのHoa- gland培地（pH 6.0）を入れたプラントボックス（15 cm

×15 cm×10 cm; Hipack S-38,  エンテック製）に移植し た．また別途，一晩培養しておいたP23および対照区と して大腸菌DH5

α

を0.3 OD600となるように培地に懸濁し たものも調製した．それぞれ温度25°C，湿度70％，光 量5,000 lux,  長 日 条 件（16h明‒8h暗） に て1週 間 培 養 し，それぞれの細菌を根表面に付着させた．滅菌水で軽

0 50 100 150 200

Time （h）

Phenol remaining (%)

100 80 60 40 20 0

図1^■P23付着コウキクサによる持続的フェノール分解

40 ppmフェノールを含む新しいHoagland（H）培地入りのフラス コにP23付着コウキクサを5回移植した実験区（○）．一つのフラ スコ内でH培地にフェノールを終濃度40 ppmとなるよう5回追添 加しながら分解活性を測定した実験区（●）．前者は流水実環境を 模した実験である．後者では栄養分の枯渇と老廃物蓄積によって 活性が低下したものと思われる．無菌コウキクサがフェノールを 分解しないことは別途確認した．

0 50 100 150 200

Time （h）

Phenol remaining (%)

100 80 60 40 20 0

く洗浄した後にそれぞれの植物体を新しい培地に移植 し，さらに1週間栽培した．

その結果，P23のチンゲンサイおよびハツカダイコン に対する影響は観察されなかった．しかし，P23が付着 したレタス（以下，レタス／P23）では成長速度に顕著 な違いは見られなかったが，葉の緑色が明らかに濃く なっていた．さらにその違いは貧栄養条件（1/100 H培 地）において顕著であった（図2_{a）．これは，P23が栄} 養枯渇ストレスを軽減する作用を有することを示唆す る．実際に，植物体の第8葉からエタノール抽出したク

ロロフィル量を測定した結果，3個体の平均値として無 菌レタスでは0.70 mgクロロフィル／g湿重量であった のに対して，レタス／P23では0.93 mgクロロフィル／

1 g湿重量であり有意にクロロフィルが増加しているこ と が わ か っ た（図2b）．一 方，レ タ ス／DH5

α

で は 0.58 mgクロロフィル／g湿重量に減少しており葉の一 部が黄変していた．また，蛍光顕微鏡観察からはP23が 実際にレタスの根表面に付着してコロニーを形成してい ること，およびクロロプラストが増加していることが判 明した．

そこで再度，P23がコウキクサに対して成長促進とと もにクロロフィル量に影響を及ぼすのかについて検討し た．実験の方法は，レタスと同様にして行った．ただ し，表面洗浄コウキクサへの細菌付着は3日間で行い，

移植後のP23を付着させたコウキクサ（コウキクサ／

P23）および無菌コウキクサの栽培は2葉状体から開始 し10日後に葉状体数，植物体重量およびクロロフィル 量を測定した．その結果，コウキクサ／P23の葉状体数 は164枚，湿 重 量60.5 mg [ ＝5.75 mg],  乾 燥 重 量 3.34 mg［ ＝0.182 mg］であり，無菌コウキクサの葉 状体数は102枚，湿重量31.3 mg [ ＝15.4 mg],  乾燥重 量1.69 mg［ ＝0.848 mg］に対しておよそ2倍の成長 促進が確認できた（図3_a, b）．次に，それぞれの植物体 についてクロロフィル量を測定したところ，コウキク サ／P23では1.03 mgクロロフィル／g湿重量，無菌コウ キクサでは0.62 mgクロロフィル／g湿重量であり，や はりP23による顕著な増加が見られた（図3c）．以上の

結果から，  P23は単子葉植

物であるウキクサ科植物だけではなく，貧栄養環境下で は双子葉植物であるキク科植物レタスのクロロフィル量 を増加させる能力を有することが示された^（23）．クロロ フィル量増加の分子機構と植物成長促進との関係につい ては今後の検討課題である．

酵母マンナンによる水生植物の成長促進現象  P23の成長促進作用について，従来 知られているものを検討したところ，リン可溶化活性お よびシデロフォア生産性はポジティブであったが，エチ レン合成阻害酵素（ACC deaminase），オーキシン生産 性，窒素固定能についてはネガティブであった．ここ で，本稿での植物の栽培はすべてミネラル豊富なHoa- gland培地を用いた水耕栽培で行っているため，リン可 溶化活性およびシデロフォア生産性は植物の成長にあま り有効に作用するとは考えにくい．そこで，P23が生産

図2^■P23のレタスへの影響評価

a.  植物体の鳥瞰観察写真．A: 1/100 H培地で21日間栽培したも の．B:  細菌を懸濁した1/100 H培地にAを移植して7日間栽培し たもの．C:  新しい1/100 H培地にBを移植してさらに7日間栽培 したときの様子．Cにおいて，細菌非添加区（左）と比較して大 腸菌DH5α付着レタスは葉が黄色く，P23付着レタスの葉は濃緑色 になっていることが観察された．b. Cの植物体それぞれの第8葉 についてクロロフィル量を測定した結果．エラーバーは標準偏差

（ ＝10），* ＜0.05（対，細菌非添加区）．

するそのほかの成長促進因子を特定するために種々精製 法を試みた結果，培養上清中に生産される多糖類に顕著 なコウキクサ成長促進活性を見いだした．その構造の詳 細については現在解析中である．

一方，微生物が生産する細胞外多糖にはいろいろなも のがあるが，私たちは酵母エキスに含まれる酵母マンナ ンにコウキクサ成長促進活性があることを偶然発見した

（論文投稿中）．私たちの調べた限り，微生物多糖がエリ

シター活性を有すること以外に植物の成長を直接促進す るという報告例はない．その後，酵母細胞自身にもコウ キクサの成長を促進する作用を確認している．酵母マン ナンによるコウキクサ成長促進作用の最適濃度はおよそ 200 mg/Lであり，無菌ウキクサの成長速度を約1.5倍に 向上させた（図4_a）．また，クロロフィル量の増加も認 められた（図4b）．本実験で使用したパン酵母由来マン ナンは糖タンパク質のN結合型糖鎖であり，

α

-1,6ポリ マンノースを主鎖骨格，

α

-1,2マンノース，

α

-1,3マン ノース，あるいは

β

-1,4マンノースを側鎖にもつ^（24）．一 方，植物由来の直鎖

β

-1,4マンノース／グルコースヘテ ロポリマー（成分比8 : 5）であるコンニャクマンナン

（グルコマンナン）および

β

-1,4ポリマンノース主鎖に

α

-1,6ガラクトース側鎖をもつイナゴマメ由来のガラク トマンナンについて，同様に試験したところ成長促進活 性は認められなかった（図4a, b）．すなわち，

α

型のポ リマンノース構造がコウキクサ成長促進に重要であるこ とが示唆された．ただし，成長促進活性を有さなかった コンニャクマンナンに酵母マンナンを上回るクロロフィ ル量増加活性が見られたことや逆に成長促進活性を有す るマンノースにクロロフィル量増加活性が見られなかっ たことは興味深く，その作用機構の複雑さを示唆するも のである．

次に，単糖について活性を調べたところ驚いたことに マンノースとグルコースおよびフルクトースにも成長促 進活性があることがわかった．ただし，いずれもクロロ フィル量の増加は観察されなかった．一方，ガラクトー スやN-アセチルグルコサミンおよびスクロースなどに 活性は見られなかった．そこで，次に，酵母マンナンと マンノースを添加したコウキクサ栽培実験においてそれ ぞれの量が減少（植物体への取り込みあるいは分解）す るかについて経時変化を調べた．その結果，マンノース は植物の成長に伴って明らかに減少したが，酵母マンナ 図3^■無菌コウキクサとP23付着コウキクサの成長の比較

いずれも2葉状体から栽培を開始した．a. 7日後の鳥瞰観察，b. 10日後の植物体乾燥重量，c. 10日後のクロロフィル量．エラーバーは標準 偏差（ ＝3），* ＜0.05（対，無菌コウキクサ）．

図4^■各種糖のコウキクサへの影響評価

a.  各種マンナンおよび単糖のコウキクサ成長促進活性比較．YM 酵母マンナン，GluMグルコマンナン，GalMガラクトマンナン，

Manマンノース，Glcグルコース，Galガラクトース．b. 各種マン ナンおよび単糖のクロロフィル量への影響比較．エラーバーは標 準偏差（ ＝3）* ＜0.05（対，非添加区）．

ンはほとんど減少しないことが判明した（図5_{a）．さら} に，培地中の残存物について薄層クロマトグラフィに よって構造を調べたところ，マンノースの場合はスポッ トの発色強度が減少していることが確認された．一方，

酵母マンナンについてはスポットの発色強度は変化せ ず，また分解物（低分子量）のスポットも検出されな かった（図5b）．

以上のことから，単糖であるマンノースはコウキクサ が炭素源として代謝することによって成長促進をもたら すことが示唆された．これに対して，酵母マンナンは量 的および構造に変化が見られなかったことからコウキク サの表層にあると推定される糖鎖レセプターに結合して 成長を刺激する，いわゆるシグナル分子として作用する 可能性が示唆される．あるいは，酵母マンナンのコウキ

クサへの作用濃度が100〜200 mg/Lと高濃度であること から，植物体表層に皮膜を形成してミネラルの取り込み を介助しているのかもしれない．

今後の展望

本稿では，陸上植物に比べて根圏微生物に関する研究 が遅れている水生植物（特に，浮遊植物ウキクサ）に関 する最近の知見を紹介した． 属細菌は主 要な土壌細菌群の一つであり，これまでに，

 SE370は植物ホルモンであるジベレリンを生産 するとともに，有機酸生産によるリンの可溶化活性を有 し，キュウリ，チンゲンサイおよびシュンギクの成長を 約1.5倍促進することが報告されている^（25）．また，

 BIHB 723にもやはり主として リン可溶化活性によるとされるエンドウやトウモロコシ などの成長促進が報告されている^（26）．しかし，微生物 由来の細胞外多糖がここで示したようなクロロフィル量 を増加したり成長を促進するという報告例はほかにな く，  P23および酵母マンナンとコウキ クサは植物̶微生物相互作用解明の新しい切り口となる 可能性がある．また，酵母マンナンについてはいまのと ころウキクサ科植物以外では活性が認められていないこ とから，

α

-1,6マンナンによる成長促進作用は非維管束 植物に限定されるのかもしれない．一方，玉木秀幸博士

（産業技術総合研究所）と田中靖宏博士（山梨大学）の 研究によると，水生植物からは未培養細菌が取得できる 割合が高く，新門レベルの新規細菌の単離にも成功した ことが報告されている^（27）．実際，抽水性水生植物から もP23よりもさらに活性の高い新たな成長促進細菌も見 つかってきている^（28）．このような，水生植物と表層細 菌との良好な共生関係を開拓し，その微生物群を再構成 することによって遺伝子組換えによらない植物の増産技 術が可能になると期待される．ウキクサは食糧と拮抗し ないリグニン含量の低い次世代バイオ燃料の原料，石油 代替化成品原料としてのデンプン原料，あるいは大豆と 同等のタンパク質含量から家畜飼料としての利用が欧米 で注目されている^（29）．2009年に米国エネルギー省のバ イオフューエル開発・環境浄化対策用植物としてウキク サが取り上げられ，その後第一回国際ウキクサ会議が 2011年に中国科学院，第二回会議が2013年に米国ラト ガース大学で開催され，2015年7月には第三回会議 Duckweed 2015が京都大学で開催される予定である．

これを契機にわが国においてもウキクサに関する基礎研 究および応用技術開発が盛んになることを期待したい．

図5^■a. コウキクサの生育に伴う培地中の酵母マンナンおよび マンノースの量的変化および b. TLC解析結果

それぞれ100 mg/Lの酵母マンナン（●），マンノース（○）を添 加したH培地において，コウキクサ20葉体を用いて栽培した．

M1マンノース，M2マンノビオース，YM酵母マンナン．レーン 1, 2, 3は独立した実験をそれぞれ三連で行った結果．

謝辞：本稿で紹介した研究は第8回農芸化学研究企画賞（2011年）の助 成を受けて行ったものであり，ここに御礼申し上げます．

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プロフィル

森川 正章（Masaaki MORIKAWA）

＜略歴＞1983年大阪大学工学部発酵工学 科卒業／1985年同大学大学院工学研究科 発酵工学専攻博士前期課程修了／1994年 工学博士／1991年大阪大学助手，1995年 同助教授／2001年文部科学省長期在外研 究員（ハーバード大学医学部R. Kolter研 究室）／2004年より北海道大学大学院地球 環境科学研究院教授＜研究テーマと抱負＞

環境微生物を対象とした未知生物機能の発 見と応用，スーパーポジティブシンキング をモットーとしています（いわゆるおめで たい人）＜趣味＞機内映画で密かに感泣し，

日常をリセットすること

菅原 雅之（Masayuki SUGAWARA）

＜略歴＞2001年石巻専修大学理工学部基 礎理学科卒業／2007年東北大学大学院生 命科学研究科博士後期課程修了（生命科学 博士）／同年ミネソタ大学博士研究員／

2012年北海道大学大学院地球環境科学研 究院博士研究員／2014年東北大学大学院 生命科学研究科助教＜研究テーマと抱負＞

植物微生物間の相互作用に興味があり，現 在はダイズ根圏における根粒菌の共生およ び競合戦略について研究しています＜趣 味＞最近マラソンを始めました

鈴木 和歌子（Wakako SUZUKI）

＜略歴＞2011年北海道大学工学部応用理 工系学科卒業／2013年北海道大学大学院 環境科学院生物圏科学専攻修士課程修了

三輪 京子（Kyoko MIWA）

＜略歴＞2002年東京大学農学部生命化学 専修卒業／2007年同大学大学院農学生命 科学研究科応用生命工学専攻修了，博士

（農学）．日本学術振興会特別研究員を経 て，2009年10月より北海道大学創成研究 機構特任助教／2014年北海道大学大学院 地球環境科学研究院准教授＜研究テーマと 抱負＞植物の無機栄養の感知・輸送・利用 の分子機構の解明，および不良環境ストレ ス耐性植物の作出＜趣味＞鍾乳洞めぐり Copyright © 2014 公益社団法人日本農芸化学会