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In vivo抗腫瘍活性の高い
Th/CTL誘導法の開発
高知大学・医・免疫
CTL
CTL
CTL
CTL
腫瘍組織
樹状細胞
CTL
CTL
CTL
CTL
腫瘍細胞を殺す、細胞傷害性T細胞（CTL）の大半は、 腫瘍の存在に気づかず、血管内を通り過ぎている！腫瘍抗原の提示を考えると、それは当然！
従来のペプチド免疫療法の問題点
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外
因性抗原の提示経路
樹状細胞（DC) B 細胞 ”血管内皮細胞？”内
因性抗原の提示経路
がん細胞 ウイルス感染細胞CTL
Th
キラーT細胞
ヘルパーT細胞
腫瘍が縮小する場には、
CD4 T（Th）が浸潤
DCが提示した抗原を認識し、Thが IFN-γを分泌 →CTLがケモカイン依存性に腫瘍内へ浸潤 腫瘍細胞を 貪食したEC Th樹状細胞
DC
死んだ
腫瘍細胞
CTL CTL Th①
②
Th 腫瘍内に浸潤したTh細胞我々が見つけたこと
5
腫瘍血管ECには、HLA class II 分子の発現がみられる in the EL4 tumor
anti-von Willebrand factor anti-I-Ad merged, DAPI
anti-CD11c anti-I-Ad merged, DAPI for nuclei
EC
Th CTL 固形腫瘍 Th 骨髄由来 DC 骨髄キメラ (MHC class II- 欠損マウス 正常マウス) キメラ 1 キメラ 2 血管内皮細胞 : MHC-II + -樹状細胞 (DC) 骨髄由来 : - + キメラ 1 キメラ 2
7 腫瘍内へ浸潤した DO11.10 の数 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 CBF1 KO KO→F1 F1→KO 宿主のマウス 平均細胞数／１ ０ 視 野 EL4 E.G7-OVA n=4 n=3 n=3 n=3 Spleen 内に侵入したDO11.10の数 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 CBF1 KO KO→CBF1 CBF1→KO 宿主マウス 平均細胞数／1 0 視 野 DC：MHC-II- 血管内皮細胞：MHC-II -↓ ↓ Thの腫瘍内浸潤 には、 血管内皮細胞・ 樹状細胞 による抗原提示が 両方とも必要 １切片２０視野 ｘ１０切片に 浸潤したTh細胞 の総数
EL4：腫瘍特異抗原が出ていない腫瘍 EG7:腫瘍特異抗原を出している腫瘍
腫瘍特異的Th細胞が腫瘍内に浸潤した結果、
腫瘍血管内皮細胞
が
CTLを呼び込む走化性因子 I-TAC
9 EL4 EG7 0 50 100 150 200 250 300 4 6 8 10 12 14 16 18 20 tu mor s iz e (mm 2)
days after tumor inoculation
PBS 0 50 100 150 200 250 300 4 6 8 10 12 14 16 18 20 tu mo rs iz e (mm 2)
days after tumor inoculation
OVAI 0 50 100 150 200 250 300 4 6 8 10 12 14 16 18 20 tu m o rs iz e (m m 2)
days after tumor inoculation
OVAI+ 0 50 100 150 200 250 300 4 6 8 10 12 14 16 18 20 tu m o rs iz e (m m 2)
days after tumor inoculation
OVAI+OVAII 0 100 200 300 400 500 600 700 4 6 8 10 12 14 16 18 20 tu mo rs iz e (mm 2)
days after tumor inoculation
PBS 0 100 200 300 400 500 600 700 4 6 8 10 12 14 16 18 20 tu mo rs iz e (mm 2)
days after tumor inoculation
OVAI 0 100 200 300 400 500 600 700 4 6 8 10 12 14 16 18 20 tu m o rs iz e (m m 2)
days after tumor inoculation
OVAI+ 0 100 200 300 400 500 600 700 4 6 8 10 12 14 16 18 20 tu m o rs iz e (m m 2)
days after tumor inoculation
OVAI+OVAII in vivo ペプチド免疫 ↓ 腫瘍接種
PBS
CTL
CTL＋
第３者抗原 特異的Th
CTL＋
腫瘍抗原 特異的Th
腫瘍接種
EG7: 腫瘍抗原 としてOVA を発現する EL4 tumor CTL; OVA-I Th: OVA-II あるいは peptideヘルパーT細胞誘導型ワクチンの開発
ー MHC class II 分子結合性ペプチドのデザイン ー
抗原提示細胞の膜会合性peptidaseに対する消化耐
性を付与する末端修飾をペプチドに導入
→生きた抗原提示細胞へのペプチド結合能を測定
HLA-DRB1*04:05結合性ペプチド自動予測法の開発
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抗原提示細胞
樹状細胞 B細胞 血管内皮細胞？MHC class II
MHC class II 分子に対する定量的競合結合実験 非標識ペプチドが速やかに分解され、競合結合実験は困難 ↓ そこで、測定したいペプチドの末端に、消化耐性を付与する修飾 を加えた PE-streptavidin Biotin-標識ペプチドCompetitive binding assay
at pH6.0
at pH7.4
‐1 ‐0.5 0 0.5 1 -6.00 -5.50 -5.00 -4.50 -4.00 lo g (y /1 ‐y) log peptide concenteration (M) TR175 ‐1 ‐0.5 0 0.5 1 -6.00 -5.50 -5.00 -4.50 -4.00 lo g (y /1 ‐y) log peptide concenteration (M) T175 ‐1 ‐0.5 0 0.5 1 -6.00 -5.50 -5.00 -4.50 -4.00 lo g (y /1 ‐y) log peptide concenteration (M) TR175 ‐1 ‐0.5 0 0.5 1 -6.00 -5.50 -5.00 -4.50 -4.00 lo g (y /1 ‐y) log peptide concenteration (M) T175・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・ no staining PE-SA alone
100M competitor 50 M 25 M 12.5M 6.25 M 3.13 M 1.57 M 末端修飾ペプチド 未修飾ペプチド
13 ‐1.5 ‐1 ‐0.5 0 0.5 -6.00 -5.50 -5.00 -4.50 -4.00 TR175 0 0.5 1 1.5 2 -6.00 -5.50 -5.00 -4.50 -4.00 HS39 ‐1.5 ‐1 ‐0.5 0 0.5 -6.00 -5.50 -5.00 -4.50 -4.00 M1082 ‐1 ‐0.5 0 0.5 1 -6.00 -5.50 -5.00 -4.50 -4.00 M119 ‐0.4 ‐0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 -6.00 -5.50 -5.00 -4.50 -4.00 M1044 0 0.2 0.4 0.6 0.8 -6.00 -5.50 -5.00 -4.50 -4.00 De60 任意のアミノ酸配列の ペプチドについて、 HLA-DRB1*04:05 への結合競合活性を log IC50 値 として定量測定できる ようになった ↓ HLA-DRB1*04:05 結合性ペプチドの 自動予測法を開発 NIH IEDB の予測サイト を大きく上回る予想能 を達成！ Peptide 1 Peptide 2 Peptide 3 Peptide 4 Peptide 5
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 5 0.5 0.05 0 CD6 9 + am o n g K J1. 26 + CD4 + c e lls (% ) peptide concentration (μM) PbOVIIbPβ POVIIPβ OVII Wc alone PBS foot pad immunization ↓ Lymph node cells を回収 ↓ CD69+ DO11.10 cells を解析
末端修飾をした MHC class II 結合性ペプチドを用いた、
in vivo Th cell 誘導実験
末端修飾1 末端修飾2 末端修飾なし アジュバントのみ15
MHC class II 結合性ペプチドを用いて、in vivo Th 誘導をしたい
MPLA (a TLR-4 ligand)-Liposome にペプチドを封入 ↓
リンパ節の抗原提示細胞に集中して届けられないか？
１． OVA (I-Ad 結合性)のモデル抗原系で、
in vivo Th 誘導活性を比較した
tOVII : 末端修飾なしのOVA epitope peptide PtOVII : 末端保護（Protected-）ありのtOVII
２． 自然な腫瘍抗原ペプチドの実験系
WT1 腫瘍抗原由来のペプチドを同定し マウスを免疫した
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0.0 0.1 1.0 10.0 100.0 PtOVII in lipo
PtOVII with lipo
PtOVII
PBS in vivo : PtOVII in/with lipo
in vitro : tOVII 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0.0 0.1 1.0 10.0 100.0 tOVII in lipo
tOVII with lipo
tOVII
PBS
in vivo : tOVII in/with lipo in vitro : tOVII Pr olif er at ion (cpm)
in vivo imm : tOVII in/w lipo. in vitro : tOVII
in vivo imm : PtOVII in/w lipo. in vitro : tOVII PBS tOVII tOVII w/ lipo. tOVII in lipo. PBS PtOVII PtOVII w/ lipo. PtOVII in lipo. 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0.0 0.1 1.0 10.0 100.0 PtOVII in lipo
PtOVII with lipo
PtOVII
PBS in vivo : PtOVII in/with lipo
in vitro : PtOVII 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 tOVII in lipo
tOVII with lipo
tOVII
PBS
in vivo : tOVII in/with lipo in vitro : PtOVII Pr olif er at ion (cpm)
Efficient induction of Th cells by using an end‐protected PtOVII peptide
in vivo imm : tOVII in/w lipo. in vitro : PtOVII
in vivo imm : PtOVII in/w lipo. in vitro : PtOVII PBS tOVII tOVII w/ lipo. tOVII in lipo. PBS PtOVII PtOVII w/ lipo. PtOVII in lipo.
17 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0.0 0.1 1.0 10.0 100.0 pr olif er at ion (cp m ) concentration of peptide (M) Wh‐1.1 Wh‐1.2 PBS.1 PBS.2 a. Wh‐1 peptide 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0.0 0.1 1.0 10.0 100.0 pr olif er at ion (cp m ) concentration of peptide (M) Wh‐2.1 Wh‐2.2 PBS.1 PBS.2 b. Wh‐2 peptide 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0.0 0.1 1.0 10.0 100.0 pr olif er at ion (cp m ) concentration of peptide (M) Wh‐3.1 Wh‐3.2 PBS.1 PBS.2 c. Wh‐3 peptide
Induction of Th cells by liposome‐encapsulated WT1 peptides
In vivo immunization 1 2 3 In vitro proliferation C57BL/6 mice s.c. in foot pads新技術の特徴・従来技術との比較
• CTLのみならず、腫瘍特異的Thを誘導することにより、
血管内から腫瘍組織へとT細胞を積極的に動員し、高
い抗腫瘍活性を引き出す免疫法を開発した。
• HLA class II 分子のペプチド結合特性を解析するた
め、ペプチドに抗原提示細胞の膜会合性ペプチダー
ゼに対する消化耐性を付与する修飾法を考案し、ペ
プチド結合能の定量測定を簡便にできるようにした。
• 消化耐性を付与する末端修飾を加えたペプチドを用
いて、in vivo におけるTh誘導効率を数百倍に高めた。
• MPLA liposomeにHLA結合性ペプチドを包むことに
より、in vivo T細胞誘導活性を高めた。
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想定される用途
• 任意の悪性腫瘍に対して、
HLA class I および、HLA class II結合性の腫瘍
抗原ペプチドをそれぞれ同定して、高い抗腫瘍活
性をもつ免疫療法を開発することが可能。
• Thが認識するHLA class II 結合性ペプチドを予測・
同定し、腫瘍免疫のみならず、アレルギーや自己免
疫疾患の標的抗原を同定することができる。
実用化に向けた課題
• 任意の抗原タンパク質について、CTL、Thが
認識するHLA結合性ペプチドを同定する技術
まで開発済み。今後、より高いT細胞誘導効
率を実現するため、liposome製剤のデザイン
を至適化し、免疫する全個体でT細胞が誘導
できるよう、工夫が必要。
• In vivoで誘導した腫瘍抗原特異的T細胞の体
内での存続状況や活性化の程度をモニター
する方法の開発が必要。これは、世界でも共
通の懸案となっている。
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企業への期待
• 世界で腫瘍腫ごとに免疫チェックポイント阻害
抗体製剤の導入が進んでいる。しかし、治療
に応答しない症例では、エフェクターとなるT
細胞が誘導されていないことが大きな課題と
なっている。それを補完すべく、腫瘍抗原特異
的T細胞を誘導する技術の開発を進めたい。
• Liposomeを含め、DDSの技術を持ち、臨床
試験に積極的な企業との共同研究が理想的。
• ペプチドワクチンを開発中の企業には、我々
のペプチド解析技術がお役に立つと思う。
本技術に関する知的財産権
①
• 発明の名称：ヘルパーT細胞誘導性ポリペプチドの改変
• 国際公開
：WO/2013/089252
• 出願人
：高知大学
• 発明者
：宇高 恵子
②
• 発明の名称：癌の治療剤
• 特許番号
：特許第5239041号(2013.4.12)
• 米国特許
：No.9,045,556(June 2,2015)
• 出願人
：阪大微生物病研究会、
日本電気株式会社、高知大学
• 発明者
：石橋 正英、宇高 恵子
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